MAPK信号通路

目的：基于网络药理学探讨“黄芪-山药”药对治疗Ig A肾病（IgAN）的潜在靶点及其作用机制。方法：运用TCMSP平台以药物口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件，收集“黄芪-山药”药对的活性成分及相关靶点蛋白。通过GeneCards、TTD、PharmGKB、OMIM数据库获取IgAN相关靶点基因。对共有靶点基因进行基因富集分析（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。Nephroseq v5数据库验证靶点基因，探讨其与IgAN患者蛋白尿、肾小球滤过率的相关性。以活性成分为配体、关键靶点为受体进行分子对接，计算对接亲和力。结果：筛选黄芪、山药的潜在活性成分共有29种，预测靶点596个，治疗IgAN的关键靶点62个。GO及KEGG富集分析结果显示，“黄芪-山药”药对可通过氧化应激反应、活性氧反应等途径，介导AGE/RAGE、PI3K/AKT、HIF-1等信号通路发挥作用。PPI网络中包含62个节点，864条边，平均度值为2C59生产商7.87，核心靶点为IL6、AKT1、TP53、IL1B、CASP3、JUanimal pathologyN、PTGS2、EGFR、MYC。IL6、AKT1、MYC、JUN、EGFR与IgAN患者蛋白尿水平有关，TP53、CASP3、JUN、PTGS2、EGFR、MYC对IgAN患者肾小球滤过率有一定的影响。活性成分与关键靶点的对接亲和力介于-6.60～-10.4PD0325901 IC500 kcal/mol。结论：“黄芪-山药”药对可能通过槲皮素、山奈酚、薯蓣皂苷等成分作用于IL6、AKT1、TP53、IL1B、CASP3、JUN、PTGS2、EGFR、MYC等靶点，介导AGE/RAGE、PI3K/AKT、HIF-1等多条信号通路从而起到治疗IgAN的作用，这为后续进一步探讨“黄芪-山药”药对治疗IgAN提供了研究思路。

目的为提高临床治疗效果,研究综合性护理干预对老年糖尿病患者安全自行注射胰岛素的影响。方法选取天津市中医药研究院附属医院内分泌科2019年3—7月收治的老年糖尿病患者60例,采用奇数偶数分组法分为对照组和观察组各30例。对照组实施常规护理,观察组实施综合性护理。比较两组安全注射胰岛素知识水平(用药知识、药物储存方法、注射时间、注射方法、用餐时间、注射剂量)、干预前后的空腹血糖、餐后2 h血糖值。结果观察组患者安全注射胰岛素知识水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者不良反应发PS-341抑制剂生率为6.67%,低于对照组的26.67%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组干预后的血糖值均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.BMN 673分子量05Angioimmunoblastic T cell lymphoma)。结论在需要自行注射胰岛素的老年糖尿病患者中应用综合性护理干预,有助于帮助患者更好地控制血糖,使患者可以安全、高效地注射胰岛素,效果明显,值得临床推广应用。

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B (apolipblood lipid biomarkersoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma,UM）中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和Western blotting，分别检测眼部黑色素瘤[UM和结膜黑色素瘤（conjunctival melanoma,CM）]组织和细胞中APOBEC3B蛋白的表达水平。通过检索癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库，分析UM中APOBEC3B表达水平与预后的关联。使用CRISPR-Cas9质粒APOBEC3B-sgRNA敲除UM细胞系OMM2.3中APOBEC3B基因，构建APOBEC3B敲除的OMM2.3稳转细胞系sg APOBEC3B以及对照细胞系Vector；并通过克隆形成实验，探索APOBEC3B敲除对OMM2.3细胞增殖的影响。