MAPK信号通路

核苷酸类药物疗法是目前新的热点开发方向,美国FDA已批准十余款寡核苷酸类药物上市,另外还有几十款寡核苷酸类药物处于临床研究阶段。关于寡核苷酸类药物的非临床安全性评价包括一般毒性、遗传毒性、生殖毒性、致癌性等,在评价的过程中可能需要考虑一些因素,以更好的进行安全性评价。一般毒性研究:对于重复毒性研究,需考虑寡核苷酸类药物在多次给药后的蓄积水平以及产生的毒性。寡核苷酸类药物并不是均匀分布全身,具有较强的抗核酸酶活性的寡核苷酸类药物可能蓄积在特定组织中,寡核苷酸类药物较易蓄积在肾脏和肝脏,比如,米泊美生钠在NHPs的靶器官为肾脏。对于局部给药的寡核苷酸类药物,不仅需要考虑注射部位的毒性,还应考虑通过循环后的蓄积毒性。遗传毒性:仅包含天然核酸的寡核苷酸类药物的降解产物与内源性核酸相同,遗传毒性风险很低,可以不需要开展ICH S2 (R1)中的一系列遗传毒性试验。但是,许多寡核苷酸类药物含有化学修饰的部分,比如化学修饰的核酸等,不仅需要考虑化学修饰部分的遗传毒性风险,还需考虑代谢产物和降解产物的遗传毒性风险,因此,具有化学修饰的寡核苷酸类药物可能需要进行遗传毒性试验。评估遗传毒性的试验方法需慎重选择,因AG-221作用为不同方法产生的相反结果可能是由于试验条件所致。同时,遗传毒性评估应最好使用制剂(寡核苷酸成分和递送系统),而不是仅仅寡核苷酸成分,因为仅仅寡核苷酸成分透过细胞膜的能力可能有限。生殖毒性:寡核苷酸类药物的生殖毒性应根据ICH S5 (R3)和S6 (R1)进行评估,开展的试验取决于寡核苷酸类药物的预期患者群体和药理学效应等。为了评估寡核苷酸类药物的靶向生殖毒性,应选择药理学相关种属,如没有相关种属或仅有猴是相关种属,可考虑采用替代物或转基因动物。剂量选择应基于所有可用的信息(例如药理学、重复毒性结果和药代动力学特征等),根据ICH S5(R3)进行确定。有关胎盘转运的信息可能有助于评估药物对胚胎和胎儿的影响。致癌性评:需考虑寡核苷酸类药物的化学修饰引起的脱靶毒性造成的致癌性,如果寡核苷酸类药物临床使用时间为6个月或以上,且具有致癌性试验的开展必要性时,可使用常规啮齿动物研究进行。化学修饰的寡核苷酸类药物可能需要两种啮齿类动物进行致癌性评价。当寡核苷酸类药物的作用机制涉及致癌相关的因素,如免疫抑制,以及遗传毒性和重复给药毒性等结果发现致癌性潜能时,致癌性试验不一定需要开展,因为即使获得阴性结果也不能消除致癌性忧虑。考虑到临床受益和风险,不开展致癌性试验也是一个可接受的选择,可开展适当的风险交流biomarkers of aging。ONTs的开发取得了显著的进展,但其非临床安全性评估目前是在逐案分析的基础上进行的,可参照ICH与selleck激酶抑制剂非临床评估相关的指南,包括S6(R1)和M3(R2)。为了评估新候选药物,包括但不限于ONTs,在考虑到传统方法的局限性的同时,必须努力研讨适当评价所需的内容。在其他国家有关ONTs的非临床安全性评估的各种研究正在进行,期望随着业界经验积累以及监管科学发展,会在未来颁布可行的针对性指南。

脂质纳米颗粒(LNP)是目前应用于核酸类药物最广泛的纳米递送载体之一,其中的关键技术在于可电离阳离子脂质的结构设计,其不但能促进纳米颗粒的形成,提高核酸包装效率,还能改善纳米颗粒的稳定性。脂质纳米颗粒递送技术能够有效解决核酸类药物进入胞内发挥药效的两大关键困难,即核酸类物质(尤其是单链RNA)容易被体内外的水解酶降解而失效的问题及带负电荷的核酸类物质难以跨过膜屏障进入胞内带来的挑战。本论文设计并合成了一系列可电离阳离子脂质,旨在筛选出一种能有效包封核酸类物质的阳离子脂质化合物,用于核酸类药物的递送。同时,还将脂质递送系统应用于以肿瘤细胞裂解物AZD2281体内实验剂量作为抗原的个性化抗肿瘤疫苗的研究中,意在运用脂质递送技术实现肿瘤抗原和核酸类佐剂的高效跨膜运输并共呈递给同一个免疫细胞,以增强机体的抗肿瘤免疫反应。第一章:概述了脂质纳米颗粒递送系统的组成及阳离子脂质的研究进展。同时对疫苗的作用原理和抗肿瘤疫苗的关键组分进行了简要阐述。第二章:可电离阳离子脂质的合成和递送效果评估。在临床批准使用的可电离阳离子脂质DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-03Heart-specific molecular biomarkers15的结构基础上,我们通过改变头部亲水基团和尾部疏水基团的结构,设计并合成了一系列结构不同的可电离阳离子脂质,同时分别辅以胆固醇、辅助脂质和PEG化脂质,与荧光素酶mRNA(Luc-mRNA)组装成脂质纳米颗粒,并通过测定荧光素酶在小鼠体内的表达情况评估所合成的可电离阳离子脂质的包装和递送效果。