研究背景肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是经典的运动神经元疾病之一,其特征是脑干和脊髓中的运动神经元进行性退化及死亡。到目前为止,ALS中运动神经元死亡的细胞和分子机制还不明确。针对ALS也没有有效的治疗方案。许多ALS相关蛋白,如SOD1、TDP-43、FUS和C9ORF72,都被报道与线粒体功能紊乱相关。从体外细胞、疾病动物模型以及ALS病人中收集的证据也表明:线粒体功能障碍是ALS的核心诱因之一。并且,在ALS病人和ALS动物模型中,普遍存在线粒体氧化呼吸链功能异常和ATP减少的现象。而这一现象的潜在机制也有待进一步研究。细胞表面增强蛋白1(REEP1)是另一种运动神经元疾病遗传性痉挛性截瘫(HSP)最主要的致病基因之一。它是REEP蛋白家族中的一员,主要参与内质网形态的调节,同时还定位于线粒体。目前为止,REEP家族成员与其他运动神经元疾病是否存在相互关联还不清楚。另有研究发现,由REEP1突变引发的HSP会造成线粒体功能异常,而线粒体功能异常和ALS密切相关。本研究意在阐明REEP1selleck与ALS的关联,更多以及REEP1定位于线粒体上的功能。研究目的1.探究ALS病人和ALS小鼠模型G93A小鼠中REEP家族蛋白的表达水平变化。2.研究增加REEP1蛋白表达对G93A小鼠存活和运动功能损伤的影响。3.研究增加REEP1蛋白表达对G93A小鼠运动神经元死亡和神经炎症的作用。4.阐明REEP1缺失对线粒体分布和功能的影响。5.探究REEP1调节线粒体功能的机制。6.研究REEP1是否能够通过调节线粒体功能保护神经元。研究方法1.探究ALS病人和ALS小鼠模型G93A小鼠中REEP家族蛋白的表达水平变化用Western blot和免疫组化的方法检测年龄匹配的对照和ALS病人脊髓样品,以及相同年龄的野生型和G93A小鼠脊髓中REEP家族蛋白的表达水平。2.研究REEP1过表达对G93A小鼠脊髓神经变性的影响通过立体定位注射的方式,在G93A小鼠脊髓L1段注射AAV1-hREEP1-Flag或AAV1-GFP病毒。利用动物行为学测试,研究小鼠运动功能的变化。同时,采用电生理和肌肉解剖方法,探究小鼠下肢肌肉功能。再利用免疫荧光染色技术检测神经肌肉接头数量、神经炎症水平以及小鼠脊髓中运动神经元死亡情况。3.探究REEP1缺失对线粒体分布和功能的影响采用CRISPR/Cas9的方法,分别在Lenti-X293T和SH-SY5Y细胞中敲除REEP1基因。分析线粒体分布情况。检测线粒体膜电位和ATP水平。再利用非变性电泳和Western blot相结合的方法,研究线粒体复合物的组装。并对细胞中线粒体复合物Ⅳ(CIV)的活力进行检测。最终实现对线粒体功能和分布的分析。4.REEP1如何调控线粒体功能通过定量质谱和免疫共沉淀技术的结合,筛选REEP1的相互作用蛋白。鉴定REEP1与线粒体CIV亚基NDUFA4相互作用的结构域。在两种REEP1KO的细胞株中分别重新过表达野生型REEP1和缺失NDUFA4结构域的突变型REEP1Δ101-110。利用免疫荧光染色、活细胞线粒体膜电势测定、ATP检测、非变性电泳和线粒体CIV活力测定等方法,研究野生型REEP1与突变REEP1对线粒体功能的影响。5.REEP1与NDUFA4蛋白水平之间的关系用Western blot的方法,检测ALS病人脊髓、ALS小鼠模型脊髓以及REEP1KO细胞株中NDUFA4的蛋白质水平。再通过实时荧光定量PCR分析REEP1KO细胞中NDUFA4在mRNA水平上的变化。6.REEP1缺失对神经元形态和存活能力的影响将SH-SY5Y细胞株分化得到成熟的神经元。通过细胞计数和MTT的方法,分析神经元的存活。再利用免疫荧光染色技术,研究神经元树突的长度以及数量。最后利用衣霉素和过氧化氢诱导内质网应激和氧化应激,研究应激条件下,REEP1对神经元存活的影响。研究结果1.ALS病人和ALS相关动物模型中REEP1表达下调研究显示ALS病人脊髓样品中,REEP1表达水平明显降低。然而,其他REEP家族成员,如REEP2、REEP3、REEP5表达水平没有发生改变。ALS相关动物模型G93A小鼠脊髓中REEP1表达量也明显下降,并且随着年龄增长更加明显。2.脊髓中过表达REEP1能够挽救G93A小鼠的运动功能障碍研究发现过表达REEP1能够延长小鼠的寿命,同时显著增强其后肢握力。肌肉电生理和肌肉解剖结果表明,REEP1表达水平的上调,能够挽救G93A小鼠的肌肉萎缩,同时改善神经肌肉接头的去神经化。另外,G93A/REEP1小鼠脊髓中运动神经元数量显著增多,小胶质细胞和星形胶质细胞增生明显减少,且分支结构增多。说明REEP1表达量的上调能抑制脊髓中的神经炎症。3.REEP1敲除引起线粒体CIV功能异常与野生型细胞相比,REEP1KO细胞中的线粒体分布异常,且膜电势显著降低,ATP含量也明显减少。除此以外,我们还观察到REEP1KO细胞中线粒体CIV的组装减少和活力下降。这一现象在ALS病人和G93A小鼠脊髓线粒体中都有发现。4.REEP1通过与线粒体CIV亚基NDUFA4的结合调节线粒体功能研究发现REEP1与线粒体CIV亚基NDUFA4相互作用基序在第101到110个氨基酸之间。野生型REEP1在REEP1KO细胞株中的过表达能成功挽救REEP1KO细胞线粒体的异常,但删除这10个氨基酸的REEP1Δ101-110突变型无法挽救线粒体功能异常。5.REEP1维持NDUFA4的稳定性检测结果显示与年龄匹配的对照相比,ALS病人脊髓中NDUFA4的表达量大幅降低。同样的,G93A小鼠脊髓和REEP1KO细胞株中NDUFA4的蛋白水平也明显降低。6.神经元中缺失REEP1将诱导线粒体CIV功能异常REEP1KO神经元中同样观察到NDUFA4表达量的下降和线粒体CIV功能的缺陷。与野生型神经元相比,REEP1KO神经元表现出更短的树突结构。缺失REEP1的神经元细胞对氧化应激和内质网应激的敏感性增加。研究结论本研究中,我们首次发现,REEP1表达水平降低是ALS病人和ALS小鼠模型脊髓中共有的特征。REEP1缺失抑制线粒体氧化呼吸并减少ATP的产生。分子机理上,REEP1通过与线粒体CIV亚基NDUFA4相互作用,调节其组装和活力。在ALS小鼠模型的脊髓神经元中,上调REEP1表达能够增强线粒体功能,并抑制神经元变性。因此,ALS病人和ALS小鼠模型脊髓中观察到的REEP1减少,可能是这cardiac remodeling biomarkers一疾病进程中发生线粒体形态功能异常的重要原因。而REEP1-NDUFA4通路可能是一种ALS治疗的新靶点。