MAPK信号通路

目的:探讨搜风愈喘方调控转化生长因子-β1及其信号转导蛋白Smad (TGF-β1/Smad)信号通路干预哮喘大鼠气道重塑的作用机制。方法:将32只SPF级SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松0.000125 g/kg组和搜风愈喘方11.4 g/kg组，除正常对照组外，其余大鼠均制备慢性哮喘模型，造模成功后各组分别予蒸馏水和对应药物灌胃，连续21 d。观察各组一般情况；ELISA法检测大鼠支气管肺泡灌洗液(Serratia symbioticaBALF)中肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-13(IL-13)含量；HE染色、PAS染色和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变、杯状细胞分泌黏液及气道胶原沉积情况；记录支气管管腔内周长(Pi)、气道管壁面积(WAt)、气道平滑肌层面积(WAm)、观察大鼠气道重塑情况；透射电镜观察大鼠肺组织中上皮细胞和平滑肌细胞情况；Real-time PCR法检测大鼠肺组织Tgfb1、Smad2、Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,Asma)、Vegf和Il13 mRNA表达；Western blot法检测大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、SmR428化学结构ad3、α-SMA蛋白表达。结果:与正常对照组比较，模型对照组大鼠存在呼吸深快、烦躁喘促等症状且BALF中TGF-β1、VEGF和IL-13含Talazoparib量显著升高(P<0.01);肺组织中广泛可见炎性细胞浸润、杯状细胞增生以及胶原纤维沉积；气道重塑相关指标显著升高(P<0.01);肺组织超微结构显示肺组织中上皮细胞和平滑肌细胞水肿程度严重，胞内基质溶解、变淡，胶原纤维排列紊乱，细胞器和线粒体肿胀；Tgfb1、Smad2、Smad3、Asma、Vegf和Il13 mRNA相对表达显著上调(P<0.01);TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较，地塞米松0.000125 g/kg组和搜风愈喘方11.4 g/kg组大鼠呼吸平缓，精神活跃；大鼠BALF中TGF-β1、VEGF、IL-13含量显著降低(P<0.01),支气管周围炎性细胞浸润程度减轻、杯状细胞增生不明显且胶原纤维沉积情况明显改善，气道重塑相关指标明显降低(P<0.05或P<0.01);超微结构显示肺组织上皮细胞和平滑肌细胞水肿程度明显减轻，胞内基质均匀，线粒体未见明显肿胀；...

目的 分析10年间肿瘤专科医院收治肺癌患者病理分型和诊断分期构成及变化趋势。方法 选取2001年1月至2010年12月间中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院收治的肺癌患FG-4592供应商者住院信息，分析肺癌患者年龄、性别、病理类型和诊断分期的分布及变化特征。结果 共纳入2001—2010年肺癌住院患者16 476例，男11 458例（69.54%），女5018例（30.46%）。肺癌住院患者逐年升高，50～69岁患者居多，男性以鳞癌selleckchem PLX5622（La Selva Biological Station35.90%）和腺癌（31.41%）为主，女性以腺癌（62.2%）为主；男性和女性腺癌构成分别由2001年的20.99%和38.49%上升到2010年的37.48%和72.71%；鳞癌构成分别由2001年的36.77%和19.08%下降到2010年33.83%和4.82%。男性和女性非小细胞肺癌I期患者占比分别由2001—2005年的17.99%和21.49%上升到2006—2010年的21.95%和26.15%。结论 肺癌住院患者人数在10年间呈逐年增多，腺癌患者多于鳞癌，腺癌比例呈上升趋势，鳞癌呈下降趋势，非小细胞癌I期患者比例呈升高趋势。

