研究背景及目的:线粒体被称为细胞的“发电站”,细胞内高达90%的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphatase,ATP)通过有氧氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)在线粒体中产生,线粒体在OXPHOS中发挥重要作用。线粒体在正常组织稳态和代谢、肿瘤的发生发展、神经退行性变、免疫稳态和传染病等多种生理和病理过程中发挥重要作用。多方面因素可调节线粒体的功能,其中线粒体稳态对线粒体的健康和功能至关重要,融合、裂变、线粒体自噬和线粒体生物发生等系列机制参与维持线粒体的稳态。由于线粒体稳态和线粒体功能的重要性,此领域备受广大学者关注。深入研究线粒体功能和稳态的调节机制,对恶性肿瘤等疾病的干预具有重要临床意义。肿瘤细胞维持较高的增殖率和抵抗细胞死亡信号与其代谢表型有关。肿瘤细胞可呈现不同的代谢表型,包括能量代谢中葡萄糖利用的增加、以及糖酵解和谷氨酰胺分解等关键代谢途径的通量改变。肺癌细胞等肿瘤细胞的糖酵解能量代谢有利于肿瘤细胞的永久增殖,并满足对非必需氨基酸、脂肪酸和核苷酸的高需求,但不能有效地产生更多的ATP。研究表明,非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)具有代谢异质性。最近对NSCLC患者的研究强调了三羧酸循环和氧化代谢在肺癌中的重要性,但其调控机制尚未完全阐明。T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子4(T cell immunoglobulin-and mucin domain-containing molecule-4,TIM-4)是一种磷脂酰丝氨酸受体,选择性高表达于抗原提呈细胞。最近报道,TIM-4在iNKT细胞、B1细胞也有表达,并可异位表达于多种肿瘤细胞,提示其生物学功能的多样性。实验室前期研究发现,TIM-4在多种肿瘤组织中表达增加,并且能够促进肺癌的进展,TIM-4糖基化修饰可促进肺癌转移,但TIM-4促进肺癌生长的分子机制并未阐释清楚。最近,基于肿瘤相关巨噬细胞的文献揭示了 TIM-4的最新功能,发现TIM-4能够增强线粒体功能、调节OXPHOS水平以及线粒体的稳态,但分子机制仍需要深入研究。然而,TIM-4对肿瘤细胞代谢及线粒体功能的影响迄今尚无相关文献报道。本文旨在研究TIM-4促进肺癌细胞生长的新机制,明确TIM-4对肺癌细胞代谢及线粒体功能的调节作用,解析TIM-4调节肺癌细胞线粒体功能和稳态的具体分子机制,为NIpatasertib采购SCLC等恶性肿瘤的精准干预提供新靶点。研究方法及结果:1.TIM-4增强肺癌细胞的OXPHOS水平为探究TIM-4促进肺癌细胞生长的具体机制,我们构建了 TIM-4的慢病毒过表达载体,利用慢病毒分别感染A549和H23肺癌细胞系,通过筛选建立稳定过表达TIM-4的肺癌细胞系。利用稳定过表达TIM-4的A549细胞和对照细胞进行RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq),通过数据分析,发现TIM-4过表达的A549细胞中OXPHOS信号通路显著富集。检测A549和H23细胞的OXPHOS水平,发现TIM-4显著增强肺癌细胞系的耗氧速率、ATP水平。2.TIM-4增强肺癌细胞的线粒体活性由于线粒体是OXPHOS发生的场所,我们进一步检测了与线粒体健康相关的各项指标。结果显示,TIM-4过表达的肺癌细胞系A549和H23细胞中线粒体膜电位明显提高、线粒体去极化水平降低、健康线粒体比例上调、线粒体ROS水平降低。营养剥夺的情况下,TIM-4过表达的肺癌细胞中线粒体的应激能力也明显增强。另外,我们分析了数据库中人肺癌组织标本,结果发现,与TIM-4Low肺癌患者相比,TIM-4Hi肺癌患者OXPHOS相关基因明显富集且上调。