慢性肾病(Chronic kidney disease,CKD)是指由多种病因导致的肾脏结构或功能的持续性改变,主要表现为肾小球滤过率(Glomerularfiltrationrate,GFR)下降等。流行病学研究表明,全球CKD患者的数量逐年上升,2017年患病率达9.1%,俨然成为全球性的公共卫生难题。而且,CKD患者易进展为终末期肾病(End stage renal disease,ESRD),最终只能依赖透析或肾移植,给患者带来极大的经济压力与身体负担。因此,解析慢性肾病的发病机理,探寻新型的治疗靶点,对于CKD的临床诊治具有重要的科学意义。尽管慢性肾病的病因多种多样,如急性肾损伤、糖尿病等,但是不同病因的CKD发展至终末期肾病具有一个相同的通路——肾脏纤维化。肾脏纤维化主要体现为肾小球硬化和肾间质纤维化,其中肾间质纤维化常伴随肾间质炎性细胞浸润、肾小管萎缩以及细胞外基质的过度沉积等。同时,肾间质纤维化作为一个动态且多维度的病理过程,涉及多种肾脏细胞。其中,肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells,RTECs)作为肾脏实质细胞的主体,在急性肾损伤向慢性肾病进展过程中发挥着重要作用。当损伤较轻时,肾小管上皮细胞可以通过有限的修复能力完成肾脏结构重塑;然而,当损伤较重时,肾小管上皮细胞无法完成正常的修复,继而出现上皮特征缺失、能量代谢紊乱、细胞周期阻滞等诱导不良修复,最终导致肾脏纤维化。近些年,越来越多的研究证实肾小管上皮细胞病理性衰老是肾间质纤维化的重要驱动因素。衰老的肾小管上皮细胞会出现分泌功能的增强,产生多种细胞因子,如IL-1β、IL-6、TGF-β等,构成衰老相关分泌表型(SenescenLabel-free food biosensorce Associated Secretory Phenotype,SASP),引起肾脏区域微环境改变,进而损伤肾小管细胞并促进成纤维细胞的活化,最终导致肾脏纤维化。因此,解析肾小管上皮细胞的衰老机制,寻找潜在干预靶点,对于改善肾脏纤维化具有重要的科学价值。溶酶体相关跨膜蛋白 5(Lysosome Associated Protein Transmembrane 5,LAPTMTelaglenastat采购5)是溶酶体相关跨膜蛋白(LAPTM)家族中一员,其分子结构中含有262个氨基酸,分子量29.9 kDa,具有5个跨膜区域,并包含三个多脯氨酸-酪氨酸的PY结构域和一个与泛素相互作用的UIM结构域。目前,对于LAPTM5的研究主要集中在免疫功能调节领域。研究表明,LAPTM5可介导溶酶体对B细胞受体(B cell receptor,BCR)和 T 细胞受体(T cell receptor,TCR)的降解,从而发挥免疫反应负调控作用。然而,LAPTM5在肾脏中,特别是肾脏纤维化中的作用与机制尚不明了。因此,本课题分别构建了全身敲除LAPTM5小鼠与肾小管特异性敲除LAPTM5小鼠,并结合临床标本,从体内外水平探究LAPTM5在肾小管上皮细胞衰老及肾脏纤维化中作用与机制。研究方法与结果1 LAPTM5在肾脏纤维化中的表达模式1.1 LAPTM5在多种肾脏纤维化小鼠模型中表达上调(1)在马兜铃酸肾病(Aristolochic acid nephropathy,AAN),单侧输尿管梗阻(Unilateral ureter obstruction,UUO),以及双肾缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)三种肾脏纤维化小鼠模型中,通过Western Blot及qRT-PCR检测发现小鼠肾皮质中LAPTM5的mRNA水平和蛋白水平表达都明显升高。(2)通过原位杂交染色(In situ hybridization,ISH),发现 LAPTM5 在AAN、UUO、IRI三种模型小鼠肾脏内表达升高,且主要集中表达在肾小管。