研究目的:下咽鳞状细胞癌是一种存活率低的头颈部肿瘤,发病部位隐蔽,恶性程度较高,预后较差。中晚期病人可以接受手术和非手术治疗,尽管这两种方法对患者生存的影响没有统计学上的显著差异,但非手术治疗可以显著改善患者的生活质量。因此,对下咽鳞状细胞癌发生发展的生物学机制进行研究具有重要的意义。FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)属于成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族成员之一。FGFR家族主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFRL1,除FGFRL1外,FGFR1-4均具有与配体结合的胞外区、跨膜区和受体磷酸化的胞内区结构。FGFR2经过选择性剪接主要产生FGFR2b和FGFR2c两种异构体。FGFR2b主要表达于上皮细胞,在调控上皮细胞生长和分化中发挥关键作用。FGFR2b细胞外配体主要为FGF1、FGF3、FGF7、FGF10和FGF22,其中FGF7也被称为KGF(本文使用KGF表述),与FGFR2b亲和力最高。FGFR2b是KGF家族细胞生长因子(FGF7EPZ-6438 IC50,FGF10,FGF22)的唯一受体,因此FGFR2b也称之为KGFR。KGF主要由间质细胞分泌,通过旁分泌作用于表达FGFR2b受体的上皮细胞调控间质上皮相互作用。KGF和FGFR2b在前列腺癌LY2157299使用方法、乳腺癌、肺癌、子宫癌和卵巢癌等多种实体瘤中高表达,FGFR2信号通路激活影响肿瘤细胞的增殖、生存以及EMT等病理过程,是多种肿瘤不良预后的标志。KGF/FGFR2b在下咽鳞癌中的作用机制尚不清楚,本研究探讨了KGF/FGFR2b在下咽癌分化中的作用及调控机制。研究方法:1.下咽癌组织FGFR2b表达情况分析。对20对配对的下咽癌癌旁正常组织(N)和癌组织(T)进行q PCR实验,检测组织中FGFR2b的m RNA表达。2.KGF对下咽癌细胞分化的影响。在FaDu细胞中加入不同浓度、不同时间KGF,Western Blotting检测其对细胞分化标志蛋白Krt10表达量的影响。在FaDu细胞中转染HA-Ub和Krt10-Flag质粒,48小时后加入KGF,Western Blotting检测Krt10的泛素化水平。3.Trim21对下咽癌细胞功能的影响。通过蛋白质免疫共沉淀实验鉴定Trim21与Krt10的相互作用;用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理细胞,检测Krt10的蛋白表达水平。在FaDu细胞中转染过表达、敲低以及无泛素化连接酶活性Trim21,Western Blotting检测Krt10泛素化水平。在FaDu细胞中转染过表达或敲低Trim21的质粒,Western Blotting检测Krt10和IVL的蛋白表达量。划痕实验检测Trim21过表达和敲低对FaDu细胞迁移的影响。在FaDu细胞中共同转染K6-HA-Ub和Trim21的过表达或敲低的质粒,Western Blotting检测Krt10泛素化水平。4.KGF对Trim21表达的调控机制。在FaDu细胞中加入不同浓度的KGF,Western Blotting检测其对Trim21表达量的影响。用KGF和MG132处理FaDu细胞,Western Blotting检测Trim21表达量。在FaDu细胞中转染HA-Ub和Trim21-Flag质粒,48小时后加入KGF,Western Blotting检测Trim21的泛素化水平5.过表达和敲低p38对下咽癌细胞的影响。在FaDu细胞转染过表达或敲低p38质粒,Western Blotting检测其对Krt10蛋白的表达量以及泛素化水平的影响。在FaDu细胞中共同转染K48-HA-Ub和p38的过表达或RNAi Technology敲低的质粒,Western Blotting检测Krt10泛素化水平。结果:1.和癌旁组织相比,FGFR2b在下咽癌组织中高表达。2.KGF处理降低FaDu细胞中分化标志分子Krt10蛋白的表达而不影响其m RNA水平。蛋白酶体抑制剂MG132同时处理可减弱KGF对Krt10蛋白的抑制作用。泛素化实验发现KGF处理增高Krt10的总泛素化水平。实验结果提示KGF通过泛素化调控3.免疫共沉淀实验发现Trim21与Krt10蛋白相互作用。CHX处理FaDu细胞结果显示,和对照相比,过表达Trim21抑制Krt10的降解。泛素化实验显示,过表达和基因沉默Trim21分别增高和降低Krt10的泛素化水平,提示Trim21可能通过泛素化修饰维持Krt10蛋白稳定,在细胞分化中发挥重要作用。FaDu细胞中过表达Trim21,增高分化标志分子Krt10和IVL的蛋白表达水平,抑制细胞迁移;相反,基因沉默Trim21降低Krt10和IVL蛋白表达,促进细胞迁移。进一步筛选表明,过表达Trim21仅影响Krt10的K6泛素链水平。实验结果显示过表达和基因沉默Trim21分别增高和降低Krt10的K6泛素化水平,提示Trim21介导的泛素化修饰维持Krt10蛋白稳定作用通过K6连接的泛素链发挥作用。4.进一步研究发现KGF处理FaDu细胞降低Trim21蛋白水平,并且MG132可减弱这一抑制作用。同时,KGF处理升高Trim21的泛素化水平。综上,我们实验结果表明,KGF通过下调泛素连接酶Trim21表达影响其对分化标志分子Krt10的蛋白稳定作用,抑制细胞分化。5.此外,在FaDu细胞中过表达和基因沉默p38 MAPK分别促进和抑制Krt10的蛋白表达及其总泛素化和执行降解功能的K48泛素化水平,提示KGF处理可能通过激活下游p38 MAPK通路介导Krt10的K48泛素化修饰降解Krt10抑制细胞分化。结论:综上所述,FGFR2b在下咽癌中高表达。KGF/FGFR2b信号通过减弱Trim21对Krt10的K6泛素化蛋白稳定和激活p38磷酸化介导的Krt10的K48泛素化降解协同作用,下调Krt10表达,抑制分化。