MAPK信号通路

目的 了解核苷（酸）类似物治疗应答不佳的慢性乙型肝炎患者体内HBV的动态变化，以帮助指导治疗方案的调整以及新药的合成。方法 抽提同一患者多个时间点（≥arsenic biogeochemical cycle2个，至少间隔3个月）的血清HBV Staurosporine试剂RNA，进行高通量测序，构建系统发育树，计算遗传距离，分析耐药突变，推算HBV在治疗应答不佳患者体内的动态复制过程。结果 在治疗应答不佳的患者体内可以观察到HBV的进化及耐药突变体的出现，进化树的拓扑结构明显，遗传距离增加，且遗传距离的改变与血清HBV DNA水平变化一致；最大似然树更适合推断病毒的复制，而邻接树则更适合推断感染细胞的克隆增殖；某些病毒突变体可在应答不佳患者体内长期持续存在。结论 系统发育分析可以很Q-VD-Oph使用方法好地检测宿主体内HBV的复制动态，在实际研究中应当根据研究目的选择合适的建树方法。

2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU作为一种新颖的羟化酶,具有较广的芳香族化合物底物谱,对多种氯酚类和联苯类底物均有一定的催化活性。课题组前期通过对TfdB-JLU底物非专一性(substrate promiscuity)与蛋白结构之间关系的研究,利用半理性设计对其催化氯酚类和联苯类底物的非专一性实现了调控。近期研究发现,TfdB-JLU还可以催化多种吲哚类杂环芳香化合物,但目前尚不清楚其催化机制,具有实际应用价值的吲哚生物催化转化体系也鲜有报道。本研究一方面通过对TfdB-JLU的结构及其与吲哚之间的相互作用分析,选择可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性中心的氨基酸作为突变位点,通过对野生型及其突变体进行表达、纯化、酶活检测,结合分子动力学模拟研究,对TfdB-JLU催化吲哚的机制进行了初步探究;另一方面考虑到酶促吲哚生物转化过程中酶纯化过程繁琐、耗损率高和需要额外添加昂贵的辅酶等因素,本研究探讨了以TfdB-JLU工程BAY 73-4506供应商菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化路径,并对转化条件进行了优化,为探索TfdB-JLU催化吲哚生物转化的实际应用提供了可能性。本研究的主要内容和研究结果如下:(1)2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU催化吲哚的研究以2-羟基联苯-3-单加氧酶(PDB ID:5BRT)的晶体结构为模板进行同源模建得到TfdB-JLU的结构,利用Auto Dock 4.2与吲哚进行分子对接;基于分子对接结果选择了His47、Met251、Pro316这三个可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性口袋的位点进行单点和组合突变,对TfdB-JLU的野生型和突变体进行表达、纯化和酶活检测,发现与野生型相比,突变体M251G和P316G提高了对吲哚的催化活性,而突变体H47A、M251G/P316G则基本丧失了对吲哚的催化活性。通过分子对接结果推测,突变体P316G催化吲哚活性提高的原因可能是酶与吲哚之间的价键作用增加,提高了与吲哚的亲和力;突变体M251G催化吲哚活性提高的原因可能是突变后酶活性口袋的入口变大,更有利于底物的进入;突变体H47A催化吲哚活性基本丧失,说明47位的组氨酸可能是TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一。通过对野生Staphylococcus pseudinter- medius型和突变体的分子动力学模拟研究推测组合突变体M251G/P316G催化吲哚活性大幅降低的原因可能是突变对活性口袋附近的结构柔性改变太大导致酶的稳定性降低。(2)TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的研究本研究建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,并对转化条件进行了优化,以提高吲哚转化靛蓝的效率。结果表明TfdB-JLU工程Cobimetinib作用菌的全细胞催化能够将吲哚转化为靛蓝,靛蓝的起始产率为11.9%;对转化条件进行优化后的最适条件为:培养基为M9培养基,诱导时间为8 h,吲哚浓度为2.5 m M,反应温度为25℃,反应时间为16 h,反应p H为9,在此条件下TfdBJLU工程菌催化吲哚转化靛蓝的产率达到35.7%。综上所述,本研究运用蛋白质工程和生物信息学手段对TfdB-JLU催化吲哚进行了初步研究,发现酶局部结构变化会对TfdB-JLU与吲哚的结合方式、结合能力和酶的稳定性产生影响,进而影响其催化吲哚的能力,同时发现47位的组氨酸可能是影响TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一,为TfdB-JLU催化吲哚机制的解析奠定了一定基础;本研究也建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,将对吲哚类废水的处理和资源化转化具有重要意义。