同时，通过APOBEC3B-shRNA和空载质粒建立APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞sh APOBEC3B和对照PF-02341066纯度细胞shCtrl，对其进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq），检测差异基因，并通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）揭示APOBEC3B调控的下游通路。通过免疫荧光染色鉴定下游通路的关键蛋白。通过应用通路靶向药物处理，检测APOBEC3B对UM药物治疗敏感性的影响。结果·免疫组织化学染色结果表明眼部黑色素瘤（UM和CM）组织相较于良性色素痣组织APOBEC3B表达更高。Western blotting也表明包括OMM2.3细胞在内的大多数眼部黑色素瘤细胞相较于正常对照细胞（视网膜色素上皮细胞） APOBEC3B蛋白表达水平更高。并且TCGA数据库分析表明，APOBEC3B高表达的UM患者总生存期（P=0.032）和无病生存期（P=0.000）更短。然而APOBEC3B敲除并不影响OMM2.3细胞克隆形成的能力，APOBEC3B敲低也没有造成细胞周期的显著改变。sh APOBEC3B和shCtrl细胞系的RNA-seq差异基因富集分析结果显示，APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞的复制应激相关通路，并且热图分析也显示APOBEC3B敲低后DNA复制应激相关通路基因表达发生改变。免疫荧光染色结果显示，APOBEC3B敲低后复制应激通路关键靶标磷酸化的复制蛋白A 32 kDa亚基（replication protein A 32 kDa subunit,RPA32）水平降低。在对APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞和对照细胞的药物敏感性实验中，发现相较于sh APOBEC3B细胞，shCtrl细胞对细胞周期检测点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)抑制剂的敏感性更高。Nirmatrelvir体内实验剂量结论·APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞复制应激相关通路，且APOBEC3B表达的OMM2.3细胞对CHK1抑制剂的处理更为敏感。

目的 探究老年患者髋膝关节置换术后抗凝治疗对骨代谢和骨关节功能的影响。方法 选取2018年1月至2019年1月于湖州市第一人民医院行髋膝关节置换的60例老年患者纳入研究，依据随机数字表法将其分为对照组和观察组，每组各30例。对照组患者予依诺肝素抗凝治疗，观察组患者予利伐沙班口服抗凝治疗，比较两组患者治疗前后的骨代谢指标和骨关节功能变化。结果 治疗后14d、35d和术后3个月，两组患者的Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列（β isomer of C–terminal telopeptide of typeⅠcollagen,β–CTX）均显著高于本组术前（P<0.05），治疗后14d、35dAZD1152-HQPA供应商，两组患者的骨钙素（osteocalcin,OCN）均显著低于本组术前（P<0.05），两组患者术后3个月的骨碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）均显著低于本组术前（P<0.05）。治疗14d、35d和术后3个月，观察组点击此处患者的OCN均显著高于对照组（P<0.05）,β–CTX均显著低于对照组（P<0.05）。治疗14d、35d和术后3个月，两组患者的ALP比较差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗35d和术后3个月，观察组患者的Harris髋关节评分和美国特种外科医院评分均显著高于对照组（P<0.05）。结论 老年患者髋膝关节置换术后使用低分子肝素和Ⅹa因子抑制Human hepatocellular carcinoma剂进行抗凝治疗可影响患者骨代谢水平，但利伐沙班的影响相对较小。与低分子肝素相比，在关节置换抗凝治疗后期，利伐沙班更有利于老年关节置换术后的关节功能恢复。