结果表明头部带有叔胺基亲水端与尾部带有分叉型脂肪链疏水端的可电离阳离子脂质对荧光素酶mRNA具有良好的包封率,且在小鼠体内具有较高的转染率。该工作为将来可电离阳离子脂质的设计和改造提供了宝贵的经验。第三章:脂质递送系统在个性化抗肿瘤疫苗中的应用。我们利用脂质体挤出器将4T1肿瘤细胞进行挤压裂解,制备了肿瘤细胞来源的个性化肿瘤抗原,同时选用带负电荷的核酸类佐剂poly(I:C)作为免疫刺激剂,并采用脂质递送技术将抗原和佐剂利用脂质体挤出器共组装成脂质体作为候选疫苗。免疫评估结果表明,个性化抗原和佐剂共组装成脂质体的候选疫苗能诱导小鼠分泌更高水平的特异性IgG抗体,其诱导产生的抗体也能有效识别和结合靶细胞,并激活补体系统对靶细胞产生杀伤作用。同时,该疫苗能高效激活T淋巴细胞,产生更高水平的IFN-γ和TNF-α细胞因子,诱导强烈的细胞免疫反应。此外,该疫苗在一定程度上表现出了良好的生物安全性,具有较大的临床应用价值。该研究将基于可电离阳离子的脂质递送技术应用于癌症疫苗中,为将来个性化抗肿瘤疫苗的研究和开发提供新的更多思路和重要的参考。

脂质纳米颗粒(LNP)是目前应用于核酸类药物最广泛的纳米递送载体之一,其中的关键技术在于可电离阳离子脂质的结构设计,其不但能促进纳米颗粒的形成,提高核酸包装效率,还能改善纳米颗粒的稳定性。脂质纳米颗粒递送技术能够有效解决核酸类药物进入胞内发挥药效的两大关键困难,即核酸类物质(尤其是单链RNA)容易被体内外的水解酶降解而失效的问题及带负电荷的核酸类物质难以跨过膜屏障进入胞内带来的挑战。本论文设计并合成了一系列可电离阳离子脂质,旨在筛选出一种能有效包封核酸类物质的阳离子脂质化合物,用于核酸类药物的递送。同时,还将脂质递送系统应用于以肿瘤细胞裂解物AZD2281体内实验剂量作为抗原的个性化抗肿瘤疫苗的研究中,意在运用脂质递送技术实现肿瘤抗原和核酸类佐剂的高效跨膜运输并共呈递给同一个免疫细胞,以增强机体的抗肿瘤免疫反应。第一章:概述了脂质纳米颗粒递送系统的组成及阳离子脂质的研究进展。同时对疫苗的作用原理和抗肿瘤疫苗的关键组分进行了简要阐述。第二章:可电离阳离子脂质的合成和递送效果评估。在临床批准使用的可电离阳离子脂质DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-03Heart-specific molecular biomarkers15的结构基础上,我们通过改变头部亲水基团和尾部疏水基团的结构,设计并合成了一系列结构不同的可电离阳离子脂质,同时分别辅以胆固醇、辅助脂质和PEG化脂质,与荧光素酶mRNA(Luc-mRNA)组装成脂质纳米颗粒,并通过测定荧光素酶在小鼠体内的表达情况评估所合成的可电离阳离子脂质的包装和递送效果。结果表明头部带有叔胺基亲水端与尾部带有分叉型脂肪链疏水端的可电离阳离子脂质对荧光素酶mRNA具有良好的包封率,且在小鼠体内具有较高的转染率。该工作为将来可电离阳离子脂质的设计和改造提供了宝贵的经验。第三章:脂质递送系统在个性化抗肿瘤疫苗中的应用。我们利用脂质体挤出器将4T1肿瘤细胞进行挤压裂解,制备了肿瘤细胞来源的个性化肿瘤抗原,同时选用带负电荷的核酸类佐剂poly(I:C)作为免疫刺激剂,并采用脂质递送技术将抗原和佐剂利用脂质体挤出器共组装成脂质体作为候选疫苗。免疫评估结果表明,个性化抗原和佐剂共组装成脂质体的候选疫苗能诱导小鼠分泌更高水平的特异性IgG抗体,其诱导产生的抗体也能有效识别和结合靶细胞,并激活补体系统对靶细胞产生杀伤作用。同时,该疫苗能高效激活T淋巴细胞,产生更高水平的IFN-γ和TNF-α细胞因子,诱导强烈的细胞免疫反应。此外,该疫苗在一定程度上表现出了良好的生物安全性,具有较大的临床应用价值。该研究将基于可电离阳离子的脂质递送技术应用于癌症疫苗中,为将来个性化抗肿瘤疫苗的研究和开发提供新的更多思路和重要的参考。

