研究目的:在脓毒症肺损伤体内外模型中,初步探讨NETs调控肺泡巨噬细胞氧化应激,诱导细胞焦亡的分子机制。方法:1、通过盲肠穿刺结扎技术构建小鼠脓毒症模型,采用苏木精—伊红(HE)染色检测小鼠Sham组、CLP组、CLP+DnaseΙ组肺损伤的严重程度,用Western Blot检测上述分组肺组织NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GPX4、Cit H3的蛋白表达情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液IL-1β、TNF-α的表达含量,用qRT-PCR检测肺组织GPX4 m RNA的表达量。2、使用试剂盒提取大鼠外周血中性粒细胞并诱导产生NETs,免疫荧光技术进行鉴定。3、将大鼠肺泡巨噬细胞(AM)细胞分组为CON、LPS、LPS+NETs、LPS+NETs+DnaseΙ组,Western Blot、qRT-PCR检测NETs刺激AM细胞后NLRP3、GSDMD、Caspase-1的表达量,试剂盒及荧光技术检测活性氧(ROS)的变化,试剂盒检测MDA的含量,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18的含量,CCK-8检测细胞活力。4、实验分组为CON、LPS、LPS+NETs、LPS+NETs+NAC组,Western Blot检测用ROS清除剂NAC调控活性氧后,NETs再刺激AM细胞后NLRP3、GSDMD、Caspase-1的含量,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18的含量,CCK-8检测细胞活力,试剂盒及荧光技术检测活性氧(ROS)的变化。5、提取质粒,包装GPX4过表达慢病毒,感染并筛选GPX4过表达Plant symbioses的AM细胞稳转株。6、实验分组为CON、LPS、LPS+NETs+NC-GPX4、LPS+NETs+OE-GPX4组,Western Blot、qRT-PCR检测NETs刺激AM细胞后NLRP3、GSDMD、Caspase-1的表达量,试剂盒及荧光技术检测活性氧(ROS)的变化,试剂盒检测MDA的含量,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18的含量,CCK-8检测细胞活力。结果:1、脓毒症小鼠肺组织焦亡相关蛋白、炎症因Serine Protease抑制剂子及NETs标志性蛋白Cit H3与肺损伤程度有关,GPX4基因及蛋白IACS-010759表达量与肺损伤程度呈现负相关,抑制NETs后可降低脓毒症小鼠肺组织焦亡水平,同时GPX4表达量会升高。2、使用细胞染色方法、免疫荧光技术验证,成功从大鼠血液中提取中性粒细胞并诱发产生NETs。3、体外实验中,NETs会放大LPS诱导的AM细胞焦亡水平,同时影响GPX4基因、蛋白的表达,细胞活力会下降,氧化应激水平上升,用DnaseⅠ抑制NETs后细胞的焦亡水平与氧化应激水平得到改善。4、与对照组相比,NAC清除活性氧后,NETs再刺激AM细胞,焦亡水平会下降,细胞活力上升。5、通过荧光技术、qRT-PCR、Western Blot验证GPX4过表达稳转株构建成功。6、与对照组相比,NETs刺激过表达GPX4组细胞,焦亡水平、活性氧、MDA含量显著降低,细胞活性得到改善。结论:1、脓毒症肺损伤过程中,NETs会促进肺泡巨噬细胞氧化应激水平,并诱导细胞焦亡。2、NETs通过抑制GPX4诱导肺泡巨噬细胞焦亡,加重脓毒症肺损伤。