背景和目的:葛根素作为从中药野生葛根中提取的天然活性产物,因其在临床应用上表现出多靶点作用,目前广泛用于多种心血管疾病的治疗,如动脉粥样硬化、缺血性心肌病、心肌肥厚以及心律失常等。研究显示,葛根素可有效改善脓毒症引起的心肌损伤,但其心肌保护作用的机制研究并不全面,目前认为主要与抑制炎症反应及氧化应激等机制有关。铁依赖性铁死亡是一种新发现的脂质氧化调控的细胞死亡模式,与传统的细胞死亡模式不同,其发生机制主要是与铁死亡促进剂(Erastin)抑制胱氨酸进入细胞内有关,导致谷胱甘肽耗竭和谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)失活,进而大量Fe~(2+)进入线粒体,产生大量活性氧(ROS),最终导致细胞死亡。已证实铁死亡在多种原因引起的心肌损伤中起着关键作用,如糖尿病心肌病、缺血性心肌病以及脓毒症心肌损伤等。研究显示,脓毒症发生后,脂多糖(LPS)通过与位于免疫细胞及其它细胞上的Toll样受体(TLRs)相互作用,从而促使机体产生大量炎性细胞因子,影响线粒体内氧化呼吸链的偶联过程,进一步导致ROS的增多从而促进氧化应激反应发生对心肌细胞造成损伤,同时,ROS的蓄积又可引起铁死亡的发生,从而导致了细胞死亡。因此,抑制铁死亡的发生发展可改善脓毒症心肌损伤。目前认为,多种信号通路均可调控铁死亡的发生,其中AMPK信号通路是其调控通路之一,激活该通路可抑制铁死亡的发生发展。而研究显示,葛根素可通过激活AMPK信号通路进而改善多种心肌疾病,包括病理性心肌肥厚和心肌缺血损伤等。因此,我们推测葛根素可以通过活化AMPK信号通路进而抑制炎症反应、氧化应激以及铁死亡的发生从而减轻LPS诱导的心肌损伤。综上所述,本研究的目的是首先通PEG300说明书过离体细胞明确葛根素对脓毒症心肌损的保护作用,并进一步通过在体动物实验验证葛根素是否通过活化AMPK信号通路抑制铁死亡改善脓毒症心肌损伤,为明确其作用机制提供理论依据。方法:1.第一部分:葛根素对LPS诱导的H9c2细胞毒性损伤的保护作用。根据处理方法不同,将H9c2细胞分成5组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)、脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂(LPS+Pue+Era组)以及脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C(LPS+Pue+CC组)。测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平以及铁离子含量;观察细胞活力以及细胞凋亡情况;测定心肌细胞中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)以及磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平。2.第二部分:葛根素抑制铁死亡介导的脓毒症心肌损伤。将36只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)和脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂(LPS+Pue+Era组)。除对照组腹腔注射等量生理盐水外,分别使用葛根素(Pue)以及葛根素联合铁死亡促进剂(Era)对脓毒症大鼠进行处理;采样前行超声心动图评估心功能;测定血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(c Tn I)及乳酸脱氢酶(LDH)的水平以及大鼠心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化酶(MDA)的活性;观察心肌组织的病理变化;测定心肌组织中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、铁蛋白(Ferritin)、转铁蛋白受体(TFR)PD-0332991研究购买、磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平以及铁离子含量;测定凋亡蛋白(Cleaved-caspase3)Isolated hepatocytes、促凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达水平;TUNEL法染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况。