研究背景炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(UlLGK-974供应商cerative colitis,UC)、克罗恩病(Crohn’s disease,CD)、未定型炎症性肠病(IBD unclassified,IBDU)三种类型。近年来,我国儿童IBD的患者数量逐渐增加,已成为临床上消化道常见疾病之一,其病因可能与遗传易感人群、环境、感染、免疫功能、精神心理、饮食过敏等相关。对于IBD的发病机制研究一直是消化系统疾病研究的热点与难点。目前的发病机制研究主要是围绕着免疫细胞展开。巨噬细胞是肠道免疫稳态的关键看门人,机体受外界抗原的刺激,激活了巨噬细胞启动免疫应答异常反应,分泌炎症因子促进肠道炎症的发生。而IBD炎症的浸润,肠上皮黏膜屏障功能缺失是其重要的病理改变特征之一。肠上皮黏medical education膜屏障主要是通过肠上皮细胞和细胞间的连接构成。而紧密连接蛋白、粘附连接和桥粒共同组成了细胞连接。紧密连接蛋白主要是由ZO、occludin、claudin蛋白组成,起着直接限制细胞旁通透性的作用。而粘附连接中最重要的成分是E-cadherin蛋白,多项研究表明IBD患者炎症上皮中E-cadherin蛋白的表达下调。目前研究多数是通过检测紧密连接蛋白、粘附蛋白水平和跨膜电阻值来评估肠上皮黏膜屏障功能。研究目的本实验拟探讨高表达WNT2b成纤维细胞激活巨噬细胞产生炎症因子CXCL12,破坏肠黏膜屏障功能,导致肠黏膜损伤,进而通过WNT/β-catenin信号通路促进IBD发生的机制,从而为IBD的治疗寻找新的靶点。研究方法(1)对IBD进行单细胞测序及通路分析。(2)从IBD患者的结肠炎及正常部位采集标本,用HE染色和组织病理学评分评估炎症,采用组织免疫荧光法巨噬细胞标记物CD11b和CXCL12的共定位。(3)实验组DMEM培养基中添加WNT/β-catenin通路的激动剂SKL2001,对照组DMEM培养基,使用qPCR、ELISA检测CXCL12表达情况。(4)使用 Western Blot 检测了 β-catenin、GSK3 β、P-GSK3 β 的表达水平。(5)通过体外细胞共培养及条件培养,构建成纤维细胞对Caco-2细胞的作用模型。实验组为加入20%成纤维细胞条件培养基或与WNT2B高表达成纤维细胞共培养,对照组为不含条件培养基或与野生型成纤维细胞共培养,通过跨膜电阻和荧光黄渗透率的测定,评估Caco-2细胞屏障通透性的变化。(6)与WNT2B高表达肠道成纤维细胞共培养后,使用免疫荧光法检测Caco-2细胞β-catenin入核情况。(7)使用Western blot法检测Z0-1、E-Cadherin等紧密连接蛋白表达情况。(8)采用DSS(葡聚糖硫酸钠)对C57小鼠进行类BD肠炎造模,实验组使用Salinomycin(5 mg/kg,腹腔注射),对照组为对应溶剂生理盐水,分别对小鼠进行处理,评价该抑制剂对肠炎的治疗作用。研究结果(1)巨噬细胞在IBD患者的结肠炎组织中富集。(2)巨噬细胞标记物CD11b和CXCL12具有共定位情况,巨噬细胞可分泌CXCL12。(3)SMRTX1133作用KL2001是WNT/β-catenin通路的激动剂,可促进结肠炎中巨噬细胞的浸润和CXCL12的分泌,从而加重肠道炎症。(4)当WNT2B过表达时,GSK3 β磷酸化增强,说明了 WNT/β-catenin通路的激活。(5)与对照组相比,过表达WNT2B基因可致成纤维细胞分泌WNT2b蛋白显著增加,并促进Caco-2细胞β-catenin入核(P值<0.01),紧密连接蛋白表达下降。(6)Caco-2细胞中敲低FZD4表达可逆转这一作用,β-catenin入核减少,紧密连接蛋白表达上调。(7)加入20%成纤维细胞条件培养基或与WNT2B高表达成纤维细胞共培养组,跨膜电阻和荧光黄渗透率值明显降低,说明Caco-2细胞屏障通透性增大。(8)与对照组相比,过表达WNT2B组,ZO-1、E-Cadherin等紧密连接蛋白水平表达增强。(9)构建小鼠类IBD肠炎模型,HE及炎症评分均提示小鼠肠道有明显炎症浸润。(10)Salinomycin可明显减轻对DSS小鼠肠道炎症,并使肠黏膜紧密连接蛋白表达增多。结论高表达WNT2B激活巨噬细胞促进CXCL12的表达和分泌,激活WNT/β-catenin信号通路,破坏肠黏膜屏障功能,从而可能导致IBD炎症的发生发展,为IBD的治疗寻找新的靶点具有重要的现实意义。