实验目的:本研究旨在探究LARP1在鼻咽癌细胞中的作用及其对顺铂化疗敏感性的影响,并进一步研究LARP1调控鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性的分子机制。实验方法:1.采用蛋白质免疫印迹法检测不同人鼻咽癌细胞系(CNE1、CNE2、5-8F、6-10B)中LARP1的表达情况,利用si RNA在LARP1表达较高的5-8F细胞中构建LARP1敲低模型,利用质粒载体转染在LARP1表达较低的6-10B细胞中构建LARP1过表达模型;CCK-8法检测LARP1表达水平的高低对鼻咽癌细胞活力的影响;平板克隆形成实验检测LARP1表达水平的高低对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;利用Transwell实验检测LARP1表达水平的高低对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞技术(Annexin-FITC/PI更多双染法)检测LARP1表达水平的高低对鼻咽癌细胞凋亡的影响;使用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,通过流式细胞仪检测LARP1表达水平的高低对鼻咽癌细胞周期的影响。2.在人鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B细胞中,采用不同浓度顺铂化疗后,采用蛋白质免疫印迹法检测LARP1表达水平的变化;使用慢病毒载体感染鼻咽癌细胞5-8F,构建稳定敲低LARP1的细胞系;采用CCK-8法检测稳定Cardiac Oncology敲低LARP1后对顺铂处理后5-Alpelisib8F细胞活力的影响;采用平板克隆形成实验检测稳定敲低LARP1后对顺铂处理后5-8F细胞增殖的影响;使用流式细胞仪检测稳定敲低LARP1后对顺铂处理后5-8F细胞凋亡的影响,进而评估LARP1对顺铂化疗敏感性的影响。3.将人鼻咽癌细胞系5-8F用si NC与si LARP1分别处理后,收集细胞进行真核转录组resequencing,进行差异基因的筛选和鉴定,再通过KEGG进行信号通路富集以及pathway分析。用荧光实时定量PCR法、蛋白质免疫印迹法检测在不同条件下LARP1和铁死亡通路相关基因的表达情况。使用丙二醛(malondialdehyde,MDA)比色法测试盒检测敲低LARP1后鼻咽癌细胞中丙二醛含量的变化;使用细胞亚铁比色法测试盒检测敲低LARP1后鼻咽癌细胞中Fe~(2+)含量的变化;使用活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光法测试盒检测敲低LARP1后鼻咽癌细胞中ROS水平。4.采用CCK-8法检测erastin和顺铂在鼻咽癌细胞中的IC_(50),并使用Compu Syn软件计算两种药物联合作用是否具有协同效应。实验结果:1.在鼻咽癌细胞中高表达LARP1可以增强细胞活力,促进鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭能力,敲低LARP1可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭能力,促进细胞凋亡,敲低或高表达LARP1对鼻咽癌细胞的周期无显著影响。2.在顺铂化疗后LARP1的蛋白表达水平下调,敲低LARP1可以增强顺铂对鼻咽癌细胞增殖能力的抑制作用,同时也可以增强顺铂对鼻咽癌细胞凋亡的促进作用,敲低LARP1可使鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性增加。3.在鼻咽癌细胞中敲低LARP1后,铁死亡通路相关基因PRNP、VDAC2、TFRC、ATG7、SAT2、SLC39A14等基因的m RNA水平上调,P53蛋白水平上调,SLC7A11、GPX4的蛋白水平下调,Fe~(2+)含量、MDA含量、ROS水平均上升。4.铁死亡诱导剂erastin及顺铂两者联合使用,药物联合指数(combination index,CI)小于1,表明erastin增强了顺铂对鼻咽癌细胞5-8F的抑制作用,两者具有协同效率。实验结论:本研究发现LARP1促进鼻咽癌的发展,以LARP1为靶点的治疗策略可能成为治疗该病的一种新方法;铁死亡诱导剂erastin与顺铂联合使用对鼻咽癌细胞增殖具有协同抑制作用,LARP1可能通过调控铁死亡来影响顺铂的化疗敏感性。我们可以通过干扰LARP1的表达或调节铁死亡途径来提高鼻咽癌细胞对顺铂的化疗敏感性,从而提高化疗的疗效。