脑梗死严重威胁着人类健康,但有效的治疗措施非常有限。因此,在脑梗死发病机制的基础上寻求新的治疗方法对减轻脑梗死后的神经损伤具有十分重要的意义。程序性细胞死亡主要包括凋亡、程序性坏死等,广泛参与多种疾病的发病过程,也是导致脑梗死后神经损伤的重要因素。多年来细胞凋亡信号通路在脑梗死的发病机制已得到了广泛研究,但程序性坏死通路的分子机制尚不清楚。经典的程序性坏死通路是由肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor alpha,TNF-α)等触发激活,受体相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)和受体相互作用蛋白3(Receptor-interacting protein 3,RIP3)相互磷酸化,形成“坏死体”,进一步磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),最终导致细胞死亡。RIP1,RIP3和MLKL通常用作程序性坏死的分子标志物。最近的一项研究发现,RIP1和RIP3缺失可通过减少程序性坏死以减轻小鼠缺血再灌注后的脑损伤,但具体分子机制尚未阐明。一项小鼠心肌缺血再灌注模型的研究发现,RIP3介导非典型程序性坏死信号通路中钙调蛋白依赖性激酶II(Calmodulin-dependent kinase II,CaMKⅡ)的活化,最终导致程序性坏死和细胞凋亡。但尚不清楚RIP3/CaMKⅡ途径是否参与脑梗死模型中的细胞死亡。我们团队前期研究发现,富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)和线粒体钙单向转运蛋白(Mitochondrial calcium uniporter,MCU)的表达在大鼠脑梗死模型中上调,伴随着线粒体损伤、钙内流增加、活性氧产生和细胞凋亡增加等。另一项研究发现在软骨细胞中的CaMKⅡ/Pyk2信号级联途径可以促进软骨细胞增殖和基质合成。这些研究提示,RIP3/CaMKⅡ/Pyk2信号通路可能在脑梗死细胞死亡的发生发展过程中具有重要作用,但其分子调控机制及与程序性坏死的关系有待进一步探讨。我们在第一部分,采用RIP3敲除小鼠探讨了RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路是否参与小鼠脑梗死模型的程序性细胞死亡,并对其分子调控机制进行了研究;在第二部分,培养原代皮层神经元建立体外神经元缺氧模型,在此模型中验证RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路对缺氧后原代神经元的影响;在第三部分,收集急性脑梗死住院患者及健康对照人群血浆,比较大面积脑梗死组、非大面积脑梗死组和对照组三组人群血浆中程序性坏死标志物RIP1、RIP3和MLKL的表达水平差异,为急性脑梗死的诊断和预后评估寻找合适的外周血标志物。第一部分RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路在小鼠d MCAO模型中参与程序性细胞死亡的作用机制研究目的:明确RIP3敲除对小鼠脑梗死模型的脑梗死体积和运动功能障碍以及神经元超微结构影响;分析RIP3敲除对线粒体膜电位、钙水平和活性氧生成,以及程序性细胞死亡的影响;探讨RIP3/CaMKⅡ/Pyk2级联反应是否参与小鼠脑梗死模型的程序性坏死和细胞凋亡。方法:对野生型(wild type,WT)和RIP3敲除小鼠进行大脑中动脉远端闭塞(d MCAO)处理,比较两组小鼠脑梗死体积、运动功能障碍的差异;采用电子显微镜观察两组小鼠脑梗死后神经元超微结构损伤;采用Western blot检测脑梗死组织中RIP3、CaMKⅡ、Pyk2及其他经典程序性坏死标志蛋白和细胞凋亡蛋白的表达;采用流式细胞术分析两组小鼠脑梗死组织线粒体膜电位、钙内流和活性氧的变化。结果:RIP3敲除减少小鼠脑梗死模型的脑梗死体积,减轻运动功能障碍,减轻脑梗死后神经元超微结构损伤;RIP3敲除抑制脑梗死后线粒体膜电位降低,细胞钙内流增加和活性氧生成;RIP3敲除抑制CaMKⅡ/Pyk2级联反应活化,减少小鼠脑梗死模型程序性坏死和细胞凋亡。结论:1.RIP3敲除小鼠脑梗死模型的脑梗死体积、运动功能障碍和神经元超微结构损伤较野生型显著减少。RIP3敲除可抑制脑梗死后线粒体膜电位降低,细胞内钙内流增加和活性氧产生。2.RIP3敲除可抑制CaMKⅡ/Pyk2通路的活化,减少程序性坏死和凋亡蛋白的表达,最终减少神经元程序性坏死和凋亡。第二部分RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路在原代皮层神经元氧糖剥夺/复氧模型中的表达变化目的:体外培养原代皮层神经元,在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型中验证RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路在程序性细胞死亡中的作用。方法:在WT和RIP3敲除胎鼠中提取原代皮层神经元并进行培养,采用激光共聚焦显微镜观察微管相关蛋白2(MAP2)染色阳性细胞以鉴定原代皮层神经元;采用CCK-8法检测两组原代皮层神经元OGD/R后的细胞活力;Western blot检测两组原代皮层神经元中RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路信号蛋白的表达水平;免疫荧光染色比较两组原代皮层神经元OGD/R后钙内流水平。结果:在OGD/R模型中,RIP3敲除胎鼠原代皮层神经元细胞活力显著高于WT组胎鼠原代皮层神经元;RIP3敲除抑制了原代皮层神经元OGD/R后CaMKⅡ、Pyk2的表达;RIP3敲除抑制了原代皮层神经元OGD/R后钙内流的增加。结论:本部分在细胞水平上验证了RIP3/CaMKⅡ/Pyk2通路对程序性细胞死亡的影响。在原代皮层神经元OGD/R模型中,RIP3敲除可通过抑制CaMKⅡ/Pyk2信号通路以及抑制钙内流,提高原代皮层神经元的细胞活力,减少程序性细胞死亡。第三部分程序性坏死标志物在急性脑梗死患者血浆中的水平检测目的:探讨急性脑梗死患者血浆中程序性坏死的标志蛋白RIP1、RIP3和MLKL的水平与急性脑梗死的关系,为急性脑梗死的诊断和预后评估寻找合适的外周血标记物。方法:收集2020年3月至2023年6月于河北医科大学第二医院神经内科住院治疗的确诊为急性前循环脑梗死患者120例的临床资料和血浆样本,包括急性大面积脑梗死患者80例和急性非大面积脑梗死患者40例。同时收集我院体检中心健康成年人40例作为健康对照组。收集患者的临床资料包括:性别,年龄,身体质量指数(BPexidartinib生产商ody Mass Index,BMI),既往基础疾病,吸烟及饮酒史,卒中家族史,入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分等。所有入组患者于入院当天抽取肘静脉血2ml制备血浆标本。利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆RIP1、RIP3和MLKL的水平。所有研究对象均自愿同意加入本次研究。结果:与健康对照组相比LY294002作用,急性大面积脑梗死组和急性非大面积脑梗死组患者血浆中RIP1、RIP3、MLKL的水平均显著升高,且急性大面积脑梗死组显著高于急性非大面积脑梗死组。但是血浆RIP1、RIP3、MLKL水平与NIHSS评分之间均无显著相关。结论:1.与健康对照组相比,急性大面积脑梗死组、急性非大面积脑梗死组患者血浆程序性坏死标志物poorly absorbed antibiotics水平显著升高。2.急性脑梗死患者血浆程序性坏死标志物水平与急性脑梗死症状严重程度之间无显著相关。