目的:甲醛(formaldehyde,FA)是人类生活环境中的一种污染物,可通过胎盘循环传递给胎儿,导致流产和先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)。研究表明,microRNA(miRNA)可以影响发育和多种疾病,尤其在心脏发育和重塑过程中是必不可少的。然而,miRNAs在甲醛诱导CHD中的作用调节机制仍不清楚。本研究意在探索miR-871-3p在FA诱导心肌细胞炎症中的调控作用和机制,可能为CHD的治疗提供新的分子靶点,进一步改善心脏疾病的临床转归。方法:(1)运用超声心动图分析正常胎儿和确诊CHD胎儿的心功能;(2)构建甲醛暴露仔鼠心脏模型,使用高通量测序来识别正常和甲醛暴露的新生大鼠心脏组织中的miRNA表达谱;使用R语言对获取的miRNA进行分析,我们选择了差异倍数(Fold Change,FC)≥2.0且P<0.05作为差异性筛选标准,选取在甲醛暴露组上调的miRNA作为研究目标;(3)KEGG对预测的靶基因进行富集分析,我们确定了其在发挥作用过程中关键的相关信号通路;(4)动物模型:超声心动检查仪对对照组和甲醛暴露组的仔鼠进行心脏功能检查;(5)通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测,大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞、成年大鼠和仔鼠心脏、甲醛暴露下仔鼠各组织以及正常人和CHD患者血浆中miR-871-3p的表达;(6)免疫荧光原位杂交实验(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测miR-871-3p亚细胞定位及其在心脏组织的定位和表达;通过RT-qPCR检测在使用不同浓度梯度甲更多醛处理心肌(H9C2)细胞时miR-871-3p的表达情况;(7)应用苏木素(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察甲醛诱导下仔鼠心脏组织结构的变化。免疫组化实验(Immunohistochemistry,IHC)检测心肌细胞炎症相关蛋白(IL-1β)的表达。(8)合成miR-871-3p mimic转染H9C2细胞,采用RT-qPCR验证其表达效率;在有无甲醛刺激下,用miR-871-3p mimic转染H9C2细胞,采用RT-qPCR、蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)实验检测炎症相关蛋白的表达;合成miR-871-3p inhibitor,RT-qPCR验证表达效率。在有无甲醛刺激下,用miR-871-3p inhibitor转染H9C2细胞,采用RT-qPCR、WB实验检测炎症相关蛋白的表达;(9)通过生物信息学分析和分子生物学实验(生物素标记miR-871-3p pull down、双荧光素酶报告基因)筛选并验证miR-871-3p与下游蛋白Megf8的结合情况;在有无甲醛刺激下,沉默Megf8表达,同时分别过表达和敲低miR-871-3p,采用RT-qPCR实验、WB实验检测来验证沉默Megf8是否影响miR-871-3p对细胞炎症的调控作用;(10)构建大鼠体内甲醛诱导CHD模型,尾静脉注射AAV9-miR-871-3p-inhibitor治疗后,采用FISH、IHC、RNA荧光原位MLN4924浓度杂交、RT-qPCR、WB实验检测细胞炎症相关蛋白和miR-871-3p的表达量。结果:(1)临床超声心动图检查发现,与正常胎儿相比CHD胎儿心脏的组织结构有明显差异;(2)两组心脏组织基因中共预测到1298个miRNA,其中共同表达的known-miRNA和novel-mneurology (drugs and medicines)iRNA分别是570个和634个。仅在甲醛暴露组特异表达known-miRNA有34个,novel-miRNA有12个;而正常组特异表达known-miRNA有23个,novel-miRNA有25个;在甲醛暴露组(n=3)和正常组(n=3)新生儿心脏组织中共筛选出89个符合Fold Change≥2.0,P<0.0 5标准的差异表达的miRNA,其中,28个miRNA在新生心脏中上调,61个miRNA下调;(3)KEGG富集分析显示:上调的miRNA主要富集在心脏相关疾病及炎症等通路;(4)与对照组相比,甲醛暴露组仔鼠的心脏功能具有显著差异;(5)验证实验显示:miR-871-3p在大鼠心肌细胞、甲醛诱导的仔鼠心脏和CHD患者的血浆中表达上调(P<0.05);(6)FISH实验显示:miR-871-3p在细胞质、核中均有表达;甲醛暴露的H9C2细胞中miR-871-3p高表达;此外,甲醛刺激时miR-871-3p明显升高,且呈浓度依赖性;(7)HE染色结果显示:相对于对照组,甲醛诱导后仔鼠心脏呈现心肌纤维排列紊乱、空泡化、心室肥厚等病理现象。IHC实验验证:甲醛暴露诱导后炎症相关蛋白表达升高(P<0.05);(8)RT-qPCR验证miR-871-3pmimic、inhibitor转染效果良好(P<0.05);miR-871-3p mimic增加了炎症反应;同时,miR-871-3p mimic能明显促进甲醛暴露下H9C2的炎症反应(P<0.05)。miR-871-3p inhibitor减少炎症反应;此外,miR-871-3p inhibitor能明显抑制甲醛暴露下H9C2的炎症反应(P<0.05);(9)Targetscan和miRanda数据库预测表明,Megf8极可能是miR-871-3p的下游;双荧光素酶报告基因、RNA pull down实验证实miR-871-3p与靶蛋白Megf8的相互作用及靶向性;此外,沉默Megf8表达,同时转染miR-871-3p mimic,可上调IL-1β的表达,增加细胞炎症(P<0.05);而沉默Megf8表达,同时转染miR-871-3p inhibitor,可下调IL-1β的表达,减轻细胞炎症(P<0.05);(10)动物实验证实:与健康组相比,甲醛暴露下仔鼠心肌组织中miR-871-3p、IL-1β表达升高,Megf8表达量下降;反之,与疾病组相比,治疗组心肌组织中miR-871-3p、IL-1β表达被下调,Megf8表达量明显升高(P<0.05)。结论:本研究发现在甲醛诱导心肌细胞炎症的过程中miR-871-3p具有一定的调控作用。miR-871-3p通过直接与Megf8的特异性位点结合调控IL-1β的表达,调控大鼠胚胎心肌细胞的炎症反应。本研究揭示了一个新的miR-871-3p/Megf8调控信号通路,丰富了对CHD病理机制的阐述,为CHD的诊断和治疗提供了新的靶点和研究思路。