3.第三部分:葛根素通过激活AMPK信号通路抑制铁死亡。将12只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)和脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C(LPS+Pue+CC组)。分别使用Pue以及Pue联合AMPK抑制剂Compound C(CC)对脓毒症大鼠进行处理。测定心肌组织中铁蛋白(Ferritin)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、转铁蛋白受体(TFR)、磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平以及铁离子含量。结果:1.第一部分:1.1葛根素可以改善LPS诱导的H9c2细胞损伤,降低LDH及TNF-α的水平,减少细胞凋亡,上调GPX4的表达水平并降低铁离子含量。1.2葛根素的脓毒症心肌保护作用可被铁死亡促进剂Era以及AMPK抑制剂CC废除。2.第二部分:2.1葛根素可以下调大鼠血清中心肌损伤标记物CK-MB、LDH和c Tn I的浓度。并且通过观察HE切片发现,葛根素可以减轻LPS诱导的心肌组织损伤。2.2葛根素可以改善LPS模型大鼠的左室射血分数和左室短轴收缩率。葛根素可以抑制LPS诱导的炎症反应,并且可以下调炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α的表达。葛根素可以抑制LPS诱导的氧化应激反应,上调抗氧化指标GSH和SOD的表达以及抑制脂质过氧化指标MDA的表达。2.3检测各组大鼠凋亡相关蛋白和观察TUNEL染色结果,结果显示葛根素可以促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并抑制凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Bax的表达,进而减少心肌细胞凋亡。2.4葛根素可以促进LPS大鼠模型心肌组织中GPX4和Ferritin的表达,并且抑制ACSL4和TFR的表达。此外葛根素还可促进心肌组织中AMPK的磷酸化,并且铁死亡促进剂Era对AMPK的磷酸化无影响。铁死亡促进剂Era可抑制葛根素的抗炎、抗氧化应激和抗凋亡作用。3.第三部分:3.1葛根素提高了脓毒症大鼠心肌组织中AMPK磷酸化水平。3.2 AMPK抑制剂CC促进了脓毒症心肌组织中铁死亡的发生,且其可废除葛根素对铁死亡的抑制作用。结论:1.离体细胞实验及在体动物实验均证实葛根素可以通过抑制LPS诱导的心肌细胞铁死亡的发生,进而对脓毒症心肌损伤产生保护作用并改善心脏功能。2.葛根素可以上调脓毒症心肌细胞毒性损伤模型中AMPK的磷酸化水平。3.铁死亡促进剂Era和AMPK抑制剂CC均可有效废除葛根素对脓毒症心肌损伤的保护作用。4.葛根素可通过调控AMPK调控的铁死亡信号通路对脓毒症心肌损伤进行保护。

研究背景及目的:人类乙型肝炎病毒(HBV)能够感染人类宿主并引发慢性持续感染,可能导致感染者出现肝炎、肝硬化、肝细胞癌,严重威胁人类生命健康。HBV基因组编码的乙肝病毒X蛋白(HBx),是一种具有多种调节功能的蛋白,参与宿主信号转导调节、基因转录、蛋白质降解等过程,在HBV高效复制、基因组整合、逃逸宿主免疫反应中发挥重要生物学功能,对HBV感染、疾病慢性化以及肿瘤的发生有重要意义。I型长弥散核元件(LINE-1)是人体细胞中唯一已知具有自主转座活性的非LTR逆转录元件,在基因组进化、基因组稳定性以及宿主天然免疫反应中均具有重要生物学意义。有关HBV与逆转录元件之间是否存在直接相互作用,目前仍缺乏广泛的证据。LINE-1在复制过程中可以破坏DNA的稳定性并激活干扰素信号系统,两者均可对HBV的感染复制及整合过程产生负面影响。作为应对措施,HBV可能会利用自身蛋白来抑制LINE-1的逆转座活性。HBx作为一种多功能调节因子,其C端功能区更是具有结合RNA、DNA能力,提示HBx蛋白作为HBV的重要组成成分,极有可能对LINE-1的活性存在调控作用,相关研究成果对深入考察HBV、LINE-1、天然免疫系统三者之间的关系将产生明确的指导作用。本研究拟聚焦HBx与LINE-1,围绕HBx是否影响LINE-1活性展开研究,逐步探讨HBx蛋白与LINE-1之间的相互作用、可能机制及其生物学意义。研究方法:1、考察HBx蛋白对LINE-1逆转座活性的影响:采用学术界广泛使用的、依赖报告基因表达的LINE-1逆转座活性实验,通过流式细胞学检测、Western blotting等实验方法,考察HBx是否影响LINE-1的活性。2、探索HBx蛋白调控LINE-1活性的分子机制:LINE-1的复制分为RNA转录、蛋白表达、RNP组装、TPRT及整合五大步骤。