目的 分析乳腺癌患者抑郁、焦虑发病率及相关影响因素。方法 选取承德市中心医院肿瘤科2019年6月～2022年6月门诊和住院的女性乳腺癌患者为研究对象，采用抑郁自评表（SDS）AZD1152-HQPA试剂和焦虑自评表（SAS）开展横断面研究，对数据进行卡方检验和秩和检验，并采用二元Logistic回归模型进行影响因素的分析Empagliflozin供应商。结果 乳腺癌患者抑郁发病率为43.70%，焦虑发病率为44.69%，抑郁合并焦虑发病率为35.80Biogenic synthesis%。多因素分析结果显示：家庭月收入低、居住地为城市、无工作、手术方式为全切是乳腺癌患者患有抑郁的独立危险因素；家庭月收入低、居住地为城市、无工作、手术方式为全切、上肢功能受限是乳腺癌患者患有焦虑的独立危险因素；家庭月收入低、居住地为城市、无工作、手术方式为全切、上肢功能受限为乳腺癌患者同时患有抑郁和焦虑的独立危险因素。结论 乳腺癌患者抑郁、焦虑、抑郁合并焦虑的发病率较高，医务人员应采取多种干预措施改善其负面情绪，从而改善患者预后，延长其生存期。

目的 探讨影响年轻乳腺癌患者新辅助化疗后病理完全缓解(pCR)与预后的因素。方法 回顾性分析行新辅助化疗的145例年轻乳腺癌患者临床资料，分析影响年轻乳腺癌患者新辅助化疗后pCR与预后的因素。结果 145例年轻乳腺癌患者新辅助化疗后pCR率为34.48%。ERPD-0332991阳性、PR阳性、临床N分期、Ki67阳性、化疗方案与pCR有关(P<0.05),HER-2、化疗周期、分子分型、临床T分期与pCR无关(P>0.05);多因素分析显示，Ki67阳性、临床N分期是影响年轻乳腺癌患者新辅助化疗后pCR的独立因素(P<0.05且OR>1)。145例年轻乳腺癌患者新辅助化疗后1年复发率37.93%。ER阳性、PR阳性、临床T分期、临床N分期、pCR与新辅助化疗后预后有关(P<0.05),HER-2、Ki67、化疗方案、化疗周期、分子分型与新辅助化疗后预后无关(P>0.05);多因素分析显示，临床T分期、pCR是影响年轻乳腺癌患者新辅助化疗后预后的独立因素(P<0.05且OR>1)。结获悉更多论 Ki67阳性、临床N分期是影响年轻乳腺癌患者新辅助化疗后pCR的独立因素，而临床trichohepatoenteric syndromeT分期、pCR是影响预后的独立因素。

目的:肺癌治疗失败的主要原因是其发生侵袭转移。上皮间质转化过程在其中发挥出了重要作用。本课题组的前期研究与其他研究均表明新疆传统植物药天山雪莲不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。但由于其水溶性差,生物利用度低,在实际应用时存在弊端。因此,本课题拟用从天山雪莲中筛选得到的具有抑制肿瘤细胞发生上皮间质转化作用的β-谷甾醇替代胆固醇制备脂质体,并将具有较强抗肿瘤活性的天山雪莲活性化合物粗毛豚草素包载于脂质体。为了增强纳米载体对肿瘤细胞的毒性,改善细胞的摄取,并提高包封率与载药量,将在所制备的脂质体的表面涂覆一层聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯,并修饰ADH-1多肽。以构建一个多功能的纳米靶向载体。为传统中药的进一步研究提供了新的思路与方法,同时促进了现代医学对天山雪莲潜在药物的研发,也为肺癌转移的治疗提供了新的策略,具有重要的研究意义。方法:(1)通过使用高效液相色谱法建立药物粗毛豚草素的含量测定方法学,利用酶标仪建立香豆素6的含量测定方法学;(2)粗毛豚草素脂质体是采用薄膜分散法制备得到的,使用高效液相色谱仪对其包封率进行测定,并采用戊二醛法将ADH-1靶向基团连接在粗毛豚草素脂质体表面,使用三硝基苯磺酸法对脂质体表面靶向基团的连接率进行测定;(3)对制备的天山雪莲功能化纳米载体进行表征考察:借助透射电镜观察所制备各组纳米载体的形貌,所构建纳米载体的粒径、PDI及Zeta电位是采用马尔文粒度仪测定的,分别于4℃、25℃条件下保存载体并对其MLN4924分子式稳定性进行考察,并采用透析法考察所构建纳米载体的体外释药行为;(4)培养A549肺癌细胞;采用MTT法和DAPI荧光标记法分别考察天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549细胞的抗增殖作用;通过采用DHE荧光探针对A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞在给药后细胞内的活性氧的表达水平进行检测;并进一步通过流式细胞仪测定A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞对天山雪莲功能化纳米载体摄取率,从而来考察天山雪莲功能化纳米载体的靶向效果;使用流式细胞仪考察天山雪莲功能化纳米载体对A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞的凋亡作用;(5)通过划痕实验、Transwell迁移以及侵袭实验对天山雪莲功能化纳米载体抑制侵袭转移作用进行评价;并采用Western Blot手段对E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表达量进行测定。