急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一种以肾功能急速下降为特征,具有高发病率和致死率的综合征,如不及时干预可严重威胁人类及小动物的健康。顺铂(Cisplatin,CDDP)是广谱抗癌药物,其肾毒性是诱导AKI的常见因素之一。由于AKI发病机制复杂且目前尚未发现令人满意的干预手段,因此寻找能有效预防和治疗AKI的安全药物仍是医学及兽医学上需迫切解决的问题。维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)可被活性维生素D及维生素D类似物激活,在机体内发挥抗氧化抗炎等生物作用。前期研究发现,CDDP诱导的AKI小鼠体内VDR水平显著下降,提示激活体内VDR可能是防治AKI的有效手段,但具体分子机制尚不可知。基于此,本研究进行了如下试验:(1)首先,将40只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为两组,对照组(C组,腹腔注射生理盐水)和模型组(CDDP组,腹腔注射20mg/kg CDDP),CDDP处理72 h后获得AKI小鼠模型,通过转录组学及代谢组学联合分析,筛选出关键信号通路。(2)随后,将60只7周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为四组,分别为C组、VDR组(腹腔注射0.2μg/kg帕立骨化醇,每天一次)、VDR+CDDP组(帕立骨化醇处理的第6天,腹腔注射CDDP)、CDDP组。CDDP处理72 h后观察动物状态,称量体重,将动物进行安乐死并采集血液和组织样本,应用生化试剂盒、ELISA试剂盒检测小鼠肾脏功能;通过苏木精&伊红(Hematoxylin&Eosin,H&E)染色、透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)、抗氧化试剂盒、TUNEL染色、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)等方法,检www.selleck.cn/products/smoothened-agonist-sag-hcl测小鼠肾脏组织病理学变化、氧化应激水平、线粒体动力学及能量代谢相关基因、炎症细胞因子、细胞凋亡、细胞铁死亡、相关通路基因表达及共定位情况。(3)最后,将30只6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为两组,VDR+CDDP组和关键信号通路干预组(Znpp组,帕立骨化醇处理前五天开始腹腔注射5mg/kg的Znpp,每天一次),在CDDP处理72 h后收集样本进行相关检测,确定VDR肾保护作用的具体分子机制。体外使用HK2细胞系进行机制的验证。主要研究结果如下:(1)转录组学代谢学联合分析结果表明,CDDP诱导的AKI小鼠肾脏组织差异转录基因和差异代谢物共同富集到72个Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路中,其中显著差异的转录基因和代谢物共同富集到4个KEGG通路中,即代谢途径、HIF-1信号途径、谷胱甘肽代谢途径和丁酸代谢途径。(2)小鼠在注射CDDP后,体重显著下降,且小鼠表现精神极度沉郁、无食欲、眯眼蜷缩状。肾脏功能检测结果显示,CDDP组小鼠体内血液尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(Serum creatinine,Scr)、肾损伤分子1(Kidney injury molecule 1,Kim-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,Nagl)均显著升高,提示小鼠肾损伤模型成功建立。HK2细胞在CDDP处理后,细胞活力明显下降,说明CDDP诱导HK2细胞损伤。VDR显著降低AKI小鼠体内BUN、SCr、Kim-1、Nagl水平,提高CDDP暴露的HK2细胞活力,说明VDR可提高肾脏功能。(3)小鼠肾脏组织病理学检测结果显示,CDDP组小鼠肾脏组织中肾小管上皮细胞明显脱落,组织间隙可见大量炎性细胞浸润,而VDR+CDDP组小鼠肾脏组织中炎性细胞减少,肾小管上皮细胞脱落较少或呈脱落状。应用WB检测组织内炎性细胞因子的表达,发现CDDP组小鼠肾脏组织和HK2细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和核转录因子kappa B(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)的蛋白表达水平显著升高,而VDR+CDDP组的肾脏及HK2细胞中炎性细胞因子蛋白水平较CDDP组显著下降,说明VDR可改善CDDP诱导的肾脏炎症损伤。(4)对小鼠肾脏组织超微结构观察发现,VDR干预后,CDDP诱导的AKI小鼠肾脏线粒体嵴断裂明显减少。应用q RT-PCR和WB方法进一步检测线粒体动力学相关基因的表达,发现VDR可降低CDDP诱导的AKI小鼠肾脏中线粒体动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)和线粒体分裂蛋白1(Mitochondrial fission 1 protein,fis1)的m RNA和蛋白表达,并显著上调视神经萎缩因子(Optic atrophy 1,Opa1)、线粒体融合蛋白1(Mitochondrial fusion protein 1,Mfn1)、Mfn2的表达水平。