因此,通过Western blotting、Luciferase、co-IP、qRT-PCR等实验方法,分别考察HBx是否对LINE-1 5’-UTR启动子活性,LINE-1RNA稳定性、LINE-1蛋白ORF1p和ORF2p的表达及稳定性、LINE-1 RNP的组装及功能以及LINE-1的整合能力产生影响,探究HBx调控LINE-1活性的具体机制。3、鉴定HBx蛋白影响LINE-1活性的关键功能区:构建HBx的不同截短体或突变体,通过上述实验考察HBx影响LINE-1活性的关键功能区,并对HBx调控LINE-1活性的分子机制进行反向验证。4、解析HBx蛋白影响LINE-1活性的生物学意义:通过Luciferase、ELISA、qRT-PCR等实验方法考察HBx、LINE-1、干扰素三者之间作用关系;通过彗星实验方法考察HBx对LINE-1破坏基因组(或ds DNA)稳定性这一功能的影响。研究结果:1、HBx蛋白具有抑制LINE-1活性的功能通过LINE-1逆转录转座试验考察HBx对LINE-1逆转录转座活性的影响,结果发现:HBx蛋白可以有效抑制LINE-1的逆转座活性,且在一定程度内,这种抑制作用具有剂量依赖性。2、HBx结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性对HBx蛋白抑制LINE-1活性的机制研究提示:HBx蛋白不影响LINE-1 5’-UTR的启动子活性;而是通过结合LINE-1 RNA,破坏LINE-1 RNA稳定性,从而下调LINE-1ORF1p和ORF2p蛋白的表达并发挥限制LINE-1活性的作用。3、HBx 120-141片段对HBx下调LINE-1逆转座活性十分重要实验结果表明,HBxΔ120-141不再能够有效结合并下调LINE-1 RNA,在对LINE-1活性抑制上也表现出功能性缺陷。4、HBx蛋白抑制LINE-1活性的现象具有潜在的生物学意义彗星实验结果表明,HBx在抑制LINE-1活性的同时,可以使基因组免于LINE-1复制过程中所产生的破坏;对细胞内干扰素表达水平的考察结果也证实,HBx可以下调LINE-1selleck产品对先天免疫系统的活化selleck合成能力。研究结论:本研究发现HBx蛋白可以识别LINE-1 RNA上的ORF1和ORF2区域,从而结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性,进而下调LINE-1蛋白的表达,最后实现对LINE-1活性的抑制;HBx 120-141区域是HBx抑制LINE-1活性的关键功能区,缺失这一区域后,HBxΔ120-141不再能够实现对LINE-1 RNA的识别与结合;通过对LINE-1活性的抑制,HBx可以保护基因组(或其它双链DNA)的稳定性免受破坏,也可以在HBV复制期间降低细胞内的干扰素水平;本研究揭示了HBx具有调控LINE-1活性的全新功能与相关分子机制,解析了这一现象的潜在生物学意义,并讨论了其对HBV感染复制的可能影响,这是本研究的创新点。后续研究将进一步解析HBx在HBV感染复制过程中的作用与机制,从而为靶向HBx的药物设计,优化抗HBV治疗策略提供sexual transmitted infection更新的角度和更有效的参考。

精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种慢性重性精神疾病,其特征在于一系列可共存的不同症状,包括幻觉、妄想、情感平淡、社交退缩和认知障碍等。目前精神分裂症的发病机制尚不十分明确,治疗手段亦有限,因此,探索精神分裂症的深层机制、寻找其治疗靶点意义深远。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类非编码RNA,通过序列特异性碱基配对与靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’端非编码区(3’UTR)相互作用以降解靶mRNA或抑制翻译,从而下调(沉默)目的基因的表达。每个miRNA都可能调节数百个靶基因的表达,因而miRNAs的功能失调,特别是这种失调发生在中枢神经系统时,临床意义是重大的,对研究疾病潜在的分子机制和开发有效的治疗方法而言都是巨大的挑战。充分证据表明miRNAs在精神分裂症的发生发展中发挥重要作用。miR-144/451是一个双顺反子miRNA基因位点,编码miR-144和miR-451两种miRNAs。大量数据表明,miR-144/451参与调控多种神经精神类疾病如抑郁症、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等,但其对精神分裂症是否有调控作用未见相关研究。