1.2 LAPTM5在不同刺激的肾小管上皮细胞内表达增加利用 Western Blot 检测转化生长因子 β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)和马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)药物刺激大鼠肾小管上皮(Normal rat renal tubular epithelial,NRK-52E)细胞后,LAPTM5 蛋白水平变化,结果表明AA和TGF-β1能够显著上调NRK-52E细胞中LAPTM5的表达水平。1.3 LAPTM5在慢性肾病患者的肾脏中表达增加在临床慢性肾病患者的肾组织活检切片中,通过原位杂交染色发现LAPTM5表达水平明显升高,且相关性分析表明LAPTM5的升高与Masson染色、Sirius Red染色以及Vimentin免疫组化染色所代表的肾间质纤维化程度呈正相关。2 LAPTM5在肾脏纤维化中的功能研究2.1 LAPTM5缺失可减轻AAN小鼠肾脏纤维化(1)构建LAPTM5全身敲除(Laptm5-/-)小鼠,并进行鼠尾DNA的提取及基因型鉴定。(2)利用WT及Laptm5-/-小鼠构建AAN模型。(3)在马兜铃酸(AA)诱导的肾脏纤维化模型中,HE染色发现全身敲除LAPTM5可以明显改善肾小管萎缩和管腔扩张,并且Masson染色和Sirius Red染色进一步表明敲除LAPTM5可以明显改善肾间质胶原纤维的过度沉积。(4)Western Blot和免疫组化染色发现,敲除LAPTM5能够显著降低AAN模型小鼠肾脏中纤维化相关分子Vimentin、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ的蛋白水平。2.2肾小管特异性敲除LAPTM5可减轻AAN小鼠肾脏纤维化(1)构建肾小管特异性敲除LAPTM5小鼠(Cre+/Laptm5fl/fl),并提取鼠尾DNA,进行基因型鉴定。(2)利用Cre-/Laptm5fl/fl及Cre+/Laptm5fl/fl小鼠进行AAN模型构建。(3)HE、Masson和Sirius Red染色结果显示,肾小管特异性敲除LAPTM5可以明显改善AAN小鼠管腔扩张、肾小管萎缩和胶原纤维沉积的情况。(4)通过Western Blot和免疫组化染色研究发现,肾小管特异性敲除LAPTM5 后,可以明显降低 AAN 模型中 Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和 CollagenⅣ等纤维化标志分子的蛋白水平。2.3 LAPTM5缺失可改善AAN小鼠肾小管上皮细胞的衰老(1)Western Blot检测AAN小鼠肾皮质中衰老相关分子的表达变化情况,实验结果显示全身敲除LAPTM5后,显著降低衰老标志分子p53、p16以及转化生长因子TGF-β1的蛋白水平。(2)免疫组化染色检测AAN小鼠肾脏中抗衰老分子Klotho的表达变化,实验结果显示敲除LAPTM5可逆转Klotho的表达下调。2.4肾小管特异性敲除LAPTM5可以改善AAN小鼠肾小管上皮细胞衰老(1)Western Blot检测结果显示肾小管特异性敲除LAPTM5,可以降低AAN小鼠肾脏中衰老相关的信号分子p53、p21、p16的表达。(2)免疫组化染色检测Klotho的表达变化,并发现肾小管特异性敲除LAPTM5可明显提高肾小管中Klotho的蛋白水平。(3)衰老相关-β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedbeta-galactosidase,SA-β-gal)染色显示肾小管特异性敲除LAPTM5后,可以明显减轻AAN小鼠肾脏中β-半乳糖苷酶的活性。(4)qRT-PCR检测进一步发现,肾小管特异性敲除LAPTM5明显降低AAN小鼠肾脏中衰老相关分泌表型(SASP)因子TGF-β1、IL-1β、IL-6和CTGF的表达。2.5敲低LAPTM5可减轻肾小管上皮细胞特征的缺失(1)利用Western Blot验证LAPTM5慢病毒转染NRK-52E细胞后实现LAPTM5低表达。