(6)建立荷A549肺癌小鼠模型,考察天山雪莲功能化纳米载体对荷瘤小鼠的治疗作用。结果:(1)所建立的粗毛豚草素标准曲线线性关系良好,日间、日内精密度及回收率均PHHs primary human hepatocytes符合要求;香豆素6标准曲线线性关系良好,并进一步确定了药物不干扰香豆素6的吸收;(2)以包封率和载药量为指标,进行最佳处方筛选:水化液选取硫酸铵,水化温度控制在60℃,有机试剂选择甲醇,磷脂β-谷甾醇膜材比为3:1,粗毛豚草素药脂比为1:5时最佳。天山雪莲功能化纳米载体中粗毛豚草素的平均包封率为87.25±0.49%,载药量为10.66±0.06%,ADH-1-HIS-LIP组与天山雪莲功能化纳米载体组ADH-1多肽的连接率分别为26.77±0.01%、28.82±0.01%;(3)制备的粗毛豚草素脂质体分布均匀,形态圆整,粒径大小在100 nm附近;制备得到的天山雪莲功能化纳米载体的平均粒径为110.2±0.37 nm,多分散系数为0.10±0.012,Zeta电位为-15.37±0.12 m V;28天的时间内,储存在4℃的天山雪莲功能化纳米载体的粒径、电位及PDI稳定性基本无明显变化,外观颜色无明显变化,时间较长出现轻微的絮状现象;储存在25℃贮存条件下天山雪莲功能化纳米载体,除粒径随着贮存时间的延长出现了轻微的增长及时间较长出现轻微的絮状现象外,PDI及Zeta电位在28天内均较为稳定,稳定性良好。48 h内天山雪莲功能化纳米载体组具有良好的缓释行为,没有明显的突释行为,较游离药物的释放时间明显增长;(4)抗增殖实验结果显示,与粗毛豚草素游离药相比,各组制剂对造模前后A549细胞的抗增殖效果均有所增加,且天山雪莲功能化纳米载体组对造模前后A549细胞的抑制作用最强。IC_(50)分析结果显示,在正常A549肺癌细胞中,天山雪莲功能化纳米载体组的IC_(50)较游离粗毛豚草素组下降了5.93倍。在TGF-β造模后的A549细胞中,天山雪莲功能化纳米载体组的ICCX-5461_(50)较游离粗毛豚草素组下降了14.40倍。从上述结果可以看出,所制备的天山雪莲功能化纳米载体对造模前后的A549细胞均具有较强的抗增殖效果,做成制剂后可以显著增强药物的抗增殖效果,且在造模后A549细胞中的抗增殖效果与增强药物作用的效果更强。在ROS活性氧实验中,天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549肺癌细胞细胞内的ROS水平有显著抑制作用。摄取结果显示,天山雪莲功能化纳米载体进入A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞的量明显多于其他各组。凋亡结果显示,天山雪莲功能化纳米载体对A549肺癌细胞的凋亡作用最强为43.77±11.26%。(5)在划痕实验中,天山雪莲功能化纳米载体的愈合率最低。Transwell细胞迁移实验证明天山雪莲功能化纳米载体组迁移的细胞数量显著降低;Transwell细胞侵袭实验证明靶向组可使穿过小室的A549肺癌细胞减少,抑制A549肺癌细胞的侵袭能力;Western Blotting检测结果可知天山雪莲功能化纳米载体可以上调E-cadherin的表达水平,下调Vimentin和N-cadherin的表达。(6)天山雪莲功能化纳米载体组对荷瘤小鼠肿瘤体积抑制率最高,对体重的影响较小,平均生存时间最长,且对其他组织器官无明显毒性。结论:(1)本实验建立的粗毛豚草素体外含量测定方法学稳定可靠、重现性好;香豆素6的含量测定方法线性良好;(2)薄膜分散法制备的天山雪莲功能化纳米载体方法可重复,包封率与载药量较高,分布均匀、粒径均一,具有缓释效果,稳定性良好;(3)天山雪莲功能化纳米载体可发挥显著的抗增殖效果;天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制细胞内活性氧的表达;天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549细胞的摄取效果最好,且造模后摄取更强;天山雪莲功能化纳米载体可以发挥良好的促凋亡作用;(4)天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制A549细胞的侵袭和迁移,并进一步通过蛋白含量测定结果可知,天山雪莲功能化纳米载体通过调节N-cadherin、Vimentin与E-cadherin蛋白的表达来发挥抑制A549肺癌细胞上皮间质转化的作用。(5)天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,提高治疗效果,且安全性强。