综上所述,TIM-4增强了肺癌细胞的OXPHOS和线粒体功能。3.TIM-4增强肺癌细胞线粒体OXPHOS依赖于OPA1为研究TIM-4调控线粒体OXPHOS和线粒体功能的分子机制,首先对A549和H23细胞的线粒体形态进行观察。免疫荧光结果显示,与对照组细胞相比,TIM-4过表达的肺癌细胞线粒体更长、更聚集。以上结果提示,TIM-4可能影响线粒体的稳态。文献显示,线粒体的融合与裂变对于线粒体形态的影响具有决定性的作用,也对线粒体动力学平衡的维持至关重要。线粒体融合相关蛋白以及线粒体分裂相关蛋白共同调控线粒体的融合和分裂。我们检测了 A549和H23细胞线粒体融合、分裂相关蛋白的表达,结果显示,TIM-4明显提高L-OPA1的蛋白水平,对其他分子Drp1、MFN2、MFF的蛋白水平没有明显影响,提示TIInfected tooth socketsM-4可能通过维持L-OPA1的水平调节线粒体动力学平衡。随后,我们利用OPA1的抑制剂MYLS22和小干扰RNA处理肺癌细胞,结果发现,抑制或干扰OPA1后,TIM-4增强肺癌细胞OXPHOS和促进肺癌细胞生长的能力被明显削弱。综上,TIM-4通过OPA1调节线粒体稳态和肺癌细胞的生长。4.TIM-4通过ANXA2/PI3K/AKT信号轴调节线粒体的功能为探究TIM-4调节线粒体动力学平衡的分子机制,我们对A549细胞的RNA-seq数据进行信号通路富集分析,结果显示,PI3K/AKT信号通路富集最为明显。随后,我们利用PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002以及AKT的小干扰处理细胞,结果发现,TIM-4过表达导致的OXPHOS增强、线粒体融合以及促进肺癌细胞生长的作用明显削弱,提示TIM-4通过PI3K/AKT信号通路调节肺癌细胞线粒体的功能。为进一步探究TIM-4激活PI3K/AKT信号的机制,我们利用免疫共沉淀联合质谱进行分析,发现膜联蛋A2(Annexin A2,ANXA2)是TIM-4潜在的相互作用蛋白。免疫共沉淀证实,TIM-4与ANXA2存在相互作用。文献显示,ANXA2可激活AKT信号通路。我们对ANXA2进行干扰,发现TIM-4对肺癌细胞线粒体功能以及增殖的促进作用受到抑制,TIM-4过表达促进PI3K/AKT活化以及L-OPA1水平的上调均受抑制。以上结果表明,TIM-4对肺癌细胞线粒体稳态及功能的调节作用依赖于ANXA2/PI3K/AKT/OPA1 信号轴的活化。5.TIM-4在体内通过增强线粒体功能促进肺癌的进展为了进一步明确TIM-4对肺癌的促进作用依赖于其对线粒体功能的调节,我们利用TIM-4稳定过表达的肺癌细胞系A549细胞(LV-TIM4)及对照组细胞(LV-CON)在BALB/c裸鼠体内进行皮下成瘤,并利用OPA1的抑制剂MYLS22进行处理。结果显示,与对照组相比,LV-TIM-4组肿瘤生长更快、肿瘤体积更大,MYLS22处理后LV-CON和LV-TIM-4组小鼠肿瘤的生长均受到抑制,且两组无明显差异。Western blotting检测了 OPA1、p-AKTS473的水平,结果与体外实验一致,TIM-4过表达组肿瘤组织中L-OPA1和p-AKTS473的水平明显高于对照组,MYLS22治疗组降低,且TIM-4上调L-OPA1和AKT磷酸化的作用被抑制。结果提示,TIM-4在体内通过调节线粒体稳态促进肺癌的生长,而且TIM-4在体内同样依赖PI3K/AKT/OPA1信号轴促进肺癌的生长。研究结论及意义:本研究首次报道了 TIM-4对肺癌细胞Ferrostatin-1配制代谢的调节作用,发现TIM-4增强细胞OXPHOS水平,通过与ANXA2相互作用增强AKT的活化,从而维持L-OPA1的蛋白水平,进而调节线粒体的动力学平衡,表明TIM-4具有调节肺癌细胞线粒体稳态的作用。本研究揭示了 TIM-4调控肺癌细胞代谢的新型生物学功能及作用机制,为TIM-4作为抗肿瘤干预靶点提供了新的理论依据,并为以代谢为靶点的肺癌治疗提供新思路。