实验目的:免疫疗法是一种很有前景的癌症治疗方法。但是肿瘤细胞免疫原性不足,以及肿瘤免疫抑制微环境的作用,影响其治疗效果。在本研究中,通过合成ROS刺激响应性聚合物(聚丙烯酸酯衍生物),包载细胞免疫原性诱导剂(紫杉醇)和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂(1-甲基-D,L-色氨酸),构建前药纳米递送系统。该前药纳米递送系统,经静脉给药可在体循环中稳定存在,利用实体瘤的高渗透和阻滞效应(EPR效应),可实现肿瘤部位被动聚集,降低药物脱靶引起的副反应。利用载体的ROS刺激响应和酯酶敏感特性,在肿瘤细胞内形成“正反馈循环”(肿瘤细胞内ROS刺激PTX释放,而释放的PTX进一步刺激细胞产生ROS)促进药物释放,提高靶部位药物浓度。在提高体内免疫反应的同时调节肿瘤免疫抑制微环境,抑制肿瘤免疫逃逸,增强免疫治疗疗效。进而协同化疗和免疫治疗,多靶点杀伤肿瘤细胞。实验方法:1.纳米载体的制备:该载体以聚乙二醇(PEG)为亲水性片段,酯酶敏感的1-MT酯和ROS敏感的过草酸酯为疏水性片段共同组成,最后把各个片段聚合在聚丙烯酸酯为骨架的聚合物上。聚乙二醇(PEG)构成纳米制剂的亲水外壳,1-MT酯和过草酸酯构成疏水内核,而亲脂性药物如PTX可以通过疏水作用和“π-π”共轭作用在水溶液中与载体材料自组装形成前药纳米递送系统。2.纳米载体理化性质的评价:(1)通过研究不同浓度的纳米材料对红细胞的破坏能力,评价载体材料的生物相容性和静脉给药的安全性。(2)使用马尔文纳米粒径-zeta电位测定仪,透射电子显微镜,观察前药纳米载体的粒径,zeta电位,形貌特征。(3)使用高效液相色谱法研究前药纳米载体的包封率,载药量。(4)通过薄膜透析法,研究在酯酶和H_2O_2条件下前药纳米载体中PTX和1-MT的释放行为,并用高效液相色谱仪测定其浓度。3.体外细胞实验:(1)使用纳米载体包载荧光染料尼罗红(NR),分别用流式细胞术和共聚焦显微镜研究不同时间段细胞对前药纳米载体的摄取结果。(2)在使用不同配方的制剂处理细胞后采用MTT法测定不同制剂的细胞毒性结果。(3)使用PI染色观察前药纳米载体对细胞周期的阻selleckchem MC3滞情况,Annexin V-PI染色观察细胞凋亡情况,最后用流式细胞仪分析结果。(4)用含有10μg/m L DCFH-DA的培养基孵育细胞后0.5 h后,用流式细胞术评价不同制剂作用后的细胞ROS(reactive oxygen species)的含量。此网站(5)在使用不同制剂处理细胞后,收集细胞上清用高效液相色谱法测定细胞环境中Kyn含量。(6)收集不同制剂处理的细胞用4%多聚甲醛处理,并在4℃下用CRT(calreticulin)或HMGB1(High Mobility Group Protein 1)抗体染色过夜,用荧光标记的二抗孵育后,用流式细胞术分析。同时,按照生产商的说明收集培养基,使用ELISA试剂盒进行ATP分析,与上述指标一起,评价纳米载体在体外诱导细胞ICD(immunogenic cell death)的能力。4.体内实验:(1)用纳米制剂包载荧光染料Di R作用于荷瘤小鼠后,研究不同时间载体在体内不同部位的分布情况。(2)分析不同制剂抑瘤实验结果。(3)使用CRT、IDO-1和Ki67的抗体处理肿瘤组织,后用二抗孵育染色,观察组织病理学变化,评价纳米载体在体内诱导肿瘤细胞ICD的能力。(4)制备小鼠肿瘤细胞悬液用多抗体染色,流式细胞仪进行分析,观察肿瘤内DC_S,肿瘤相关巨噬细胞,CD8~+T细胞,Treg _S的表达情况,评价纳米载体激活体内免疫反应能力。结果:该前药纳米递送系统,可降低肿瘤细胞Kyn的浓度,升高细胞内CRT,HMGB1,ATP的表达。表现出高效的细胞免疫原性死亡诱导作用和IDO-1抑制作用。在体内该前药纳米递送系统,主要在肝脏,脾脏和肿瘤中分布,同时表达出明显的肿瘤靶向作用。可以明显减少实体瘤内细胞增殖信号ki67的表达,抑制肿瘤重量,体积的增长。提高肿瘤中CRT浓度,诱导ICD效应。可提高CD11c~+,CD80~+和CD86~+(DC_S),,CD8(CD8~+T cells)信号的表达,并抑制F4/80~+和CD206~+(M_2TAM_S),和CD4~+,CD25~+,Fox P3~+(Tregs)信号的表达。促进效应T细胞在肿瘤组织中的浸润,增强抗肿瘤免疫反应。抑制调节性T细胞(Treg _S)和M_2型肿瘤相关巨噬细胞(M_2Tbiohybrid structuresAM_S)的浸润,调节肿瘤免疫抑制微环境。纳米载体联合PTX和1-MT应用在4T1荷瘤小鼠中,可明显提高药物的靶向能力,与其他制剂组比有更优秀的肿瘤抑制效果,并减少肺转移的发生。同时该纳米递送系统可通过响应ROS刺激释放PTX,PTX诱导细胞内ROS生成,继而进一步促进PTX释放形成正反馈环路,通过肿瘤细胞内ROS刺激响应增强药物在靶部位的释放,提高药物在靶部位浓度。结论:利用ROS刺激响应性纳米载体共递送细胞免疫原性诱导剂(PTX)和IDO-1抑制剂(1-MT),可有效提高治疗药物的靶向能力,降低脱靶引起的副作用。在增强肿瘤细胞免疫原性的同时,改变肿瘤免疫抑制微环境,激活机体抗肿瘤免疫反应,协同化疗和免疫治疗,为肿瘤提供了很有前景的治疗方案。