基于以上背景,本研究旨在明确miR-144/451是否对精神分裂症有调控作用,并探讨可能的分子机制,为精神分裂症提供新的miRNA靶点的思路,分为以下3个部分:第一部分:miR-144/451敲除对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:通过遗传学方法繁殖小鼠获得同窝野生型(WT)小鼠和miR-144/451基因敲除(KO)小鼠并建立精神分裂症小鼠模型,明确miR-144/451敲除对精神分裂症表型是否有调控作用。方法:1.分别将同窝WT和KO小鼠随机分为conWT组、SZWT组和conKO组、SZKO组。通过连续腹腔注射14天(+)-MK-801建立精神分裂症小鼠模型,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.评估小鼠精神分裂症症状:利用旷场实验检测小鼠genetic phenomena自发活动度(阳性症状),利用前脉冲抑制实验检测小鼠感觉门控selleckchem功能状态,利用筑巢实验检测认知功能,利用强迫游泳实验检测焦虑抑郁程度(阴性症状)。3.采用原位杂交法检测conWT组和SZWT组海马区miR-144和miR-451的mRNA水平。4.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组小鼠前额叶皮质和纹状体中多巴胺含量。结果:1.旷场实验中,conWT和conKO小鼠的活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05),腹腔注射MK-801能显著增加SZWT和SZKO小鼠的活动路程和平均速度即小鼠自发活动过度(P均<0.05),而SZKO小鼠的自发活动较SZWT小鼠显著减少(P<0.05)。前脉冲抑制实验中,conKO小鼠较conWT小鼠的PPI%显著降低(P均<0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠的PPI%(P均<0.01),而在前脉冲刺激为80dB和85dB时显著升高SZKO小鼠的PPI%(P均<0.05)。SZKO小鼠的PPI%较SZWT小鼠显著升高(P均<0.05)。筑巢实验中,conWT和conKO小鼠的筑巢评分无显著差异(P>0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠筑巢评分(P<0.001),而SZKO小鼠评分较SZWT小鼠显著升高(P<0.01)。强迫游泳实验中,conWT和conKO小鼠的不动时间无显著差异(P>0.05)。MK-801注射显著延长SZWT和SZKO小鼠的不动时间(P均<0.001),而SZKO小鼠的不动时间较SZWT小鼠显著缩短(P<0.001)。2.MK-801注射显著增加SZWT小鼠海马区miR-144和miR-451 mRNA水平(P均<0.001)。3.conWT和conKO小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量无显著差异(P均>0.05)。MK-801注射显著降低SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量而显著升高纹状体中多巴胺含量(P均<0.001)。SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量的降低程度和ABT-263生产商纹状体中多巴胺含量的升高程度均显著弱于SZWT小鼠(P均<0.01)。结论:miR-144/451基因敲除后小鼠精神分裂症症状及多巴胺失调明显改善,提示其对精神分裂症有明显调控作用,同时发现腹腔注射MK-801后SZWT小鼠海马区miR-144/451 表达增加。第二部分:脑内miR-144/451过表达对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:明确脑内过表达miR-144/451对精神分裂症表型的调控作用。方法:1.将WT小鼠随机分为con组,ago组,SZ组和SZago组,通过脑立体定位注射miR-144-3p和miR-451a agomir混合物实现miR-144/451的脑内过表达,以等量miR-NC为对照。连续腹腔注射14天(+)-MK-801诱发精神分裂症症状,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.利用旷场实验检测小鼠自发活动度(阳性症状),利用筑巢实验检测小鼠认知功能。3.应用ELISA法检测小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量。结果:1.旷场实验中con组与ago组小鼠活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05)。SZago组小鼠活动路程和平均速度较SZ组小鼠显著增加(P均<0.05)。筑巢实验中con组和ago组筑巢得分无显著差异(P>0.05),SZago组和SZ组相比筑巢得分无显著差异(P>0.05)。2.con组和ago组前额叶皮质及纹状体中多巴胺含量均无显著差异(P均>0.05)。