猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrheavirus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻、脱水为临床症状的高度接触性肠道传染病,患病仔猪死亡率高达80%～100%。猪流行性腹泻缺乏特效治疗药物,并且由于新变异株的出现,导致防疫失败现象不断增多,进一步加剧了其防控难度和防控成本,严重威胁着我国养猪业的健康发展。长远来看,从遗传本质上提高猪对PEDV的抗性具有治本的功效,而筛选鉴定PEDV抗性基因及相关分子标记是开展猪流行性腹泻抗病育种的重要前提。三方基序蛋白家族(Tripartite motif-containing proteins,TRIMs)在宿主细胞与病毒复制过程中发挥重要调控作用,可直接或间接调控病毒的复制。课题组前期对PEDV感染仔猪空肠组织进行转录组测序,发现TRIMs家族成员TRIM8基因的表达水平显著上调,推测其可能为PEDV感染复制的重要调控基因。为探究TRIM8在PEDV感染过程中的功能及作用机制,本研究以猪小肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell line,IPEC-J2)为研究模型,首先检测 TRIM8基因在PEDV感染不同时间点的表达变化,揭示TRIM8表达与PEDV感染的作用关系;构建TRIM8基因过表达细胞,进一步探究TRIM8基因高表达对PEDV感染的调控作用;之后利用转录组测序技术探究TRIM8基因过表达对PEDV感染相关基因表达及信号通路的影响;利用免疫共沉淀技术检测TRIM8蛋白与PEDVN蛋白之间的互作关系,并通过泛素化修饰实验揭示TRIM8介导PEDVN蛋白在宿主细胞内降解的分子机制。本研究主要结果如下:1.TRIM8抑制PEDV在宿主细胞中的复制通过qRT-PCR和Western blot检测PEDV感染不同时间点TRIM8基因表达情况,结果显示,病毒侵染12h、24h、48h后,TRIM8基因表达水平显著上调(P<0.05),且在24h时TRIM8基因表达水平最高(P<0.01)。Western blot实验进一步验证TRIM8蛋白在不同侵染时间点的表达水平,与其mRNA表达变化趋势一致。为探究TRIM8的功能,本试验构建了TRIM8基因过表达IPEC-J2细胞。PEDV感染TRIM8过表达细胞及对照细胞,通过qRT-PCR、TCID50和Western blot等实验检测病毒感染情况,结果表明TRIM8过表达细胞中PEDV M基因拷贝数及病毒滴度显著低于对照组(P<点击此处0.01),并且PEDVN蛋白表达水平也显著降低(P<0.01)。HBsAg hepatitis B surface antigen2.PEDV感染TRIM8过表达细胞相关基因及信号通路分析将PEDV感染组、PEDV感染TRIM8过表达组及病毒未感染的对照细胞进行转录组测序,测序数据主成分分析表明,3组实验样品显著分为3簇。PEDV感染组与对照组基因差异表达分析共筛选到2153个差异表达的基因,其中上调表达基因有1195个,下调表达基因958个;PEDV感染TRIM8过表达组与PEDV感染组间共筛选到153个差异表达的基因,其中上调表达基因126个,下调表达基因27个。对上述2组所筛选的差异表达基因取交集,共筛选到19个表达趋势相反基因,其中筛选到趋化因子家族和锌指蛋白家族成员,例如,CXCL2基因在上皮细胞中趋化因子的表达对细胞所介导的组织炎症反应发挥重要作用;ZNF527和ZNF658基因则可能参与抑制病毒在宿主细胞中的复制。对PEDV感染组与PEDV感染TRIM8过表达组间所筛选到的差异表达基因进行功能注释和富集分析,结果发现,显著富集的Go terms主要包括防御反应和免疫应答等;通过信号通路分析发现,显著富集的KEGG主要包括RIG-Ⅰ样受体信号通路和NOD样受体信号通路等。结合生物学功能,从差异表达基因中选取HSPA6、ISG15、IFI6、MX1等8个基因进行定量验证,qRT-PCR结果与RNA-seq结果表达趋势一致。3.TRIM8靶向调控PEDVN蛋白泛素化降解利用Co-IP互作技术揭示猪TRIM8蛋白与PEDV N蛋白间的互作关系,Western blot结果显示PEDVN蛋白表达丰度呈现TRIM8剂量依赖性降低;使用此网站放线菌酮(CHX)抑制蛋白合成的过程,发现当PEDVN蛋白合成途径受到抑制后,PEDV N蛋白降解速度显著加快,揭示TRIM8可以促进PEDV N蛋白的降解过程;使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂Leupeptin分别处理HEK293T细胞,MG132处理后PEDVN蛋白表达水平显著升高,而添加Leupeptin无显著影响,表明TRIM8可通过蛋白酶体系统介导PEDVN的降解而非溶酶体。为了探讨TRIM8作为E3泛素连接酶是否介导PEDVN蛋白泛素化,本试验构建了野生型Ub、突变型K48和K63载体,与TRIM8表达载体及PEDV N蛋白标签载体共转染,结果显示野生型Ub和突变型K48组PEDV N蛋白泛素化水平变化一致,表明TRIM8通过K48多聚泛素化降解PEDVN蛋白。综上所述,本研究发现TRIM8可抑制PEDV在宿主细胞中的复制,并且TRIM8过表达激活RIG-Ⅰ样受体等信号通路;此外,TRIM8靶向调控PEDV N蛋白且N蛋白表达丰度呈TRIM8剂量依赖性降低,机制分析表明,TRIM8通过泛素蛋白酶体系统靶向PEDV N蛋白K48泛素化位点介导N蛋白的降解。本研究揭示PEDV感染过程中TRIM8的调控功能及作用机制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识,并为TRIM8作为PEDV抗性相关重要侯选基因应用于猪流行性腹泻抗病育种提供了理论依据。