生产实践中,预防H7N9亚型禽流感病毒的措施通常是疫苗免疫。其中,病毒载体疫苗能够诱导全方位的免疫应答,包括体液免疫、细胞免疫与粘膜免疫,而且不需要佐剂。前期研究发现,包括但不限于以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)载体在内的一系列含有H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组载体疫苗免疫哺乳动物和禽类后诱导机体产生的免疫应答特征如下:高水平的特异性IgG抗体和低水平的HI/VN抗体;高水平的H7N9亚型禽流感病毒攻毒保护率。这一免疫特征无法用目前疫苗的免疫效果评价机制进行充分解释。因此,本研究将从分子层面和免疫学层面两个角度对含有H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的NDV载体疫苗的免疫机制进行阐释,主要分为:免疫优势抗原表位的确定和非中和抗体在免疫过程中发挥作用的主要方式的探索。通过两个维度的探究解释非中和抗体在H7N9亚型禽流感病毒重组载体疫苗的免疫过程中发挥作用的方式和机制。1.H7N9亚型禽流感NDV载体疫苗免疫血清识别的优势抗原表位的鉴定本研究先对H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白载体疫苗免疫血清,空载体免疫血清和商品化灭活苗免疫血清进行分析鉴定,结果显示载体疫苗免疫血清和空载体免疫血清中针对新城疫的HI抗体水平均超出检出限达到32,而相较于商品化灭活苗免疫血清中高达128的HI抗体水平,载体疫苗针对H7N9亚型禽流感病毒的HI抗体水平远低于检测限和商品化灭活苗免疫血清,仅达到4。比较载体疫苗和商品化灭活苗两者诱导产生的针对H7N9亚型禽流感病毒的总抗体水平并无太大差距。在此基础上,建立被动免疫模型评价载体疫苗免疫血清提供的保护效果,对7日龄雏鸡分别注射600μl载体疫苗免疫血清,商品化疫苗免疫血清以及普通血清,注射后1h进行强H7N9亚型禽流感病毒攻毒,连续观察雏鸡存活状态。结果显示:在排除了细胞免疫的干扰后,血清被动免疫模型中无论是含有高水平中和抗体的商品化疫苗血清还是含有低水平中和抗体高水平非中和抗体的载体疫苗免疫血清都能对H7N9亚型禽流感病毒强毒的攻毒产生100%的保护效果。该结果说明,非中和抗体在载体疫苗免疫病毒攻击的过程中不仅有保护效果,而且发挥了非常重要的保护效果。在此基础上,本研究进行非中和抗体Lipid biomarkers识别的优势抗原表位鉴定,通过竞争ELISA的方法,将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白作为包被抗原,将前期设计的一系列针对HA蛋白不同位点的单抗作为竞争性抗体,和H7N9亚型禽流感病毒载体疫苗免疫血清进行与包被抗原的竞争性结合,通过对比竞争结合率筛选出一株针对HA蛋白G151位点的单抗,竞争结合率高达36.7%。突变该位点后,分别再用突变病毒和原病毒作为包被抗原,用不同浓度的单抗分别与载体疫苗免疫血清进行竞争结合,结果显示,位点突变后,竞争抑制率从原来的30%,下降至不足10%。进而构建相邻位点S150和S152的突变病毒进行ELISA实验,比较和血清的结合率,发现G151,S150和S152三个位点分别单点突变的病毒与亲本毒相比和载体疫苗免疫血清的结合率显著下降。这些结果都表明G151,S150和S152三个位点是载体疫苗诱导产生的抗体针对的优势抗原表位。2.H7N9亚型禽流感免疫血清介导的补体杀伤效应检测方法的建立与靶细胞的构建研究通过构建稳定表达HA蛋白的细胞系模拟病毒感染后的靶细胞,用载体疫苗免疫血清作为抗体和补体的提供方,用检测乳酸脱氢酶(LDH)释放的情况来衡量补体杀伤效应的程度。通过一系列实验,确定优化了检测方法中的系列指标,包括:靶细胞的种属,靶细胞的浓度,以及实验组血清的浓度,最终确定为:293T,0.75×1确认细节04/100μL,以及1:10稀释10μL。同时,用慢病毒包装的方法,将构建好的慢病毒包装质粒Fv115-HA和辅助质粒共转染293T细胞,并在嘌呤霉素的压力下筛选稳定的慢病毒感染的293T细胞株。