玉米作为我国乃至全世界种植面积最广的粮食作物和饲用作物,需求量逐年上升。然而,近百年来,由于人类活动的频繁增加,致使全球气候变化加剧,淡水资源短缺等问题日益明显,全世界范围内干旱地区面积逐渐扩大。因此,为进一步提高玉米产量、保障粮食安全,提高玉米应对干旱的能力,挖掘玉米干旱相关基因、鉴定玉米抗旱种质资源、解析其遗传与分子机制等,对玉米抗旱性的遗传改良及分子设Biomedical science计育种具有重要意义。研究表明,植物中2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine protein phosphatase 2Cs,PP2C)A亚类成员通过介导脱落酸(abscisic acid,ABA)信号进而调控植物生长发育和胁迫应答等过程。目前,植物中大多数PP2C成员的功能仍然未知。本研究发现一个玉米B亚类PP2C成员ZmPP2C26负调控玉米耐旱性,通过利用RT-q PCR、亚细胞定位、互作蛋白验证、体外磷酸化等分子手段和实验技术初步解析其调控植物耐旱性的分子机制。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR克隆PP2C26基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)发现,以耐旱玉米自交系81565和87-1和干旱敏感型自交系DAN340和200B的c DNA为模板,均可扩增出两条DNA条带。测序后进行序列比对发现,两条序列高度同源且仅在N端存在较小差异,证实该基因在转录过程中发生可变剪接产生两个转录本,并命名为ZmPP2C26L和ZmPP2C26S,且4个自交系中的序列无差异。序列分析发现ZmPP2C26L第一个外显子比ZmPP2C26S多213 bp,其剪接位点为5′-CC……CG-3′,属于非典型的AFE型可变剪接。2.亚细胞定位结果显示,ZmPP2C26L定位于叶绿体和细胞核,而ZmPP2C26S定位于细胞核和细胞质,由此推测,它们的功能可能存在差异。体外磷酸酶活性测定结果显示,ZmPP2C26S的蛋白磷酸酶活性显著高于ZmPP2C26L。3.ZmPP2C26与ZmPYLs成员不互作,但与ZmMAPK3和ZmMAPK7互作。首先,为明确氨ZmPP2C26是否参与ABA信号通路,对其与玉米13个ZmPYL进行互作分析。结果表明,ZmPP2C26L和ZmPP2C26S与ZmPYLs成员均不互作。氨基酸序列分析发现,ZmPP2C26L比ZmPP2C26S多71个氨基酸,而该区域含有一个高度保守的MAPK互作基序(MAPK interaction motif,KIM)。酵母双杂交、Bi FC及GSTpull down实验证明,ZmPP2C26L与ZmMAPK3和ZmMAPK7互作,ZmPP2C26S与ZmMAPK3互作。体外磷酸化实验结果表明,证明ZmPP2C26L可去磷酸化ZmMAPK3和ZmMAPK7,ZmPP2C26S可去磷酸化ZmMAPK3,但ZmMAPK3和ZmMAPK7不能磷酸化ZmPP2C26L和ZmPP2C26S。4.实时荧光定量PCR分析结果显示,ZmPP2C26的表达受干旱胁迫诱导。经PEG-6000溶液模拟干旱处理后,ZmPP2C26L及ZmPP2C26在耐旱自交系81565和87-1中较未处理对照显著下调表达,而在干旱敏感自交系DAN340和200B中较未处理对照显著上调表达。对ZmPPSTM2457作用2C26基因启动子活性分析发现,其起始密码子(ATG)上游215 bp为该启动子的核心区域。此外,干旱胁迫显著抑制ZmPP2C26启动子活性。对ZmMAPK3和ZmMAPK7在干旱胁迫下的表达模式分析发现,这两个基因亦响应干旱胁迫,其表达量受干旱胁迫显著上调。5.ZmPP2C26负调控耐旱性。为进一步研究ZmPP2C26基因的功能,本研究分别将ZmPP2C26L和ZmPP2C26S在拟南芥和水稻中进行异源表达。无论在拟南芥和水稻中,转基因株系均对干旱胁迫较未转基因对照更敏感,且转ZmPP2C26S株系较转ZmPP2C26L株系对干旱胁迫更敏感。在干旱胁迫条件下,转基因株系的根系生长被抑制。玉米中Mu转座子插入突变体zmpp2c26较阴性对照W22有更强的耐旱性,干旱胁迫后zmpp2c26突变体的根长、根干重显著高于W22,存活率显著高于W22。6.磷酸化蛋白质组学分析结果显示,ZmPP2C26可能参与植物的光合作用。分别对转基因水稻及玉米突变体Zmpp2c26进行BYL719说明书磷酸化蛋白质组分析发现,水稻中ZmPP2C26L影响光合作用中直接富集的蛋白质磷酸化水平,玉米突变体Zmpp2c26中涉及光合作用的相关蛋白质的磷酸化水平受到影响,且ZmMAPK3的磷酸化水平增强。转ZmPP2C26L株系的光合速率和叶绿素含量显著低于转ZmPP2C26S株系和未转基因对照,Zmpp2c26突变体的光合速率和叶绿素含量显著高于W22。综上所述,本研究鉴定了一个2C型蛋白磷酸酶基因ZmPP2C26,由于可变剪接产生两个转录本,且两个转录本协同作用,通过去磷酸化修饰ZmMAPK3和ZmMAPK7使其激酶活性降低从而负调控植物耐旱性并影响植物光合作用。