目前,传统的化疗方法不仅对患者机体产生诸多痛苦的不良反应,而且受到肿瘤多药耐药及对机体毒副作用大等缺点的限制。纳米药物递送系统是近五年化疗的主要研究方向之一。现阶段许多研究人员致力于靶向药物递送的研究,通过设计一系列肿瘤微环境刺激响应性纳米载体系统,来增加药物在肿瘤细胞内的吸收,改善肿瘤部位的生物分布和聚集,使靶向药物治疗成为可能。虽然纳米递药系统在肿瘤治疗方向的优势逐渐显现,但药物的低渗透性仍然制约纳米药物的发展。针对这一问题,我们在肿瘤微环境中构建了两种具有γ-谷氨酰转移酶(GGT)响应的纳米递药系统。其精准的靶向能力,优异的生化稳定结构以及高效的主动转运能力实现了药物的深度渗透和时空可控释放,为肝癌治疗的靶向药物递送充分奠定基础。(1)酶响应性纳米载体的优势在于能够携带抗癌药物被肿瘤细胞上的酶特异性识别和降解,在固定时间点精确调控药物的释放。利用这一特性我们制备了两种具有GGT酶响应的纳米载药系统(*GGT-TAT-PEG-PCL@DOX/DGGT-PEGPCL@CPT)。内含的靶向分子*GGT可通过触发电荷反转来增强靶向性,可实现药物在肿瘤部位的高效富集;良好的尺寸稳定性能够促进药物在体内的血液循环能力;灵敏的电荷反转性能则促进肿瘤细胞的内吞作用和转胞吞效果,以实现药物的深度递送;而可控持续的释药性能则有效提高药物的利用率,降低对机体损伤。(2)体外细胞活性水平是评判载药体系能否进一步应用于小鼠体内的重要依据。两种载药体系通过癌细胞膜表面过表达的GGT介导的信号通路内吞到HepG2细胞中,释放抗癌药物,这主要依赖于载药系统的高度靶向和药物的选择性释放。由内质网向高尔基体的胞内转运途径以及独特的跨细胞运输方式,则提高了https://www.selleck.cn/products/cb-839.html载药体Dinaciclib分子式系的主动转运能力,实现了纳米药物的深层次递送。载药系统在对癌细胞表现出较强的杀灭作用的同时对正常细胞有着较低的毒副作用,表现出良好的生物相容性。(3)活体动物实验则是验证载药系统的治疗效果以及生物安全性的一个重要环节。这两种体系均能够在肿瘤部位实现特异性富集,在荷瘤小鼠模型Oral relative bioavailability中显著抑制肿瘤细胞的有丝分裂,表现出优异的治疗效果。而对于机体重要组织和器官不会长时间富集,可通过肾脏,肝脏等进行代谢排出体外,在小鼠模型中正常组织器官并无明显损伤,表明载药系统在肝癌治疗领域有着良好的应用前景。本文构建了两种具有超敏酶响应的纳米载药平台,利用癌细胞膜表面过表达的GGT来控制载药体系的电荷反转行为,实现了纳米药物的深度递送和时空可控释放。这种方法打破了药物低渗透性的瓶颈,为靶向药物递送提供了理论依据,同时也为肝癌的治疗提供了一种可能的路径。

铜死亡是最近发现的一种由过量铜引起的调节细胞死亡形式,这种铜诱导的程序性细胞死亡形式不同于其他细胞死亡途径,包括细胞凋亡、铁死亡和焦亡。其特征为通过离子载体运输到线粒体中Cu(II)经FDX1还原为Cu(I),而数量增加的Cu(I)直接与三羧酸(TCA)循环的脂化组分(如DLAT)结合导致脂化蛋白聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定诱导蛋白质毒性应激和最终细胞死亡。研究表明铜死亡通过抑制癌细胞增殖和转移来发挥作用,槟榔导致的口腔鳞状细胞癌中,相关的槟榔碱刺激抑制铜死亡显著增加癌症相关纤维细胞的生存能力,通过促进上皮间质转化、癌症转移和化疗耐药性促进癌症进展;铜死亡可以对抗基于铂类化疗耐药性,谷胱甘肽可解毒顺铂对A549细胞的杀伤效果,而基于Cu(II)的纳米药物(Cu ET)表现出谷胱甘肽耐药细胞毒性并能有效逆转顺铂耐药。多西他赛是一种紫杉醇的半合成类似物,和强的松联合使用已成为晚期前列腺癌的一线标准化疗,其细胞毒性作用主要是通过结合到微管蛋白并抑制其解聚,使细胞无法分裂,发生细胞周期阻滞。然而超过一半的患者对多西他赛没有反应,而那些反应良好的患者经常经历显著的累积毒性发生耐药从而限制药物剂量持续时间和强度。癌细胞对抗化疗药物耐药性与代谢重编程有关,代谢可塑性使癌细胞能够增加对厌氧糖酵解代谢的依赖激活线粒体呼吸,对铜死亡高度敏感;在化疗药物和铜死亡双重压力下,癌细胞面临相反的压力,有助于防止癌细胞中耐药性的发展。总的来说,我们的研究揭示了铜死亡在前列腺癌中的一种新的抑制肿瘤增殖功能,通过DLAT/m TOR通路抑制自噬进而增强前列腺癌细胞对多西他赛化疗敏感性,可能会为癌症CRM1抑制剂的治疗提供新的见解。本研究由以下三部分组成:第一部分铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖及增强多西他赛药物敏感性目的:探讨铜离子对前列腺癌细胞系活力的影响,分析其是否增强多西他赛治疗前列腺癌的敏感性。