结果显示,H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白在293T细胞表面稳定高效表达,成功构建出稳定表达HA蛋白的293T细胞系,为后续实验提供基础。3.基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗诱导的CDC效应评价研究主要通过检测LDH释放的方式检测免疫血清对于靶细胞的补体杀伤效果,通过间接免疫荧光和测定病毒TCID50的方式检测免疫血清对于病毒粒子的补体杀伤效果。实验分别从热灭活免疫血清对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应影响;补体抑制剂聚苯乙醇磺酸钠(SPS)处理血清后对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应影响;以及免疫血清对于抗原优势表位发生突变的病毒及其感染细胞的补体杀伤效应三个方面探究含H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的载体疫苗免疫血清的保护机制。最终结果显示:血清中补体和抗体同时存在时,对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应最显著;补体或者抗体只存在一个时,免疫血清对于感染细胞和病毒粒子的杀伤效果大大下降;将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白上的免疫CP-456773血清识别的优势抗原表位进行突变后,发现补体杀伤效果基本消失。

目的 比较孟鲁司特与左西替利嗪联合治疗常年性过敏性鼻炎medial geniculate合并轻、Colforsin使用方法中度哮喘的疗效与安全性。方法 在服用安慰剂1周后，患者随机接受孟鲁司特单独治疗或孟鲁司特/左西替利嗪联合治疗4周。主要疗效评价标准为平均日间鼻症状评分，其他疗效评价标准包括夜间鼻症状评分、综合症状评分、1秒钟用力呼气量（FEV1）、用力肺活量（FVC）、FEV1/FVC、哮喘控制测试得分和缓解药物在治疗期间使用的频率。结果 与孟鲁斯特组相比，联合治疗组的平均日间鼻症状评分显著减少（P=0.015）；在其他过敏性鼻炎疗效评价标准中，联合治疗组患者较孟鲁斯特组都有显著改善（P<0.05）；两组患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC和哮喘控制测试评分比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。两组患者不良事件发生情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 与单用孟鲁司特相比，孟鲁司特与左西替利嗪联合治疗常年性过敏性鼻炎合并哮https://www.selleck.cn/products/vx-661.html喘患者安全有效。

目的 探讨以门静脉高压症为主要表现的骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者的临床特征、肝脏组织学特点及诊疗方法。方法 纳入2019年1月—2022年2月在北京友谊寻找更多医院肝病中心以门静脉高压症就诊，最终诊断为MPN的患者，回顾性分析其临床表现、肝脏病理特征、治疗和随访结果。结果 共纳入9例患者，所有患者均有脾大及食管胃底静脉曲张，其中8例患者有门静脉血栓。所有患者肝功能及血常规均在正常范围或轻度异常。6例患者行肝穿刺活检，均未见肝脏纤维间隔及假小叶形成,2例可见肝脏髓外造血现象。所有患者均行骨髓活检及基因检测,6例为原发性血小板增多症,3例为原发性骨髓纤维化；基因检测结果显示,JAK-2V617F基因突变7例,CALR基因LY2835219研究购买突变2例。结论MPN是门静脉高压的少iridoid biosynthesis见病因之一，临床可表现为食管胃底静脉曲张和脾大，甚至巨脾，但无白细胞和血小板减低等脾功能亢进表现。JAK-2V617F和CALR基因检测可提高MPN的诊断率。