目的：探究肿瘤相关中性粒细胞（TAN）对子宫内膜癌（EC）细胞上皮-间质转化（EMT）过程及自噬的影响及机制。方法：通过免疫组织化学染色观察EC组织内TAN浸润情况，分离人TAN，经瑞氏-吉姆萨染色和流式细Q-VD-Oph采购胞术鉴定TAN；建立EC细胞系HEC-1-A与TAN共培养体系，并给予自噬抑制剂3MA干预，具体分为HEC-1-A组、TAN+HEC-1-A组、TAN+3MAHEC-1-A组，处理结束后收集各组HEC-1-A细胞，细胞免疫荧光染色观察HEC-1-A细胞内E-钙黏蛋白（E-cadherin）与波形蛋白（Vimentin）染色情况，Western blot测定细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9表达水平，Transwell检测细胞的迁移数目与侵袭数目，免疫荧光染色观察细胞内自噬标志物LC3表达情况，Western blot测定细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62表达水平。结果：EC组织内TAN标志物CD15阳性表达高，TAN浸润明显；分离的TAN呈圆形或椭圆形，细胞核多呈分叶状（2～5叶），且CD11b+Ly6G+标记的细胞比例达91.0%；与HEC-1-A组细胞相比，TAN+HEC-1-A组细胞内E-cadherin荧光染色强度明显减弱，Vimentin荧光染色强度明显增强，细胞中E-cadherin蛋白相对表达量显著下调，Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量显著上调，细胞迁移数目与侵袭数目均显著增加，细胞内LC3lung pathology荧光染色强度明显增强，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著上升，Beclin-1蛋白相对表达量显著上调，而p62蛋白相对表达量显著下调，差异均有统计学意义（P<0.05）；与TAN+HEC-1-A组相比，TAN+3MA-HEC-1-A组细胞内E-cadPF-02341066herin荧光染色强度明显增强，而Vimentin荧光染色强度明显减弱，细胞中E-cadherin蛋白相对表达量显著上调，Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量显著下调，细胞迁移数目与侵袭数目均显著减少，同时，细胞内LC3荧光染色强度明显减弱，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著下降，Beclin-1蛋白相对表达量显著下调，p62蛋白相对表达量显著上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：TAN能够促进EC细胞EMT进程并增强细胞自噬，使用自噬抑制剂3MA干预后，TAN诱导的EC细胞EMT与自噬均受到抑制。

目的 探究祛风养心方通过SIRT3-AMPK通路介导自噬抑制AngⅡ诱导H9c2心肌细胞肥大的作用机制。方法 用慢病毒感染H9c2心肌细胞构建SIRT3低表达稳定株。用AngⅡ诱导H9c2心肌细胞肥大模型，制备含药血清。实验组分为4组：(1)10%空白血清（blank）+Lv-NC；(2)AngⅡ+10%空白血清（blank）+Lv-NC；(3)AngⅡ+10%QFYX含药血清+Lv-NC；(4)AngⅡ+10%QFYX含药血清+Lv-shSIRT3。用鬼笔环肽染色评价Elexacaftor说明书细胞面积，Western Blot方法检测ANP、BNP、ACTα1、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62、P-AMPK、P-mTOR蛋白的表达含量。结果 与blank+Lv-NC组比较，AngⅡ+Lv-NC组H9c2心肌细胞肥大，心肌肥厚基因蛋白的表达上调[ANP、BNP(P<0.01),ACTα1(P<0.05)]，自噬代表基因Beclin1、LC3-Ⅱ、P62的表达显著上升（P<0.01）,SIRT3的表达下降（P<0.05）,P-AMPK下降（P<0.01）,P-mTOR上升（P<0.01）。与AngⅡ+Lv-NC组比较，AngⅡ+QFYX+Lv-NC组心肌肥大不显著，肥厚基因ANP、BNP、ACTα1、自噬代表基因Beclin1、LC3-Ⅱ、P62的表达显著下降[ANP、BNP、ACTα1、Beclin1(P<0.01),LC3-Ⅱ、P62(P<0.05)],SIRT3的表达上升（P<0.01）,P-AMPK上升（P<0.01）,P-mTOR下降（P<0.01），与AngⅡ+QFYX+Lv-NC组比较，AngⅡ+QFYX+Lv-sFUT-175hSIRT3组肥厚基因表达增强[ANP、BNP(P<0.01),ACTα1(P<0.05)],SIRT3处于低表达水平（P<0.01），自噬代表基因的表达升高[Beclin1、P62(P<0.01),LC3-Ⅱ(P<0.05)],P-AMPK下降（P<0.01）,P-mTOR上升（P<0.01）。结论 祛风养心方可以通过改善自噬，通畅自噬流，抑制AngⅡ诱导H9c2心肌细胞肥大，这种保护作用是通过促进SIRT3的表达介导AMPbiocontrol agentK-mTOR通路实现的。