方法:1.CCK8实验检测伊利司莫-氯化铜和多西他赛对PC-3和22RV1两种前列腺癌细胞系的抑制增殖的能力。2.CCK8实验和克隆形成检测铜离子螯合剂四硫钼酸盐(TTM)对前列腺癌细胞系抑制增殖的能力,Western blot检测铜死亡相关蛋白表达水平。3.实时定量PCR(q RT-PCR)分析药物处理后的前列腺癌细胞和TCGA数据库前列腺腺癌(PRAD)队列铜死亡基因表达情况筛选出差异性基因并在收集的前列腺癌和癌旁组织中验证;克隆形成和CCK8实验检测过表达该基因对前列腺癌细胞增殖能力的影响。结果:1.伊利司莫-氯化铜抑制前列腺癌细胞增殖,增强多西他赛的药物敏感性CCK8结果显示,伊利司莫-氯化铜对两种PCa细胞系(PPI3K/Akt/mTOR抑制剂C-3和22RV1)均以剂量依赖性的方式抑制细胞生长.多西他赛作为单药同样抑制了PC-3和22RV1细胞的增殖。伊利司莫-氯化铜与多西他赛的联合作用结果显示两种细胞系中加入铜离子均能明显增强多西他赛的药物作用。这表明铜和铜离子载体可以抑制前列腺癌细胞系的增殖,与多西他赛联合使用可增强多西他赛对前列腺癌细胞生长的抑制作用。2.伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖CCK8和克隆形成结果显示,相对于较低剂量的伊利司莫-氯化铜有效抑制前列腺癌细胞系的增殖,用高剂量的铜螯合剂四硫钼酸盐(TTM)才能抑制两种PCa细胞系的sports and exercise medicine生长;而用较低剂量的TTM螯合铜离子可明显逆转伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞增殖抑制作用。进一步Western blot结果显示随着伊利司莫-氯化铜剂量的增加铜死亡标志蛋白DLAT、HSP70表达逐渐增强,而脂酰化蛋白Lip-DLAT的含量依次减弱。这些结果表明伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖。3.铜死亡促进DLAT的表达增强前列腺癌细胞对多西他赛的药物敏感性q RT-PCR结果显示与对照组和多西他赛组相比,伊利司莫-氯化铜组与药物联合组基因表达趋势相同且有显著差异性的基因仅有Lias、DLAT,结合TCGA数据库前列腺腺癌(PRAD)中相关铜死亡基因表达水平,最终确定铜死亡促进DLAT的表达。q RT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,DLAT在PRAD组织中低表达。使用慢病毒在PC-3细胞中过表达DLAT,CCK8和克隆形成结果显示过表达DLAT可以抑制前列腺癌细胞的增殖,与多西他赛联合使用可增强多西他赛对前列腺癌细胞杀伤作用。表明伊利司莫-氯化铜诱导的铜死亡促进DLAT的表达以增强多西他赛的药物敏感性。小结:伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖,铜死亡促进DLAT的表达增强多西他赛药物敏感性。第二部分DLAT介导铜死亡抑制多西他赛诱导的自噬增强前列腺癌细胞对多西他赛药物敏感性目的:研究伊利司莫-氯化铜增强前列腺癌细胞多西他赛药物敏感性的作用机制。方法:1.利用Western blot检测多西他赛、伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞自噬相关蛋白表达。2.克隆形成、细胞周期流式检测和透射电镜检测伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞自噬的作用。3.q RT-PCR和Western blot检测过表达DLAT或敲低DLAT对前列腺癌细胞自噬相关蛋白表达的影响。4.细胞周期流式检测和透射电镜验证DLAT对细胞自噬的作用。结果:1.伊利司莫-氯化铜逆转多西他赛诱导的自噬相关蛋白的表达水平Western blot检测结果显示随着多西他赛浓度梯度及时间梯度增加,自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平逐步增加,P62蛋白水平依次减少。而随着伊利司莫-氯化铜剂量的增加LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平发生逆转,在加入铜螯合剂TTM后这种逆转作用被拮抗。以上结果表明,随着浓度及时间梯度增加,多西他赛可以诱导自噬相关蛋白的表达,而伊利司莫-氯化铜可逆转这种作用。