目的 分析青岛地区糖尿病合并冠心病患者发生心肌损伤的流行病学特征及危险因素，为糖尿病合并冠心病患者预防发生心肌损伤提供理论依据。方法 选取2019年6月至2020年6月青岛大学附属医院收治的糖尿病合并冠心病患者196例，根据患者住院期间是否发生心肌损伤分为心肌损伤组(n=39)和Medical honey无心肌损伤组(n=157),抽取所有研究对象空腹肘静脉血4 mL,对比两组血清cTnT、BNP和CK-MB水平，从病历系统收集患者临床资料，包括患者性别、年龄、服用降脂药史、BMI、糖尿病、冠心病病程及血清TG、FPG、PBG、HbAlc、HDL-C、LDL-C水平等，采用单因素分析和logistic回归分析影响糖尿病合并冠心病患者发生心肌损伤的影响因素。结果 196例糖尿病合并冠心病患者中发生心肌损伤39例(19.90%),其中男性21例，女性18例；两组间性别间差异无统计学意义(χ~2=0.105,P>0.05);心肌损伤组患者年龄(64.78±5.67)明显高于对照组(59.72±5.12)(t=5.016,P<0.05);心肌损伤组患者获悉更多血清selleckchemcTnT、BNP和CK-MB水平明显高于对照组(P<0.05);两组在冠心病病程、血清Hcy、TG、FPG、PBG、HbAlc、 TG、LDL-C间差异有统计学意义(P<0.05);Hcy升高(OR=2.673)、FBG升高(OR=3.681)、LDL-C升高(OR=2.912)是影响糖尿病合并冠心病患者发生心肌损伤的危险因素(P<0.05)。结论 青岛地区糖尿病合并冠心病患者发生心肌损伤的风险较高，与患者的餐后LDL-C升高、FBG及Hcy升高密切相关，应给予积极干预，可降低发生心肌损伤的风险。

目的 基于网络药理学分析黄五甘附膏缓解膝骨关节炎（KOA）疼痛的作用机制，并进行动物实验验证。方法 通过TCMSP、PubChem数据库和SwissADME平台获取黄五甘附膏药物活性成分并筛选有效成分；通过SEA、GeneCards、OMIM等数据库获取KOA疾病相关靶点；运用Cytoscape3.9.0软件构建药物-成分-靶点-疾病网络；通过STRING数据库构建蛋白相互作用（PPI）网络，并筛选核心靶点；通过DAVID平台对关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析。建立寒湿证KOA大鼠模型，采用黄五甘附膏对其进行干预，观察药效并检测核心靶点表达。结果 从黄五甘附膏中筛选出活性成分104个，得到59个治疗KOA的潜在作用靶点；通过PPI网络分析得到重要mice infection靶点有IL6Cell Cycle抑制剂、IL1β、PTGS2等；KEGG通路富集分析结果显示可能涉及IL-17、TNF、TRP、NF-κB等84条信号通路，多与炎症有关。动物实寻找更多验显示，模型大鼠Lecuesne MG评分升高（P<0.05），机械痛阈（PWT）明显降低（P<0.05）；黄五甘附膏中、高剂量组大鼠PWT较模型组明显恢复，滑膜Krenn评分有所降低（P<0.05），黄五甘附膏高剂量软骨组织Mankin评分有所降低（P<0.05），黄五甘附膏各剂量组血清IL-6、IL-1β含量较模型组不同程度降低，黄五甘附膏能下调TRPV1蛋白表达。结论黄五甘附膏缓解KOA疼痛机制可能与减轻炎性反应，减少炎性因子IL-1β、IL-6释放，进而缓解KOA炎性痛敏，下调TRPV1表达水平有关。

目的 探讨人脱落乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)对大鼠颞下颌关节骨关节炎(TMJOA)的治疗作用。方法 60只8周龄雄性SD大鼠随机分为对照组、碘乙酸钠(MIA)诱导致TMJOA组(MIA组)、SHED治疗TMJOA组(SHED组)，每组20只，各组分别于处理后2、4周处死10只并取材，左侧颞下颌关节(TMJ)用于形态学检测，右侧TMJ髁突软骨用于分子生物学检测。采用HE、番红O-固绿染色评价软骨退变程度，免疫组化染色检测髁突软骨中Ⅱ型胶原的表达情况，Western blotting检测凋亡关键分子cleaved-CASP3、促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达变化。