研究目的:TBK1-IRF3复合体在抗病毒免疫反应中发挥重要作用,是I型干扰素(Interferon-I,IFN-I)产生过程中必不可少的一环,但是其调控机制目前尚不完全清楚。p120-连环蛋白(p120 catenin,p120)是Naporafenib体外一种重复序列蛋白,主要调节经典钙粘附素的稳定性和上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMTs)的发生,是抑制表皮增值、促进表皮分化所PacBio Seque II sequencing必需的,同时在调节WNT信号通路、大脑发育以及肿瘤侵袭等方面发挥重要作用,p120是否参与调节抗病毒免疫反应尚未报道。为了探讨p120在抗病毒免疫反应中的作用及其机制,我们深入研究p120对IFN-β信号通路的影响,并探究相关的分子机制。研究方法:1.体外实验1.1明确p120对抗病毒免疫反应的影响构建人源和鼠源的p120 siRNA,在人单核巨噬细胞系(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)及小鼠原代腹腔巨噬细胞中转染p120 siRNA或Control siRNA 48小时后,分别用HSV/SeV/VSV三种病毒感染。通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测VSV、IFN-β mRNA的表达,通过酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测 IFN-β 的分泌水平,通过免疫印迹(western blot,WB)检测VSV-G的蛋白表达和IRF3的磷酸化情况。在HEK293T中过表达p120,24小时后感染VSV 6小时,WB检测VSV-G蛋白表达,qPCR检测VSV、IFN-β mRNA表达,并通过荧光显微镜观察病毒的复制情况。1.2探索p120的作用靶点及机制在 HEK293T 细胞中转染 Flag-p120、Myc-TBK1、HA-TBK1、Myc-IRF3、Myc-STING等表达质粒,通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测p120与其他蛋白的相互作用以及p120对TBK1、IRF3结合情况的影响,通过qPCR检测干扰素基因启动情况。用VSV感染巨噬细胞和转染Flag-p120、Myc-TBK1质粒的HEK293T细胞,通过共聚焦显微镜观察p120与TBK1、线粒体的共定位情况。用VSV、HSV-1感染转染p120 siRNA或Control siRNA的巨噬细胞,通过Co-IP检测p120对TBK1和IRF3结合情况的影响。2.体内实验采用尾静脉注射p120 siRNA或Control siRNA的方法构建p120KD小PS-341生产商鼠和WT小鼠,并通过腹腔注射VSV病毒对小鼠进行感染。24小时后进行小鼠眼球取血及颈椎脱臼处死,ELISA检测血清中IFN-β分泌情况,qPCR检测肺组织中VSV mRNA的表达,HE染色观察肺组织中炎性细胞浸润情况和肺泡损伤程度。研究结果:1.体外实验1.1 p120正向调节抗病毒免疫反应抑制p120内源性表达能显著降低细胞中病毒感染导致的IRF3磷酸化以及IFN-β的转录和分泌,但VSV-G蛋白和mRNA表达明显增加。在HEK293T细胞中过表达p120能使IFN-βmRNA表达增加,VSV-G蛋白和mRNA表达减少,且病毒复制受到抑制。1.2 p120靶向TBK1-IRF3复合体并通过增强该复合体稳定性发挥作用Co-IP和共聚焦显微镜结果提示p120与TBK1、IRF3、STING结合并与线粒体上的TBK1发生共定位,过表达p120使TBK1与IRF3结合增强并促进了 TBK1与IRF3诱导的IFN-β mRNA表达以及TBK1诱导的IFN-β启动子的激活,而下调p120抑制了它们的结合。2.体内实验病毒感染后与WT小鼠相比,p120KD小鼠在肺内VSV复制增多,血清中IFN-β的分泌显著减少,肺组织损伤更严重。研究结论:p120是抗病毒免疫反应中一种重要的正向调节因子,它通过稳定TBK1-IRF3复合体来促进IRF3的磷酸化,进而促进病毒感染诱导的I型干扰素产生,增强宿主的抗病毒免疫反应。