2.伊利司莫-氯化铜通过抑制自噬增强前列腺癌细胞对多西他赛药物敏感性透射电镜对特征自噬小体超微结构分析结果显示,前列腺癌细胞经多西他赛药物刺激后诱导的自噬小体明显增加,而伊利司莫-氯化铜明显抑制自噬小体形成。克隆形成和细胞周期流式检测结果显示,在PC-3和22RV1细胞中,伊利司莫-氯化铜抑制前列腺癌细胞集落的增殖和促进细胞阻滞于G2/M期,与多西他赛联合治疗显著减少了集落数量和使大部分细胞阻滞于G2/M期。这表明伊利斯莫-氯化铜复合物通过铜死亡的方式抑制多西他赛诱导的自噬增加药物的敏感性。3.DLAT参与多西他赛调节前列腺癌细胞自噬q RT-PCR和Western blot结果显示,与BPH-1相比,LNCa P、22RV1及PC-3三个细胞系DLAT表达水平均降低,但PC-3表达水平最低,22RV1表达水平相对最高。进而在PC-3细胞中过表达DLAT,在22RV1细胞中敲低DLAT,结果显示过表达DLAT可抑制多西他赛诱导的LC3Ⅱ表达,相反敲低DLAT增加LC3Ⅱ表达水平,表明DLAT表达水平可以介导自噬相关蛋白的表达。4.DLAT促进细胞阻滞于G2/M期进而增强多西他赛药物敏感性透射电镜和细胞周期流式检测结果显示,在22RV1细胞中敲低DLAT,阻滞于G2/M期的细胞数量下降,而在PC-3细胞中过表达DLAT明显减少自噬小体的数量,进而促进细胞阻滞于G2/M期,联合多西他赛治疗时更进一步促进大多数细胞阻滞于G2/M期。以上结果表明,过表达DLAT通过抑制自噬增强多西他赛药物敏感性。小结:伊利司莫-氯化铜通过促进DLAT表达抑制自噬相关蛋白表达,进而增强前列腺癌细胞多西他赛药物敏感性。第三部分铜死亡通过DLAT/m TOR通路抑制自噬增强前列腺癌化疗敏感性目的:探讨DLAT介导多西他赛诱导自噬相关蛋白表达水平增强多西他赛药物敏感性的机制研究。方法:1.利用Western blot实验检测自噬信号通路相关蛋白的表达水平,使用m TOR抑制剂雷帕霉素处理前列腺癌细胞并检测自噬相关蛋白的变化。2.构建裸鼠异种移植荷瘤模型,检测伊利司莫-氯化铜和多西他赛同时对PCa细胞肿瘤生长的影响。结果:1.DLAT促进m TOR磷酸化抑制自噬相关蛋白表达Western blot检测结果显示,多西他赛处理前列腺癌细胞后PI3K、AKT以及ERK磷酸化水平变化不明显,p-m TOR显著降低,进一步促进LC3Ⅱ表达;反之,在伊利司莫-氯化铜和过表达DLAT处理后,p-m TOR显著升高进而抑制LC3Ⅱ表达,而用m TOR通路抑制剂雷帕霉素处理,p-m TOR磷酸化水平被阻断,LC3Ⅱ表达水平再次升高。2.体内实验证实伊利司莫-氯化铜增强多西他赛抑制前列腺癌细胞增殖的能力在BALB/c裸鼠背侧皮下注射人源性前列腺癌PC-3细胞构建异种移植瘤模型。荷瘤成功后,每3天腹腔注射伊利司莫-氯化铜和或多西他赛,5个周期后处理小鼠取肿瘤组织。结果显示伊利司莫-氯化铜显著抑制移植肿瘤的生长,而联合多西他赛处理可进一步抑制肿瘤的进展。Western blot实验结果显示加入伊利司莫-氯化铜明显减少Lip-DLAT的表达和增加DLAT、HSP70的表达进而抑制LC3Ⅱ表达,免疫组化分析得到类似的结果。以上结果表明联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低PC-3异种移植瘤的自噬水平和抑制肿瘤进展。小结:DLAT靶向激活m TOR磷酸化进而抑制自噬相关蛋白表达;体内实验显示联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低异种移植瘤的自噬水平和抑制肿瘤进展。结论:1.伊利司莫-氯化铜诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖,增强多西他赛药物敏感性。2.伊利司莫-氯化铜通过促进DLAT表达抑制自噬相关蛋白表达,进而增强多西他赛药物敏感性。3.DLAT促进m TOR磷酸化进而抑制自噬相关蛋白表达;联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低异种移植瘤的生长和细胞自噬,抑制肿瘤进展。

