精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种慢性重性精神疾病,其特征在于一系列可共存的不同症状,包括幻觉、妄想、情感平淡、社交退缩和认知障碍等。目前精神分裂症的发病机制尚不十分明确,治疗手段亦有限,因此,探索精神分裂症的深层机制、寻找其治疗靶点意义深远。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类非编码RNA,通过序列特异性碱基配对与靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’端非编码区(3’UTR)相互作用以降解靶mRNA或抑制翻译,从而下调(沉默)目的基因的表达。每个miRNA都可能调节数百个靶基因的表达,因而miRNAs的功能失调,特别是这种失调发生在中枢神经系统时,临床意义是重大的,对研究疾病潜在的分子机制和开发有效的治疗方法而言都是巨大的挑战。充分证据表明miRNAs在精神分裂症的发生发展中发挥重要作用。miR-144/451是一个双顺反子miRNA基因位点,编码miR-144和miR-451两种miRNAs。大量数据表明,miR-144/451参与调控多种神经精神类疾病如抑郁症、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等,但其对精神分裂症是否有调控作用未见相关研究。基于以上背景,本研究旨在明确miR-144/451是否对精神分裂症有调控作用,并探讨可能的分子机制,为精神分裂症提供新的miRNA靶点的思路,分为以下3个部分:第一部分:miR-144/451敲除对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:通过遗传学方法繁殖小鼠获得同窝野生型(WT)小鼠和miR-144/451基因敲除(KO)小鼠并建立精神分裂症小鼠模型,明确miR-144/451敲除对精神分裂症表型是否有调控作用。方法:1.分别将同窝WT和KO小鼠随机分为conWT组、SZWT组和conKO组、SZKO组。通过连续腹腔注射14天(+)-MK-801建立精神分裂症小鼠模型,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.评估小鼠精神分裂症症状:利用旷场实验检测小鼠genetic phenomena自发活动度(阳性症状),利用前脉冲抑制实验检测小鼠感觉门控selleckchem功能状态,利用筑巢实验检测认知功能,利用强迫游泳实验检测焦虑抑郁程度(阴性症状)。3.采用原位杂交法检测conWT组和SZWT组海马区miR-144和miR-451的mRNA水平。4.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组小鼠前额叶皮质和纹状体中多巴胺含量。结果:1.旷场实验中,conWT和conKO小鼠的活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05),腹腔注射MK-801能显著增加SZWT和SZKO小鼠的活动路程和平均速度即小鼠自发活动过度(P均<0.05),而SZKO小鼠的自发活动较SZWT小鼠显著减少(P<0.05)。前脉冲抑制实验中,conKO小鼠较conWT小鼠的PPI%显著降低(P均<0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠的PPI%(P均<0.01),而在前脉冲刺激为80dB和85dB时显著升高SZKO小鼠的PPI%(P均<0.05)。SZKO小鼠的PPI%较SZWT小鼠显著升高(P均<0.05)。筑巢实验中,conWT和conKO小鼠的筑巢评分无显著差异(P>0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠筑巢评分(P<0.001),而SZKO小鼠评分较SZWT小鼠显著升高(P<0.01)。强迫游泳实验中,conWT和conKO小鼠的不动时间无显著差异(P>0.05)。MK-801注射显著延长SZWT和SZKO小鼠的不动时间(P均<0.001),而SZKO小鼠的不动时间较SZWT小鼠显著缩短(P<0.001)。2.MK-801注射显著增加SZWT小鼠海马区miR-144和miR-451 mRNA水平(P均<0.001)。3.conWT和conKO小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量无显著差异(P均>0.05)。MK-801注射显著降低SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量而显著升高纹状体中多巴胺含量(P均<0.001)。SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量的降低程度和ABT-263生产商纹状体中多巴胺含量的升高程度均显著弱于SZWT小鼠(P均<0.01)。结论:miR-144/451基因敲除后小鼠精神分裂症症状及多巴胺失调明显改善,提示其对精神分裂症有明显调控作用,同时发现腹腔注射MK-801后SZWT小鼠海马区miR-144/451 表达增加。第二部分:脑内miR-144/451过表达对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:明确脑内过表达miR-144/451对精神分裂症表型的调控作用。方法:1.将WT小鼠随机分为con组,ago组,SZ组和SZago组,通过脑立体定位注射miR-144-3p和miR-451a agomir混合物实现miR-144/451的脑内过表达,以等量miR-NC为对照。连续腹腔注射14天(+)-MK-801诱发精神分裂症症状,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.利用旷场实验检测小鼠自发活动度(阳性症状),利用筑巢实验检测小鼠认知功能。3.应用ELISA法检测小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量。结果:1.旷场实验中con组与ago组小鼠活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05)。SZago组小鼠活动路程和平均速度较SZ组小鼠显著增加(P均<0.05)。筑巢实验中con组和ago组筑巢得分无显著差异(P>0.05),SZago组和SZ组相比筑巢得分无显著差异(P>0.05)。2.con组和ago组前额叶皮质及纹状体中多巴胺含量均无显著差异(P均>0.05)。SZago组前额叶皮质中多巴胺含量较SZ组显著减少(P<0.001),纹状体中多巴胺含量较SZ组显著增多(P<0.001)。结论:脑内miR-144/451过表达加重精神分裂症症状和多巴胺失调,再次提示miR-144/451参与调控精神分裂症。第三部分:miR-144/451对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症的调控作用目的:利用自第一部分收集的前额叶皮质样本和制作的冰冻切片探讨miR-144/451 是否对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症有调控作用。方法:1.应用试剂盒检测各组小鼠前额叶皮质中丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)的含量,进一步应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠前额叶皮质中抗氧化酶包括NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1)、超氧化物歧化酶1(Sod1)、超氧化物歧化酶2(Sod2)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx1)、过氧化氢酶(Cat)的mRNA相对表达量。2.采用免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白B-细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)及小胶质细胞标志物离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的蛋白表达量。3.采用免疫荧光双染法检测各组前额叶脑区Iba-1和神经元核抗原(NeuN)的原位表达量。4.采用原位末端标记(Tunel)法检测各组前额叶脑区细胞凋亡数。结果:1.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中MDA的含量(P均<0.001),SZWT小鼠较SZKO小鼠MDA含量显著增加(P<0.05);可显著下调前额叶皮质中GSH、SOD、ATP的含量及NQO1、Sod1、Sod2、Gpx1和Cat的mRNA相对表达量(P均<0.01),SZWT小鼠较SZKO小鼠显著减少(P均<0.001)。2.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中Iba-1蛋白的表达量及Iba-1阳性细胞数(P均<0.001),而SZWT小鼠较SZKO小鼠Iba-1蛋白表达量和Iba-1阳性细胞数显著增加(P均<0.001)。3.MK-801注射可显著下调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白的表达量而显著上调Bad蛋白的表达量(P均<0.001),可显著上调Tunel阳性细胞数(P均<0.001)。SZWT小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白表达量较SZKO小鼠显著减少,而Bad蛋白表达量和Tunel阳性细胞数较SZKO小鼠显著增多(P均<0.01)。结论:miR-144/451缺失可能通过发挥抗氧化应激、抗凋亡和抑制小胶质细胞激活的作用抑制精神分裂症的进展,改善精神分裂症症状。