结果 与对照组相比，MIA组髁突软骨各层细胞排列紊乱，可见大量无细胞区，且纤维层明显增厚(P<0.001)；经SHED治疗后，SHED组形态基本恢复正常，与对照组比较无明显差异。MIA组髁突软骨的骨关节炎改良Mankin组织学评分明显高于对照组(P<0.001),SHED组经治疗后明显降低(P<0.001)，且与对照组比较差异无统计学意义。MIA组髁突软骨的番红O染色阳性面积比和Ⅱ型胶原阳性面积百分比均明显低于对照组(P<0.001),SHED组经治疗后较MIA组明显增高(P<0.01)，Chronic care model Medicare eligibility且与对照组比较差异无统计学意义。MIA组髁突软骨中的TUNEL阳性细胞数明显多于对照组(P<0.001),SHED组经治疗后较MIA组明显减少(P<0.Ceralasertib001)，但与对照组比较差异仍有统计学意义(2周，P<0.01;4周，P<0.001)。Western blotting检测显示，MIA组髁突软骨中cleaved-CASP3和TNF-α表达水平明显高于对照此网站组(P<0.001),SHED组经治疗后明显降低(P<0.001)，且与对照组比较差异无统计学意义。结论 SHED治疗可以有效逆转MIA所致的大鼠髁突软骨退变。

目的：探讨汉黄芩素对气虚模型LLC种植瘤小鼠的抗肿瘤作用及淋巴细胞亚群的影响。方法：将30只SPF级C57BAG-221L/6雄性小鼠（N型）用烟熏法建立小鼠气虚模型后，构建气虚型LLC肺癌皮下种植瘤模型。将造模成功的24只小鼠随机分为气虚荷瘤组、汉黄芩素高剂量组、汉黄芩素中剂量组、汉黄芩素低剂量组，每组6只。另取6只正常小鼠作为正常组。汉黄芩素低、中、高剂量组小鼠灌胃给予相应剂量的汉黄芩素混悬液；正常组、气虚荷瘤组小鼠灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药15 d。给药过程中每4 d测量1次体质量和肿瘤体积。给药结束后剖取小鼠肿瘤、脾脏和胸腺称定质量，并采用HE染色法对肿瘤、肝脏和肾脏进行组织病理学检查；采用流式细胞术分析小鼠外周血中的辅助T细胞（CD3~+、CD4~+）、杀伤T细胞（CD3~+、CD8+）、调节性T细胞（Treg）(CD3~+、CD4~+、CD25~+、Foxp3~+)、NK细胞（CD3~-、CD19~+）和B细胞（CD3~-、CD49b~+）的比例，并计算CD4~+/CD8+比值。结果：与正常组比较，气虚荷瘤组小鼠Adavosertib使用方法喜蜷卧，活动度减弱，毛发脱落且蓬松凌乱，毛色发灰，欠光泽，精神萎靡，饮食量较正常组小鼠下降。给药结束后，5组小鼠去瘤体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与气虚荷瘤组比较，汉黄芩素低、中、高剂量组小鼠瘤体体积和瘤体质量均明显降低（P<0.05或P<0.01），抑瘤率分别为55.68%、56.84%、76.33%。与正常组比较，气虚荷瘤组小鼠脾脏指数明显升高（P<0.05），胸腺指数明显降低（P<0.05）；汉黄芩素低、中、高剂量组小鼠脾脏指数、胸腺指数与气虚荷瘤组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。HE染色显示，与气虚荷瘤组比较，汉黄芩素低、中、高剂量组小鼠瘤体组织可见较多坏死区域，且肿瘤细胞的排列相对紊乱；肝肾组织均未见明显病变。与正常组比较，气虚荷瘤组小鼠外周血CD3~+CD4~+T细胞比例、CD3~+CD8+T细胞比例、CD4~+/CD8+比值、CD3-CD19+B细胞比例均明显降低（P<0.05或P<0.01），而CD3-CD49b+NK细胞比例有所升高，但与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与气虚荷瘤组genetic counseling比较，汉黄芩素低、中、高剂量组小鼠外周血CD3~+CD4~+T细胞比例、CD4~+/CD8+比值、CD3~+CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞比例均…