腘绳肌拉伤是短跑训练中常见的运动损伤之一，因此，要了解腘绳肌在短跑项目中的重要性、短跑中腘绳肌拉伤的机制以及基础预防拉伤的措施。笔者选取南京体育学院15名运动训练DNA/RNA Synthesis抑制剂专业田径专项的学生，分为两组，有腘绳肌拉伤史的为第一组，无腘绳肌损伤史的为第二组，两组进行功能性动作筛查（FMS）。研究得知，田径专项学生发生腘绳肌拉伤的占53.33%；受测学生中FMS总评分低于14分的有12人，占总人数的81.00%；有腘绳肌拉伤史的组平均总评分为（10.83±1.63）分，无腘绳肌拉伤史的组CL13900浓度平均总评分为（13.74±1.95）分，所以第一组运动员和第二组运动员之间有显著性差异（P<0Aortic pathology.05）；在有腘绳肌拉伤史的学生中，主动直腿上抬动作和旋转稳定性动作得分偏低；从动作模式的角度来看，腘绳肌柔韧性差可能不是腘绳肌产生损伤的主要因素，骨盆和核心稳定性弱，对侧腿髋伸展性与灵活性的不足，左右两侧动作模式的不对称才是腘绳肌拉伤的主要原因。

目的 巨噬细胞是一群表型和功能均具有高度异质性的免疫细胞，其贯穿整个组织修复过程。在一定条件下，表现出不同表型和功能分化的现象称为巨噬selleckchem CL13900细胞极化，可转化成M1型巨噬细胞（经典激活的巨噬细胞）和M2型巨噬细胞（选择性激活的巨噬细胞）。本文主要研究巨噬细胞的极化是否参与在宫腔粘连的子宫内膜修复过程。方法 选择2020年至2021年在本院生殖中心行IVF治疗，移植失败一次及以上的患者对照组、实验组宫腔粘连轻度组、宫腔粘连中度组，移植失败一Staurosporine次及以上的患者，行宫腔镜下子宫内膜搔刮术，宫腔粘连各组同时行宫腔镜下宫腔粘连松解术，子宫内膜组织行CD68、CD163、VEGF免疫组化。结果 流产清宫次数在三组中存在显著性差异（P<0.05），三组在年龄、BMI、不孕时间、分娩次数、异位妊娠次数方面无显著差异（P>0.05）。对照组CD68阳性率为93.3%(28/30),CD163阳性率为33.3%(11/30),VEGF阳性率为3.3%(1/30)。宫腔粘连轻度组CD68阳性率为53.3%(16/30),CSpectrophotometryD163阳性率为46.7%(14/30),VEGF阳性率为23.3%(7/30)。宫腔粘连中度组CD68阳性率为3.3%(1/30),CD163阳性率为96.7%(29/30),VEGF阳性率为100%(30/30)。相关性分析结果显示三组均存在显著性差异（P<0.05）。结论 宫腔粘连的子宫内膜组织中，巨噬细胞发生极化，并促使VEGF等细胞因子形成一个动态的变化，促排组织的修复再生。

immediate breast reconstruction巨噬细胞是一种具有高度异质性和可塑性的免疫细胞，可在不同微环境下极化为促炎的M1型和抗炎的M2型，其极化状态的失调与多种疾病的形成和发展更多密切相关。间充质干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞，其免疫调节特性受到了人们的广泛关注。外泌体作为间充质干细胞的旁分泌效应物，具有调节巨噬细胞的分化、趋化，分泌炎性因子和改善炎症微环境的能力，在疾病治疗中发挥重要作用。本文介绍了间充质干细胞源性外泌体调节巨噬细胞的机制，分析了其在疾病中的具体应用与应用前景，并认为间充质干细胞源性外泌体可通过其包含的生物活性物质调节巨噬细胞极化来发挥治疗作用。此外，Erastin说明书通过预处理的方式改变间充质干细胞源性外泌体的生物学特性，可使其在不同的疾病中发挥理想的疗效。

蜜蜂在世界范围内作为主要的农业传粉昆虫,对农作物产量的提升具有重要意义。每年我国都由于受到蜜蜂病毒病的流行与爆发而损失大量蜂群,其中蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)作为蜜蜂病毒的代表之一,由于其世界范围广泛存在,并通过与多种病原联合危害野生及饲养蜂群,是导致蜂群数量不断下降的一个主要因素。众所周知,RNA蜜蜂病毒具备寄主寿命短、突变率高以及跨物种传播的特点,蜜蜂残翼病毒存在于多种昆虫中,如狄斯瓦螨(Varroa destructor)、蜂箱小甲虫(Aethina tumida)、熊蜂(Bombus Spp.),以及蜂群周围的蜜源植物,是研究蜜蜂病毒跨种传播和感染的极佳材料。为此,利用基因组学和蛋白组学的相关技术,深入研究蜜蜂残翅病毒在蜜蜂与开花植物间的差异,将为研究蜜蜂病毒跨物种传播、感染机制研究奠定了基础。本研究具体结果如下:(1)三种植物中叶子花BSW(Bougainvillea spectabilis Willd.)、迎春花JNL(Jasminum nudiflorum Lindl.)