研究背景当前,肝缺血再灌注损伤(IRI)仍然是肝脏切除、肝移植等外科手术以及创伤、容量不足性休克等病理状态下肝损伤的主要原因。这种现象通常导致急性肝衰竭或移植物功能不全。IRI是指肝脏在经历急性缺血后恢复血液供应,却反而进一步加重了肝损伤的现象,其病理生理改变包括炎症、氧化应激、内质网应激和各种形式的调控性细胞死亡,例如细胞凋亡。铁死亡是一种肝脏IRI损伤中重要的细胞死亡形式,减轻铁死亡可以明显缓解肝脏IRI导致的肝损伤。尽管如此,目前我们仍然不清楚肝脏IRI过程中铁死亡相关的分子间调控机制。RACK1是一种细胞内的脚手架蛋白,在不同蛋白质之间介导相互作用,在细胞信号传导、翻译表达等过程中发挥重要作用。据报道,RACK1在器官缺血再灌注中具有不同的作用medium- to long-term follow-up,根据器官类型和病理特征的不同,它可促进炎症、促进凋亡、抑制自噬等作用。然而,关于RACK1在肝脏IRI过程中的作用尚未有报道,它的分子机制也是未知的。因此,本文的研究目标是探索这一科学现象及其背后的分子机制。更多研究方法我们通过以下几项内容进行研究:(1)构建雌激素诱导性的RACK1肝细胞定向敲除小鼠模型,在动物水平验证RACK1缺失是否影响肝脏IRI导致的肝损伤水平和铁死亡程度;(2)分离基因编辑小鼠原代肝实质细胞,并结合小鼠正常肝细胞系,在细胞水平验证RACK1是否调节肝细胞经IRI模拟处理后导致的细胞铁死亡水平;(3)利用免疫沉淀结合液相色谱质谱技术寻找RACK1的下游分子,同时证明下游分子与RACK1确实存在交互作用,以及交互的精确界面。验证RACK1与下游分子在肝脏IRI过程中的调节关系和调节形式;(4)寻找RACK1的上游调节分子作为目标,同时验证该分子与RACK1相互结合的精确位点。在此基础上,验证以RACK1为中心的调控通路对肝脏IRI诱导的铁死亡的重要性及其机制。研究结果(1)肝细胞特异性的RACK1敲除小鼠成功构建。并利用这种小鼠,我们在动物水平上验证了RACK1敲除可以加重IRI引起的肝脏损伤以及铁死亡。(2)肝实质细胞在IRI处理后确实发生了显著的铁死亡。在细胞水平模拟IRI处理后发现RACK1在IRI诱导的铁死亡中起重要的保护性作用,可以通过降低脂质过氧化作用、增加GPX4表达、降低细胞内亚铁离子浓度等方式降低IRI后的铁死亡水平。(3)RACK1与AMPKα直接发生蛋白-蛋白相互作用,RACK1以第1-93位氨基酸(aa)区域与AMPKα结合,并促进AMPKα发生第172位苏氨酸磷酸PR-171分子量化。(4)RACK1通过调节AMPKα的第172位苏氨酸磷酸化,发挥对肝细胞免受IRI诱导的铁死亡的保护作用。(5)RACK1上游分子为长非编码RNA ZFAS1,RACK1可以其自身181-317位氨基酸区域与ZFAS1互作结合。(6)ZFAS1以促进RACK1经泛素化-蛋白酶体降解并抑制其m RNA水平的双重调控方式,降低RACK1的表达水平,进而抑制了下游AMPK通路的激活,加重了IRI诱导的铁死亡效应。研究结论综上所述,ZFAS1-RACK1-AMPKα是IRI诱导肝细胞发生铁死亡的重要调控途径,具有潜在的临床应用价值。