SZago组前额叶皮质中多巴胺含量较SZ组显著减少(P<0.001),纹状体中多巴胺含量较SZ组显著增多(P<0.001)。结论:脑内miR-144/451过表达加重精神分裂症症状和多巴胺失调,再次提示miR-144/451参与调控精神分裂症。第三部分:miR-144/451对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症的调控作用目的:利用自第一部分收集的前额叶皮质样本和制作的冰冻切片探讨miR-144/451 是否对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症有调控作用。方法:1.应用试剂盒检测各组小鼠前额叶皮质中丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)的含量,进一步应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠前额叶皮质中抗氧化酶包括NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1)、超氧化物歧化酶1(Sod1)、超氧化物歧化酶2(Sod2)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx1)、过氧化氢酶(Cat)的mRNA相对表达量。2.采用免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白B-细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)及小胶质细胞标志物离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的蛋白表达量。3.采用免疫荧光双染法检测各组前额叶脑区Iba-1和神经元核抗原(NeuN)的原位表达量。4.采用原位末端标记(Tunel)法检测各组前额叶脑区细胞凋亡数。结果:1.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中MDA的含量(P均<0.001),SZWT小鼠较SZKO小鼠MDA含量显著增加(P<0.05);可显著下调前额叶皮质中GSH、SOD、ATP的含量及NQO1、Sod1、Sod2、Gpx1和Cat的mRNA相对表达量(P均<0.01),SZWT小鼠较SZKO小鼠显著减少(P均<0.001)。2.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中Iba-1蛋白的表达量及Iba-1阳性细胞数(P均<0.001),而SZWT小鼠较SZKO小鼠Iba-1蛋白表达量和Iba-1阳性细胞数显著增加(P均<0.001)。3.MK-801注射可显著下调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白的表达量而显著上调Bad蛋白的表达量(P均<0.001),可显著上调Tunel阳性细胞数(P均<0.001)。SZWT小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白表达量较SZKO小鼠显著减少,而Bad蛋白表达量和Tunel阳性细胞数较SZKO小鼠显著增多(P均<0.01)。结论:miR-144/451缺失可能通过发挥抗氧化应激、抗凋亡和抑制小胶质细胞激活的作用抑制精神分裂症的进展,改善精神分裂症症状。

目的 探究髓样细胞触发受体-1(TREM-1)在慢性间JNJ-42756493歇性低氧(CIH)诱发的动脉粥样硬化(AS)中作用。方法 将ApoE~(-/-)小鼠随机分为空白组、模型组和实验组获悉更多。模型组和实验组小鼠饲养于低氧环境，给予高脂饲料喂养；实验组小鼠高脂饲养4周后，腹腔注射TREM-1抑制剂LR12(5 mg/kg),连续干预8周。饲养12周后，检测血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、白flow mediated dilatation细胞介素10(IL-10)水平；组织学分析主动脉TREM-1表达、斑块面积及巨噬细胞水平。结果 与空白组相比，模型组小鼠主动脉TREM-1表达量显著升高(P<0.05)。相比于模型组，实验组小鼠主动脉斑块显著减少，血清血脂(TC、LDL、TG)及炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-10)水平显著降低，主动脉斑块及斑块浸润巨噬细胞、TREM-1表达显著减少(P<0.05),且斑块中TREM-1表达与巨噬细胞为共定位。结论 TREM-1参与CIH诱发的AS发生发展，抑制TREM-1能够减轻CIH诱发的AS,其机制与抑制巨噬细胞活化有关。