胆固醇作为生物必需的营养物质,在细胞分化、胚胎发育、免疫反应及神经信号传递等方面发挥着重要作用。在晚期内体的低pH环境中,脂蛋白将结合的胆固醇释放出来,经过NPC2蛋白的传递,最后通过NPC1蛋白的跨膜运输将胆固醇转运到细胞质中而发挥特定的生物学功能。当NPC蛋白发生突变后,会导致人类患尼曼匹克病,并在其细胞内异常累积胆固醇。NPC蛋白及胆固醇不仅在细胞生命活动中扮演着重要的角色,还被许多病毒所利用来感染宿主细胞。包括埃博拉病毒、甲肝病毒在内的多种高致病性包膜病毒以NPC1蛋白为胞内受体,通过其介导的膜融合过程,将遗传物质释放到细胞质中。非洲猪瘟病毒的感染不仅依赖于NPC1蛋白,还需要NPC2蛋白的帮助。胆固醇更是参与到病毒感染周期的各个阶段。可能正是因为NPC蛋白及胆固醇在细胞生理活动中的重要性,以及胞内胆固醇转运通路在生物体内相对比较保守,才被多种病毒所劫持。19世纪中期,人们在感染的家蚕中鉴定到了杆状病毒,与其他病毒不同的是,杆状病毒的病毒粒子形态有两种:一种为包埋型的病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV),在病毒的口服感染过程中,ODV的多角体外壳在节肢动物肠道碱性环境中被溶解,成为具有感染能力的病毒并感染肠道细胞;另一种为出芽型的病毒粒子(budded virus,BV),引发细胞与细胞之间的系统感染,通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞。此外,杆状病毒在药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域发挥着重要作用。然而,杆状病毒从发现至今已有一百多年,但是其感染细胞的受体、感染机制等尚不明确。已有研究发现BmNPC1蛋白在BmNPV(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)进入细胞的过程中发挥了重要作用,并且与BmNPV包膜糖蛋白GP64互作。家蚕NPC2家族蛋白成员BmPP(Bombyx mori promoting protein),促进BmNPV感染家蚕细胞,并且具有结合胆固醇的能力。此外还有报道称细胞的胆固醇等分子参与杆状病毒粘附细胞的过程。但是BmNPC蛋白及胆固醇在介导BmNPV感染中扮演什么角色、具有什么机制仍然是个迷。有鉴于此,本研究首先探究了 BmNPC1蛋白的定位及其在杆状病毒进入宿主细胞过程中所扮演的角色,并在BmNPV非纳受细胞系Sf9细胞中表达BmNPC1后添加病毒观察感染情况,验证其是否为BmNPV感染宿主细胞的胞内受体。进一步通过敲除BmNPC2细胞系研究了 BmNPC2蛋白影响病毒感染的时期,并通过添加纯化的BmNPC2蛋白进行功能验证。通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验明确BmNPC2蛋白与BmNPC1、GP64蛋白的互作关系并解析了 BmNPC蛋白是如何协同介导BmNPV感染的分子机制。最后通过Lov及MβCD药物处理PCI-32765分子量降低了细胞胆固醇浓度,分析了胆固醇在杆状病毒感染过程中的作用。主要研究结果如下:1.家蚕NPC1蛋白介导杆状病毒进入细胞的分子机制本研究首先利用细胞膜以及晚期内体标志物探究了 BmNPC1蛋白在家蚕BmE细胞中的定位情况,发现BmNPC1蛋白的亚细胞定位与人NPC1蛋白的定位有差异,BmNPC1蛋白不仅定位于晚期内体膜,还定位于细胞膜上。利用敲除BmNPC1细胞系探究病毒前期感染情况,结果表明BmNPC1的缺失并不影响病毒对BmE细胞的结合。病毒感染BmE细胞2小时后,BmNPV通过膜融合将杆粒大量释放到细胞质中并通过核孔进入细胞核,但在敲除BmNPC1细胞中,BmNPV进入细胞核的过程受到明显抑制,其核定位率仅为对照BmE细胞的1/8。这些结果表明BmNPC1蛋selleck产品白可能在BmNPV芽生病毒粒子膜融合过程中发挥重要作用。将DiO染料包裹的重组BmNPV-EGFP添加到BmNPC1敲除细胞中,结果发现病毒膜融合过程被显著抑制。