研究目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,然而在治疗乳腺癌方面,药物抗性是癌症治疗中的一个主要挑战。虽然谷氨酰胺代谢和他莫昔芬抗性之间的联系已经得到了很好的证实,但脯氨酸代谢和脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase,PRODH)的作用与乳腺癌化疗药物抗性之间的关系还有待研究。PRODH已被确定为一种线粒体肿瘤抑制因子。因此,我们将通过体内体外一系列实验探索PRODH在乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中的表达及其对乳腺癌恶性进展的作用,并进一步探索其潜在的影响,为克服乳腺癌细胞对他莫昔芬抗性提供一种潜在获悉更多的新方法。研究方法:1.探究PRODH在乳腺癌他莫昔芬抗性细胞中的表达。首先,使用浓度梯度法,建立乳腺癌他莫昔芬抗性细胞系MCF-7/Tam R和T47D/Tam R;接下来使用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测两种抗性细胞系中PRODH的表达变化情况;最后,使用脯氨酸试剂盒测定两种抗性细胞系中的脯氨酸浓度。2.探究PRODH调节乳腺癌细胞对他莫昔芬耐药性的影响。首先,通过质粒转染,构建稳定高表达PRODH的乳腺癌细胞系,蛋白免疫印迹实验验证PRODH构建情况;其次,通过脯氨酸试剂盒测定稳定高表达PRODH的乳腺癌细胞系中脯氨酸的变化情况;接下来,通过MTT实验和软琼脂克隆形成实验,检测稳定高表达PRODH后,抗性细胞系对他莫昔芬敏感性和克隆形成的影响;最后,进行体内实验,将稳定高表达PRODH的抗性细胞系注入裸鼠体内,建立异种移植瘤模型,在他莫昔芬存在的条件下,观察PRODH在体内对肿瘤生长的影响。3.探究特异性敲低PRODH使乳腺癌细胞对他莫昔芬抗性的影响。质粒转染构建特异性敲低乳腺癌细胞中PRODH基因,蛋白免疫印迹实验验证其表达;接下来,使用脯氨酸试剂盒测定特异性敲低PRODH基因的乳腺癌细胞中脯氨酸水平;最后,通过MTT实验和软琼脂克隆形成实验,检测特异性敲低PRODH的乳腺癌细胞对他莫昔芬抗性和克隆形成的影响。4.探究PRODH在乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中对铁死亡的影响。首先,采用Real-time PCR和Western blotting观察两种抗性细胞系中铁死亡标志基因GPX4(Glutathione peroxidase 4)的表达变化;之后通过蛋白免疫印迹实验观察高表达PRODH对GPX4表达的影响;接下来,通过谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒和流式细胞仪测定稳定高表达PRODH对乳腺癌抗性细胞系中GSH和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响。5.探究加入铁死亡抑制剂(ferrostatin-1,Fer-1)后,PRODH对乳腺癌细胞他莫昔JQ1小鼠芬耐药性的影响。首先,使用铁死亡抑制剂处理稳定表达PRODH的乳腺癌抗性细胞系,蛋白免疫印迹实验观察加入铁死亡抑制剂之后,PRODH对GPX4表达变化;接下来,通过谷胱甘肽试剂盒和流式细胞仪测定加入Fer-1之后,PRODH对抗性细胞系中GSH和ROS水平的变化;之后通过MTT加药实验和软琼脂克隆实验,观察加入Fer-1之后,PRODH对细胞相对存活率和克隆形成的影响;最后,通过裸鼠体内实验,观察加入Fer-1之后,PRODH对裸鼠肿瘤大小的影响。研究结果:1.MTT加药实验验证两种乳腺癌抗性细胞系建立成功;蛋白免疫印迹实验和实时定量PCR结果显示,与亲代细胞相比,在两chronic-infection interaction种抗性细胞系中,PRODH在m RNA和蛋白水平表达下调;脯氨酸试剂盒结果显示,与对照组细胞相比,在两种抗性细胞系中脯氨酸浓度升高。2.构建稳定高表达PRODH的两种抗性细胞系中PRODH表达上调,脯氨酸浓度降低;MTT和细胞软琼脂克隆形成实验结果显示,稳定高表达PRODH增强耐药细胞对他莫昔芬的敏感性,降低细胞克隆形成能力;体内实验结果显示,他莫昔芬治疗可以进一步增强PRODH对肿瘤生长的抑制作用,显示出与体外实验相同的结果。3.构建特异性敲低PRODH的乳腺癌细胞系中PRODH表达下调,脯氨酸浓度升高;特异性敲低PRODH增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性,增强乳腺癌细胞的克隆形成能力。4.与亲代细胞相比,铁死亡标志基因GPX4在两种抗性细胞中表达上调;而在两种乳腺癌他莫昔芬抗性细胞系中,稳定表达PRODH下调GPX4的表达;试剂盒结果显示,与亲本细胞相比,在两种抗性细胞系中GSH浓度升高,ROS水平减少;更重要的是,PRODH的重新表达逆转了两种他莫昔芬耐药细胞中的这些变化。5.Fer-1处理减弱了PRODH对两种抗性细胞系中GPX4表达的抑制作用;此外,Fer-1处理减弱了PRODH对两种抗性细胞中ROS和GSH水平的影响;与对照组细胞相比,加入Fer-1之后,细胞存活率升高,细胞克隆形成增强;体内实验结果显示,铁死亡抑制剂Fer-1治疗逆转了PRODH对肿瘤生长的抑制作用。研究结论:在这项研究中,我们研究了PRODH对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性的影响。在乳腺癌他莫昔芬耐药的细胞中,PRODH表达下调。在体外和体内,PRODH的重新表达使耐药细胞对他莫昔芬敏感。特异性敲除PRODH使乳腺癌细胞对他莫昔芬产生耐药性。我们研究表明,在乳腺癌他莫昔芬耐药的细胞中,铁死亡受到抑制,而过表达PRODH可以恢复乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中的铁死亡。铁死亡抑制剂治疗表明,PRODH通过调节他莫昔芬耐药细胞中的铁死亡来调节他莫昔芬的耐药性。这项研究表明,PRODH为克服乳腺癌细胞对他莫昔芬抗性提供一种潜在的新方法。