研究背景全世界每年约有五千万人遭受创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI),其高死亡率及严重的后遗效应受到广泛关注。TBI后遗效应中运动、认知等神经功能的损害主要与伤后慢性神经炎症的持续进展有关。小胶质细胞作为中枢神经系统(central nervous system,CNS)中参与固有免疫的重要细胞,在神经炎症的发展中起着重要作用。NLRP3(nucleotide-binding domain,leucine-rich-repeat containing family,pyrin domain containing-3)炎症小体是一个大蛋白复合物,在CNS中主要表达于小胶质细胞中,由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬酶-1(caspase 1)组成。已有研究表明,NLRP3炎症小体的活化能够引起细胞焦亡和炎症级联反应,是慢性创伤性脑病和许多神经退行性疾病慢性炎症损伤的重要原因。腺苷2A受体(aselleckchemdenosine 2A receptor,A_(2A)R)在中枢神经系统中广泛表达,已有研究证实A_(2A)R在帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)等CNS疾病中发挥着重要的神经炎症调控作用,其在TBI中也与神经炎症的调控高度相关。A_(2A)R受体的活化主要表现为抗炎效应,但在CNS中由于伤后谷氨酸浓度的急剧升高,其抗炎效应转变为促炎效应。这种效应转变的主要原因是高浓度谷氨酸环境下,A_(2A)R与代谢型谷氨酸受体5相互作用,其下游信号通路由抗炎的PKA通路重定向至促炎的PKC通路。此外,已有报道表明A_(2A)R在血管内皮细胞及巨噬细胞中参与了NLRP3炎症小体的调控。但由于A_(2A)R在不同类型细胞和部位具有不同甚至相反的效应,小胶质细胞中A_(2A)R对NLRP3炎症小体的调控在TBI后神经炎症进展中的medical level作用及机制仍有待阐明。研究内容与方法在动物实验中,我们构建了小胶质细胞NLRP3或A_(2A)R特异性敲除的小鼠,通过行为学检测(神经功能评分、平衡木试验、加速转棒试验和旷场试验)、免疫荧光、western blot(WB)等方法,探究小胶质细胞中NLRP3活化对中度TBI后7d神经炎症的影响及伤后A_(2A)R对NLRP3炎症小体活化的调控效应。在原代小胶质细胞中,通过CCK-8、WB、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫荧光和蛋白质免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,Co-IP)等手段,探究小胶中A_(2A)R对NLRP3炎症小体组装与活化的影响及调控机制,以及这种调控效应在不同浓度谷氨酸环境下的变化。实验结果及结论1.TBI后小胶质细胞中A_(2A)R对NLRP3炎症小体的调控效应研究1)TBI后伤周皮层中小胶质细胞A_(2A)R和NLRP3表达显著升高且在小胶质细胞中存在大量共定位。分选TBI伤后7d伤周皮层小胶质细胞,WB检测A_(2A)R和NLRP3含量,结果表明TBI后小胶中A_(2A)R和NLRP3显著升高。免疫荧光也证实了两者的表达升高,并在小胶质细胞(Iba-1~+)中存在大量共定位。2)小胶质细胞NLRP3特异性敲除(NLRP3~(CX3CR1))能显著抑制TBI后神经功能缺损、炎性因子释放和神经病理改变。NLRP3~(CX3CR1)有效减轻了TBI后24h脑水肿程度及伤后3d、7d的运动功能损害。WB检测炎性因子(IL-1β和IL-18)和突触相关蛋白(PSD95、SNAP25、VAMP1、SYN1)水平,结果表明NLRP3~(CX3CR1)具有抑制神经炎症,减轻伤后突触损伤的作用。HE染色证实伤后7d炎性细胞浸润得到抑制。免疫荧光检测证实NLRP3~(CX3CR1)能够有效抑制TBI后小胶质细胞活化(CD68~+)和树突(MAP2~+)损伤,对星形胶质细胞(GFAP~+)和神经元(NeuN~+)数量无显著影响。