和紫藤WS(Wisteria sinensis)的蜜蜂残翅病毒核苷酸序列分析显示,DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS全长分别为10140bp、10141bp以及10140bp,GC含量分别为38.43%、38.29%、38.63%,编码开放阅读框分别为3个、1个、1个,与其他28种DWV病毒株相比,DWV-BSW、DWV-JNL和DWV-WS的核苷酸序列同一性分别为76.3%-97.4%、76.3%-97.4%以及76.0%至96.9%。(2)DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS氨基酸序列显示,DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS开放阅读框分别编码2893、2891以及2893个氨基酸,其中包含结构蛋白与非结构蛋白。DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS三者基因组结构与参考基因组基本相似,开放阅读框中先导蛋白(Leader protein,Lp)区域的核苷酸同一性差异显著,DWV-BSW、DWV-JNL和DWV-WS的平均同一性分别为86.97%、87.32%和86.97%。(3)DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS系统发育树显示,DWV-BSW、DWV-JNL、DWB-WS在地理分布的亲缘关系上与DWV-2Cmedical cyber physical systems1、DWV-Liao Ning1、DWV-He Bei1、DWV-Jiang Xi1同属中国地区的病毒株形成一个分支;在基因型方面DWV-BSW、DWV-JNL、DWB-WS属于DWV-A型,其中DWV-A型在亚洲、欧洲、美洲均有分布,DWV-B型主要在欧洲分布,而DWV-C型仅在英国有所发现。物种多样性方面,DWV-A型存在广泛是DWV跨物种传播的主力,DWV-B型则以意大利蜜蜂为主要寄主。(4)DWV-BSW、DWV-JNL、DWV-WS重组分析显示,检测到在DWV-BSW、DWV-JNL以及DWV-WS三条全基因组序列中发生的重组事件共有11个(5个事件可信度高)。其中DWV-BSW在VP1、Helicase、VPg、3C-Pro Rd Rp以及3’UTR区域推测发生重组事件,DWV-WS则集中在VP3、VP4、VP1三个区域,而DWV-JNL与DWV-BSW情况相似,但其特殊之处在5’UTR(761-1877)断点位置处出现重合,可见重组事件基本涵盖了整个全基因组序列。(5)BSW、JNL、WS三种植物各组织中DWV分布的调查结果显示,在三种植物的花、叶、茎三个组织中均能检测到DWV,且花组织的检测阳性概率明显大于叶、茎组织,表明DWV可能在蜜蜂向植物传播过程中受花朵大小和颜色的影响。(6)采用蔗糖密度梯度离心法对三种植物中DWV进行分离纯化,并采用透射电镜观察以及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果显示,WS中存在与蜜蜂体内DWV相似的VP1确认细节、VP2、VP3结构蛋白。最后经过LC-MS/MS质谱分析,共鉴定到病毒蛋白41个,鉴定到的肽类片段与DWV-2C1具有最高的同一性(24.1%),肽类片段与DWV-WS、DWV-2C1之间共27个氨基酸位点发生突变。(7)使用人工注射病毒液的方法,我们比较了纯化后DWV-WS和DWV-BEE的毒力,并量化两者对蜜蜂的危害程度。结果表明,随着DWV-WS和DWV-BEE两种病毒注射后,蜜蜂白眼蛹的羽化率以及DWV病毒拷贝量并无明显差异,DWV-WS与DWV-BEE具有相似毒力。综上所述,三种植物中的DWV分离株,其全基因组序列、病毒蛋白结构、病毒类型以及毒力方面均与更多DWV-2C1病毒株相似,表明植物中DWV极有可能由同一地区蜜蜂中的DWV演变进化而来,两者间比对形成的27个氨基酸突变位点,可能是DWV突破植物自身免疫机制,进而感染植物细胞的重要位点。