纯化BmNPC1-C区蛋白后,将其与BmNPV-EGFP孵育后添加到BmE细胞,发现病毒感染量只有对照组的20%,说明BmNPC1蛋白通过其胞外区C区与病毒相互作用介导了病毒包膜的融合。为了探究BmNPC1是否是BmNPV感染细胞的细胞内受体,进一步在BmNPV非纳受细胞系Sf9中表达了BmNPC1,当BmNPV感染后,打破了 BmNPV在Sf9细胞中的膜融合屏障,释放出杆粒并通过核孔进入到Sf9细胞的细胞核,但BmNPV在Sf9细胞中无法进行复制。2.家蚕NPC2蛋白促进杆状病毒感染的机制在BmE细胞中使用CRISPR/Cas9系统成功敲除BmNPC2后,利用Filipin染料对细胞脂类进行染色,发现敲除BmNPC2后胆固醇在细胞内异常累积,进一步明确了家蚕NPC2蛋白转运胆固醇的功能。在BmNPC2敲除细胞系中添加重组的BmNPV-VP39-EGFP荧光病毒,结果表明敲除BmNPC2不影响病毒的结合,但影响病毒入核的效率。进一步研究发现,敲除BmNPC2后影响了病毒膜融合的效率进而影响入核。通过杆状病毒表达系统表达并纯化BmNPC2蛋白,将其添加到BmE细胞中可以促进病毒的感染,并且可以显著提升BmNPV膜融合的效率,进一步证实了之前的结论。当BmNPC2蛋白添加到BmNPC1敲除细胞中,却不能促进病毒的感染,说明BmNPC2促进BmNPV感染依赖于BmNPC1蛋白。在细胞内共表达BmNPC2与BmNPC1-C蛋白,BmNPC2与GP64蛋白,然后进行免疫共沉淀,发现BmNPC2蛋白能够与BmNPC1-C、GP64蛋白互作,通过酵母双杂交实验也得到同样的结果。当用BmNPC2蛋白结合从BmNPC2敲除细胞中获得的子代病毒粒子后,可以促进子代病毒的感染能力。ELISA实验结果表明添加BmNPC2蛋白并不能增强BmNPC1-C蛋白与GP64蛋白的互作强度,但是低pH处理可以增强BmNPC1-C蛋白与BmNPC2以及BmNPC1-C与GP64蛋白的互作强度,说明BmNPC2蛋白可能是通过增强BmNPC1-C蛋白与GP64蛋白的互作效率从而促进膜融合过程的。3.胆固醇在杆状病毒感染中的作用与功能在BmE细胞中添加能竞争性抑制胆固醇合成过程中的限infectious organisms速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶的药物Lovastatin(Lov)、去除细胞膜胆固醇的药物MβCD或外源胆固醇来降低或升高细胞胆固醇浓度,探究胆固醇在BmNPV感染中所扮演的角色。在BmE细胞内添加Lov三天后,细胞内胆固醇浓度降为对照组的60%,并且显著抑制了病毒感染,其病毒载量只有对照组中的1/4。使用Lov和MβCD去除细胞膜胆固醇后,病毒与细胞的结合量显著降低,只有对照组的50%。进一步研究发现,降低细胞内胆固醇浓度影响病毒膜融合的效率,进而导致病毒入核量降低,当回补外源胆固醇后,病毒结合量及入核量均得到恢复。Lov处理BmE细胞后,在病毒感染20小时后检测其对病毒蛋白表达的影响,结果表明细胞内胆固醇浓度降低对病毒蛋白的表达无影响。进一步探究降低细胞内胆固醇浓度后对病毒出芽的影响,纯化正常细胞及Lov处理细胞中的子代病毒粒子进行Western blotting分析,结果发现Lov处理后病毒出芽量与对照组相比显著降低。通过IFA实验观察病毒出芽过程中GP64蛋白与细胞脂筏的共定位情况,结果表明Lov处理抑制了细胞膜脂筏的形成,进而导致病毒出芽量降低。综上研究结果表明,BmNPV感染细胞的膜融合受体可能是BmNPC1,其介导病毒的膜融合过程,BmNPC1的表达可以在BmNPV非纳受的Sf9细胞中打破膜融合障碍。BmNPC2蛋白促进BmNPV感染的作用是通过BmNPC2-BmNPC1细胞内胆固醇转运通路而实现的,其与BmNPC1蛋白协同介导BmNPV感染,在这条通路中,BmNPC1蛋白扮演着更重要的角色。而胆固醇影响病毒与细胞膜的结合、膜融合、病毒出芽过程。本论文的研究结果进一步加深了对杆状病毒感染机制的理解,为包膜病毒劫持胆固醇转运通路感染宿主细胞提供了新的证据,同时针对重要宿主因子和病毒互作方面的深入研究,对培育BmNPV抗性家蚕素材提供新的思路。