杨梅(Morella rubra)是一种果实色泽变异较大的果树,营养丰富且具有重要的经济和药用价值。色泽是评价果实品质的关键性状之一,而花青苷含量是决定杨梅果实色泽的主要因素。近年来,有关杨梅果实花青苷调控研究集中在鉴别花青苷生物合成基因和转录因子上,但品种间果实色泽差异的内在机制缺乏深入研究。本文以多个果实色泽不同的杨梅品种为研究材料,探究MrMYB1/2基因簇成员的结构和表达特性、功能差异与调控机制,以及MrGST1在杨梅花青苷转运中的功能与机制。主要结果如下:1.鉴定了一个与花青苷积累相关的MrMYB1/2基因簇,包括4个成员:MrMYB1.1、MrMYB1.2、MrMYB1.3和MrMYB2。在4个果实颜色各异的主栽品种中克隆基因簇成员,发现每个成员有2–3个等位基因。其中MrMYB1.1在不同品种中的基因型与果实颜色紧密相关,共有2个等位基因:MrMYB1.1-1(MrMYB1.1~n)和MrMYB1.1-2(MrMYB1.1~d)。前者是结构完整的R2R3型MYB基因,在果实紫黑色品种‘荸荠’中为纯合,后者因缺失一个碱基造成移码突变,转变为一个缺失R2和部分R3结构域的MYB基因,在果实白色品种‘水晶’中为纯合。MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d在果实红色品种‘东魁’和果实粉红色品种‘粉红’中为杂合。基于MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d基因型开发的CAPS标记能够准确并快速鉴别不同颜色果实的杨梅品种。MrMYB1.2、MrMYB1.3和MrMYB2的等位基因基因型与果实颜色之间没有相关性。MrMYB1.1、MrMYB1.2和MrMYB2在4个品种果实成熟过程中表达量逐渐升高且品种间差异较小。MrMYB1.3仅在果实紫黑色品种‘荸荠’中表达,且表达量与‘荸荠’果实成熟过程中的花青苷含量呈现一定的相关性。共线性分析表明,调控花青苷积累的MYB基因簇在部分双子叶植物的基因组具有高度保守性,可能在进化中具有独特的意义。2.烟草叶片瞬时表达分析发现MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以诱导花青苷积累,而MrMYB1.1~d、MrCP-456773分子式MYB1.2-1和MrMYB2-1不能诱导花青苷积累。MrMYB1.3-1在烟草中稳定转化使烟草的花和果皮花青苷含量显著升高。烟草双荧光素酶、酵母单杂交和凝胶电Alisertib核磁泳迁移试验表明,MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以直接结合并激活花青苷生物合成基因的启动子,而MrMYB1.1~d、MrMYB1.2-1和MrMYB2-1不能直接结合并激活花青苷生物合成基因的启动子。萤火虫comprehensive medication management荧光素酶互补成像和酵母双杂交试验表明,MrMYB1.1~n、MrMYB1.3-1和MrMYB2-1可以与MrbHLH1发生相互作用,而MrMYB1.1~d和MrMYB1.2-1不能与MrbHLH1发生相互作用。3.对杨梅GST基因家族进行分析,筛选到一个参与花青苷转运的候选基因MrGST1。MrGST1的表达量与‘荸荠’品种不同组织、不同发育阶段的果实和12个杨梅品种成熟果实中的花青苷含量呈显著正相关。对MrGST1进行拟南芥tt19突变体功能互补试验,发现MrGST1只负责花青苷的转运,而不负责原花青素的转运。烟草双荧光素酶和酵母单杂交试验表明,MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以直接结合并激活MrGST1启动子。顺式元件分析显示,MrGST1启动子有8个MYB结合位点。烟草双荧光素酶和酵母单杂交试验表明,MrMYB1.1~n通过识别起始密码子前第4个MYB结合位点激活MrGST1启动子。综上所述,本文系统探究了MrMYB1/2基因簇中4个成员的基因结构、表达特性、功能和调控机制差异,鉴定了调控杨梅果实花青苷积累的激活因子MrMYB1.1~n和MrMYB1.3。探明了杨梅品种间果实颜色差异是由于MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d基因型不同以及MrMYB1.3在特定品种表达所致。同时挖掘了参与杨梅果实花青苷转运的MrGST1并进行了功能鉴别。研究结果为花青苷生物合成和转运的调控机制提供新的理解,也为果实色泽品质的改良提供理论依据。