3)小胶质细胞A_(2A)R特异性敲除(A_(2A)R~(CX3CR1))能抑制TBI后伤周皮层NLRP3炎症小体的活化,进而改善伤后神经功能缺损、炎性因子释放和神经病理改变。实验结果显示A_(2A)R~(CX3CR1)能够抑制TBI 7d后NLRP3炎症小体的表达与活化,进行改善TBI后脑水肿和运动功能损害。此外,A_(2A)R~(CX3CR1)也能减少突触蛋白丢失(PSD95、SNAP25、VAMP1、SYN1),及抑制炎症因子释放(IL-1β和IL-18)、小胶活化(CD68~+)和树突损伤(MAP2~+)。2.小胶质细胞中A_(2A)R通过与NLRP3蛋白相互作用调控NLRP3炎症小体的组装与活化1)A_(2A)R激动剂能抑制原代小胶质细胞中NLRP3炎症小体活化所致的细胞焦亡和炎性因子释放。使用A_(2A)R激动剂CGS21680(CGS)预处理LPS+ATP刺激的原代小胶质细胞,能够减少细胞死亡和LDH释放,抑制NLRP3炎症小体下游炎性因子释放(IL-1β和IL-18),并减弱caspase 1活性。2)小胶质细胞中A_(2A)R激动剂能抑制pro-caspase 1和全长Gasdermin D(full length AM-2282体外Gasdermin D,FL-GSDMD)的剪切而不影响NLRP3炎症小体相关组分的表达。WB检测NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC、pro-caspase 1、caspase 1 p20、FL-GSDMD和GSDMD蛋白N端(N-terminal of GSDMD,N-GSDMD))的表达,结果证实CGS仅抑制了caspase 1 p20和N-GSDMD的水平,而不影响其他组分的蛋白水平。qPCR进一步检测证实了CGS处理不影响NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase 1、GSDMD、IL-1β和IL-18)mRNA含量。3)小胶质细胞中A_(2A)R通过与NLRP3蛋白相互作用促进NLRP3炎症小体组装。通过Co-IP检测A_(2A)R与NLRP3蛋白相互作用,结果表明LPS+ATP刺激下A_(2A)R与NLRP3相互作用增强,GCS处理能够抑制其相互作用。ASC荧光斑点检测证实CGS处理抑制了NLRP3炎症小体的组装。此外,使用A_(2A)R抑制剂ZM241385(ZM)也能降低细胞上清中IL-1β、IL-18和caspase 1含量,表明ZM也具有抑制NLRP3炎症小体活化的作用。通过A_(2A)R敲除(A_(2A)R-KO)消除其与NLRP3蛋白相互作用,上清IL-1β、IL-18和caspase 1含量也显著降低。NLRP3敲除(NLRP3-KO)后,炎性效应被阻断,CGS干预对上清IL-1β、IL-18和caspase 1含量无影响。3.高浓度谷氨酸环境逆转A_(2A)R激动剂对NLRP3炎症小体组装与活化的抑制效应1)高浓度谷氨酸环境逆转了小胶质细胞中A_(2A)R激动剂对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。在高浓度谷氨酸条件下,CGS的效应由抑炎转变为促炎,表现为促进细胞死亡、LDH释放、IL-1β和IL-18释放,增强了caspase 1活性。2)高浓度谷氨酸逆转了A_(2A)R激动剂对pro-caspase 1及FL-GSDMD剪切的抑制作用而不影响NLRP3炎症小体各组分的表达。WB检测NLRP3炎症小体各组分蛋白的含量,结果表明高浓度谷氨酸下CGS能够促进pro-caspase 1和FL-GSDMD的剪切,而不影响其他组分蛋白的含量。qPCR实验也证实NLRP3炎症小体相关蛋白mRNA含量没有显著变化。3)高浓度谷氨酸环境逆转了CGS对NLRP3炎症小体组装的抑制效应。免疫共沉淀结果表明低浓度谷氨酸下A_(2A)R活化后NLRP3与caspase 1的相互作用受到抑制,而在高浓度谷氨酸下其相互作用增强。免疫荧光检测ASC荧光斑点也具有相似结果。此外,高浓度谷氨酸条件下,ZM能够逆转CGS的促炎效应。总结综上所述,本研究表明TBI后小胶质细胞中A_(2A)R对NLRP3炎症小体具有重要调控作用且显著影响了伤后神经炎症进展。我们证实了小胶质细胞中A_(2A)R通过与NLRP3相互作用从而调控NLRP3炎症小体的组装与活化,并且这种调控作用受谷氨酸浓度的影响。本研究进一步阐明了小胶质细胞中A_(2A)R在神经炎症中扮演的重要角色及其对NLRP3炎症小体的调控机制,为神经炎症和NLRP3炎症小体相关疾病提供了重要的治疗靶点。