野生二粒小麦是栽培四倍体及六倍体小麦的野生祖先种,因其具有籽粒大、蛋白含量高、耐逆性强等优良特性,一直是小麦遗传改良的重要的二级种质库。RNA的N~6-腺嘌呤甲基化修饰,简称为m~6A,是生物体中最保守和最广泛存在的一种RNA修饰方式,在植物器官建成、生长发育、逆境响应等方面均发挥着重要调控作用。但目前,有关野生二粒小麦m~6A相关基因的报道,尤其是参与调控盐胁迫响应的研究还比较少。鉴于此,本研究利用生信分析方法,在全基因组水平鉴定、分析了野生二粒小麦中m~6A调控家族成员;结合其在盐胁迫下的表达特性,构建了共表达网络,鉴定、发掘参与盐胁迫响应的7个耐盐共表达模块和9个核心m~6A调控基因;对关键候选基因TdFIP37功能缺失性突变体的耐盐性进行了鉴定,结合RNA-seq分析,初步明确了其生物学功能;此外,还基于direct RNA sequencing技术分析了盐胁迫下的表达谱和转录特征,初步分析了野生二粒小麦在盐胁迫下的m~6A甲基化特征,为深入揭示m~6A调控野生二粒小麦耐盐性的分子机制奠定了基础。主要研究结果如下:1)野生二粒小麦m~6A调控基因家族的全基因组鉴定。利用HMM search和BLASTP工具在全基因组水平对野生二粒小麦m~6A调控机器的编码器(writer)、读码器(reader)以及解码器(eraser)家族进行了系统鉴定。通过分析,共鉴定到了64个候选基因,包括21个writer,17个eraser和26个reader;系统进化分析可将它们分为3个亚群,每个亚群具有相似的蛋白质结构域和保守基序组成;共线性分析表明,片段重复和多倍体化引起m~6A基因在野生二粒小麦基因组中显著扩增;顺式元件预测发现,MBS、LTR、ABRE等参与响应胁迫和激素调节的顺式作用元件在其启动子大量存在,暗示其可能参与调控了野生二粒小麦逆境响应和生长发育;最后,利用重测序数据,对m~6A基因在四倍体小麦群体中的遗传变异和分化进行分析,其在野生二粒小麦和栽培二粒小麦群体的Pi分别为4.18E-06和3.77E-06,遗传分化指数为0.262,表明在二粒小麦驯化过程中,m~6A基因发生了明显的遗传瓶颈效应。2)盐胁迫相关m~6A调控基因的发掘及其调控网络分析。基于耐盐品系A5和盐敏感品系C2在正常和盐胁迫条件下不同时间点的54个RNA-seq数据集,对上述所鉴定的m~6A基因的在盐胁迫下的表达谱进行了分析,通过时空序列分析,筛选得到13个盐胁迫下差异表达m~6A基因,其中9个上调表达,4个下调表达,初步获得了盐胁迫响应相关的m~6A基因;进一步基于RNA-seq数据构建了共表达调控网络,结合功能富集分析,筛选了7个盐胁迫显著相关的关键共表达模块,挖掘了9个响应盐胁迫关键候选m~6A调控基因,得到了m~6A参与介导的盐胁迫响应相关调控网络。3)Tdfip37的耐盐性鉴定和转录组分析。从四倍体EMS突变体库中筛选到了关键候选基因FIP37的功能缺失性突变体,对其耐盐性进行鉴定,发现相比于野生型,突变体对盐胁迫敏感,耐盐性显著降低;利用RNA-seq对其盐胁迫和正常条件下的表达谱进行分析,发现盐胁迫处理后,Tdfip37突变体的基因表达水平较WT变化更大,共5910个差异表达基因,其中3691个上调DEGs,2219个下调DEGs,且富集到大physical medicine量酶活性、氨基酸代谢、激素响应等参与调控盐胁迫的功能。4)野生二粒小麦在盐胁迫下的m~6A及转录特征分析。利用Nanopore的RNA Direct Sequencing技术,对B5品系响应盐胁迫的m~6A位点及表达谱进行了分析,共鉴定m~6A位点46009个,分布于野生二粒小麦的14条染色体上,其中染色体5A最多,为3918,其次是5B,为3842,其特征基序是ATCTC,发生m~6A甲基化的转录本显著富集到大量响应盐胁迫的通路与功能条目,如植物激素信号转导、高渗盐度反应、钾离子跨膜转运等。同时,还鉴定到了m~5C修饰位点1849585个。关联转录本表达量及m~6A甲基化状态,鉴定得到3356个差异表达转录本经盐胁迫处理后发生甲基化,结合同源基因功能注释筛选响应盐胁迫的关键差异表达转录本68个,并构建蛋白质互作网络。此外,通过DRS测序,还发现了新基因2475个、新转录本26779个,预测到转录因子693个,应用CNCI分析、CPC2、pfam蛋白结构域分析三种方法预测到的共同lncRNA1318个;盐胁迫处理后,pNirogacestat IC50olyA尾长整体BMS-907351纯度水平变高,可变剪切事件数目增加。综上所述,本研究挖掘了野生二粒小麦m~6A调控基因和响应盐胁迫的关键基因模块和核心基因,为揭示m~6A调控野生二粒小麦耐盐性的作用机制,为四倍体小麦和普通小麦的耐盐性遗传改良提供了靶标基因。