此外,CDDP暴露的HK2细胞中线粒体活性与Opa1水平呈正相关,与Drp1和fis1水平呈负相关,说明CDDP诱导肾脏线粒体过度分裂,进而导致线粒体损伤。而VDR+CDDP组小鼠肾脏及HK2细胞中Drp1、fis1水平显著低于CDDP组,Opa1、Mfn1、Mfn2的水平显著升高,说明VDR通过维持肾脏线粒体动力学平衡来减轻CDDP诱导的线粒体损伤。(5)对小鼠肾脏组织能量代谢水平检测发现VDR明显提高CDDP诱导的AKI小鼠肾脏组织中Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase和Ca~(2+)-ATPase的活性,并显著上调CDDP暴露的小鼠肾脏组织中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、丙酮酸脱氢酶复合体X(Pyruvate dehydrogenase complex component X,PDHX)的m RNA及蛋白表达水平。体外试验结果显示VDR预处理CDDP暴露HK2细胞中LDH、PK、PDHX的蛋白水平升高,说明VDR在一定程度上消除了CDDP对肾脏能量代谢水平的负面影响。(6)应用氧化应激试剂盒检测发现,VDR显著提高AKI小鼠肾脏组织中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)水平,增加超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2,SOD2)的荧光强度,并抑制过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的累积。此外,通过荧光染色发现,VDR明显减弱了CDDP处理的小鼠肾脏和HK2细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的积聚。这些结果说明VDR可提高肾脏抗氧化水平,并抑制氧化物的累积,进而缓解CDDP诱导的肾脏氧化损伤。此外,应用试剂盒、IF、荧光探针及WB方法检测小鼠肾脏及HK2细胞中亚铁离子(Ferrous ion,Fe~(2+))含量和谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)表达水平,发现VDR明显抑制CDDP诱导的小鼠肾脏和HK2细胞中Fe~(2+)的蓄积,并提高GPX4的表达,结合GSH及MDA检测结果可知,VDR改善了CDDP诱导的肾脏细胞铁死亡。(7)TUNEL染色结果显示,VDR明显减少了CDDP诱导的小鼠肾脏组织细胞凋亡的数量。应用q RT-PCR、IHC和WB方法检测细胞凋亡相关基因的表达,发现VDR显著上调AKI小鼠肾脏组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达水平,抑制细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase 3)、PD0325901Caspase9和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的表达。AO/EB染色发现VDR减少CDDP暴露的HK2细胞的凋亡,细胞内凋亡相关蛋白表达结果与体内试验一致,说明VDR通过减少肾脏细胞凋亡在一定程度上改善CDDP诱导的AKI。(8)转录组学及代谢组学KEGG富集联合分析,发现HIF-1信号途径在AKI小鼠肾脏组织中显著富集。应用q RT-PCR检测HIF-1信号通路关键基因HIF-1α和HO-1水平,发现CDDP诱导的AKI小鼠肾脏组织中HIF-1α和HO-1的m RNA表达水平均显著高于C组,但低于VDR+CDDP组。应用IF方法检测HIF-1α和HO-1在肾脏组织和HK2细胞中共定位情况,发现CDDP组和VDR+CDDP组小鼠肾脏组织中HIF-1α均明显进入细胞核,但CDDP组HO-1在胞质中的表达明显少于VDR+CDDP组。体外试验结果与体内相似,即CDDP暴露的HK2细胞中HIF-1α没有或极少进入细胞核,并且CDDP组细胞中HIF-1α和HO-1荧光强度均高于C组,弱于VDR+CDDP组。这些结果说明,HIF-1α和HO-1可能分别作为缺氧感应因子和应激蛋白在肾脏受到CDDP刺激后高表达,而VDR可促进HIF-1α进入细胞核内调控HO-1进而发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用。此外,使用HIF-1α/HO-1信号通路抑制剂锌原卟啉(Protoporphyrin IX zinc,Znpp)预处理VDR+CDDP组小鼠和HK2细胞,发现VDR的肾脏保护作用减弱,进一步说明VDR通过调控HIF-1α/HO-1信号通路减轻CDDP诱导的肾脏损伤。综上所述,VDR可改善CDDP诱导的肾脏组织结构损伤和功能障碍,具体分子机制为VDR上调HIF-1α/HO-1信号通路来维持线粒体动力学平衡,提高肾脏能量代谢水平,阻止线粒体过度分裂诱导大量ROS累积,进而减轻肾脏氧化损伤、炎症、细胞凋亡和细medical photography胞铁死亡,最终改善CDDP诱导的AKI。本研究从VDR调控HIF-1α/HO-1信号通路的角度探讨其对CDDP诱导AKI的保护机制,为人类及小动物AKI的防治提供新的思路和试验数据,并在一定程度上丰富了VDR的生物学作用。