本研究通过谱效相关分析及活性验证探明百合地黄汤抗抑郁的药效成分。利用不同溶剂分次提取并结合HPLC和UHPLC-MS分析方法对百合地黄汤不同提取部位化学成分进行全面表征。动物实验方案经湖南中医medical dermatology药大学动物伦理委员会审查通过 (审查号为LLBH-202104270001)， 所有Baf-A1程序均严格按照动物使用和护理的伦理原则进行。采用旷场实验、悬尾实验、强迫游泳实验等经典行为学方法结合神经递质测定进行抗抑郁药效综合评价。整合三种相关分析方法进行谱效关联表征， 以三种关联分析所得药效成分的交集为潜Talazoparib分子量在药效成分， 并进行了体外细胞实验验证。研究发现， 王百合苷A、B、C、梓醇和异毛蕊花糖苷可能是百合地黄汤发挥抗抑郁作用的主要药效物质， 同时也提示， 多元化的谱效相关分析及活性验证有助于提升谱效相关分析结果的准确性。

获得高质量的DNA是分子试验的一个先决条件，常用的植物DNA提取过程及步骤繁杂，需要进行多次离心操作，所需时间较长，并且在DNA提取过程中会用到三氯甲烷和其他一些有毒试剂，对操作人员有Taurine核磁一定危害。为了筛选出高粱DNA的最优提取方法，进行基因定位等方面的研究，采用十二烷基硫酸钠(SDS)法、SDS+2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、CTAB+2%PVP法和磁珠法，提取高粱不同部位(嫩叶、老叶、根、茎、种子)的DNA,然后对其提取步骤、DNA浓度、吸光度、PCR扩增效果等进行比较。结果表明，磁珠法步骤简单、无毒、低成本，所需时间仅为其他几种方法的1/3,D_(260 nm)/D_(280 nm)为1.8～2.0,DNA的质量、纯度、浓度优于其他方法。各试验数据表明，磁珠法提取的DNA最适于分子生物学验，将其应用于高粱叶色性状基因的定位，可将紫色叶片基因Cell Cycle抑制剂PL1初步定位到4号染色体上，白条纹叶基因WSL10Allergen-specific immunotherapy(AIT)初步定位到10号染色体上。

孢子丝菌病是一种由申克孢子丝菌复合体引起的造成人BAY 73-4506采购和动物表皮和皮下组织慢性感染的真菌病,常表现为皮肤型、皮肤固定型和皮肤播散型。感染处呈溃疡结节样,严重时可危及生命。引起孢子丝菌病的申克孢子丝菌复合体中包含七种基因型孢子丝菌,其中狭义申克氏孢子丝菌、巴西孢子丝菌和球形孢子丝菌是该病的主要病原菌,孢子丝菌病在我国各个城市均有报道,主要集中在东三省。在我国东北部地区,主要的致病基因型为球形孢子丝菌,但该致病基因型是被低估和研究最差的孢子丝菌,到目前为止,涉及其基础研究和临床方面相关文献均较少。近年来,真菌侵袭性疾病的耐药性问题逐渐显现,孢子丝菌病也出现了耐药菌株,因此,寻找新的药物靶点迫在眉睫。基于以上背景,本研究针对孢子丝Cutimed® Sorbact®菌新靶点筛选出新的小分子药,并对其药效进行了检验,研究结果如下:1.以孢子丝菌致病关键蛋白AbaA蛋白为靶点,我们使用Robetta服务器预测AbaA的三维结构,通过生信分析找到AbaA蛋白的DNA结合域,截取模型质量最高的三维结构中的DNA结合域部分进行结合口袋预测,对预测到的结合口袋使用Auto Dock Vina在FDA获批的小分子数据库中进行批量分子对接,对接结果进行结合能、价格、药效、副作用综合分析,最终选取AS-1、AS-2、AS-3、AS-4四种小分子药作为候选药物。2.对四种小分子药物进行体外抗球形孢子丝菌试验,结果显示AS-1、AS-2两种小分子药物对球形孢子丝菌的生长及转相没有影响;而药物AS-3、AS-4明显地抑制了球形孢子丝菌的生长及转相。同时,为了验证其抑菌广谱性,我们又验证了狭义申克孢子丝菌对两种小分子药的敏感性,结果显示AS-3和AS-4也可以抑制狭义申克孢子丝菌的生长和转相。生长曲线测定结果同样显示,加入两种小分子药后,球形孢子丝菌及狭义申克孢子丝菌的生长被抑制。测定AS-3和AS-4抑制球形孢子丝菌及狭义申克孢子丝菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明,AS-3抑制球形孢子丝菌的MIC为25μg/m L,MBC为50μg/m L;抑制狭义申克孢子丝菌的MIC为6.25μg/m L,MBC为50μg/m L。AS-4抑制球形孢子丝菌的MIC为12.5μg/m L,MBC为25μg/m L;抑制狭义申克孢子丝菌的MIC为6.25μg/m L,MBC为25μg/m L。3.在动物水平验证AS-3、AS-4治疗孢子丝菌病药效。通过皮内注射孢子丝菌孢子悬液的方式对小鼠腹Elexacaftor作用部进行孢子丝菌病造模,造模成功后通过灌胃给药的方式使用两种小分子药进行治疗,选用伊曲康唑作为阳性对照。给药结束后,对小鼠皮损进行HE染色观察其炎症浸润情况和形成肉芽肿情况。结果显示与对照组相比,给药组和阳性对照组的炎症浸润情况均较轻,并且肉芽肿均小于对照组,对照组肉芽肿宽度和炎症细胞浸润情况与给药组均有统计学差异。综合以上实验结果,我们得出结论:小分子药物AS-3和AS-4在体外和小鼠体内实验具有抑制孢子丝菌和治疗孢子丝菌病的能力,因此具有开发成为治疗孢子丝菌病药物的潜力,本研究成功筛选出了两种针对孢子丝菌的新药,同时也为开发其它抗真菌小分子药提供了新的思路。