(2)Western Blot结果显示AA处理可诱导NRK-52E细胞内α-SMA、Vimentin和Collagen Ⅰ的蛋白水平表达上调,但敲低NRK-52E细胞内LAPTM5可降低它们的表达。(3)通过Western Blot检测发现LAPTM5敲低后,同样可以降低TGF-β1刺激下NRK-52E细胞中α-SMA、Vimentin和Collagen Ⅰ的蛋白水平。2.6敲低LAPTM5可抑制AA诱导的肾小管上皮细胞衰老(1)通过Western Blot检测发现,AA刺激使衰老相关分子p21、p16的蛋白水平表达升高,同时抗衰老分子Klotho表达下降,而敲低LAPTM5后可逆转它们的表达。(2)Western Blot及qRT-PCR检测SASP因子,实验结果显示敲低LAPTM5可抑制AA刺激下NRK-52E细胞中IL-点击此处1β、IL-6、TGF-β1与CTGF的表达上调。2.7肾小管上皮细胞敲低LAPTM5可抑制成纤维细胞的增殖活化(1)AA刺激NRK-52E细胞36h后,更换为普通培养基,继续培养小管上皮细胞24 h,然后收集对照组和药物组NRK-52E细胞的条件培养基,培养大鼠成纤维细胞NRK-49F。(2)通过Western Blot检测发现AA处理的NRK-52E细胞来源的条件培养基能够促进NRK-49F细胞的增殖和活化,表现为PCNA和α-SMA的表达上调,而敲低NRK-52E细胞中LAPTM5可降低它们的表达。2.8 LAPTM5缺失可减轻UUO诱导的肾脏纤维化(1)利用WT及Laptm5-/-小鼠构建UUO模型。(2)HE染色、Masson染色和Sirius Red染色显示,敲除LAPTM5可以明显改善管腔扩张,小管萎缩和肾间质胶原纤维的过度沉积。(3)通过Western Blot、qRT-PCR和免疫组化染色发现,敲除LAPTM5可以明显降低 UUO 模型中 Vimentin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CollagenⅣ及 Fibronectin的表达,同时上调E-Cadherin的表达。2.9肾小管特异性敲除LAPTM5可减轻UUO诱导的肾脏纤维化(1)利用 Cre-/Laptm5fl/fl及Cre+/Laptm5fl/fl小鼠构建 UUO 模型。(2)HE、Masson和Sirius Red染色结果表明,肾小管特异性敲除LAPTM5显著改善UUO小鼠肾脏的形态损伤,并减轻肾间质的纤维化情况。(3)Western Blot和免疫组化染色显示,肾小管特异性缺失LAPTM5可降低UUO小鼠肾脏中纤维化标志分子Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ及CollagenⅣ的表达。3 LAPTM5促进肾脏纤维化的机制研究3.1 LAPTM5可能通过调控Notch1促进肾脏纤维化(1)Western Blot结果显示过表达LAPTM5可以特异性上调Notch家族中Notch1的表达。(2)在NRK-52E细胞内,Western Blot结果显示基因沉默LAPTM5可抑制AA刺激所诱导的Notch1的蛋白上调。(3)在AAN小鼠中,通过Western Blot检测发现肾小管特异性敲除LAPTM5,同样可以降低AAN小鼠肾脏中Notch1的表达。研究结论与创新性1.本研究利用多种肾脏纤维化动物模型,并结合临床标本,首次明确了LAPTM5在肾脏纤维化中的表达模式并发现LAPTM5在肾小管上皮细胞中表达明显升高。同时,相关性分析显示LAPTM5的上调与肾脏纤维化密切相关,提示LAPTM5参与肾脏纤维化且可能与肾小管损伤密切相关。2.本研究通过构建全身敲除LAPTM5小鼠与肾小管特异性敲除LAPTM5小鼠,进行体内外研究,系统阐明了 LAPTM5能够促进肾小管上皮细胞的衰老,进而诱导肾脏纤维化,为肾脏纤维化与慢性肾病的临床防治提供了潜在的靶点。