新冠肺炎是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-Co V-2)引起的一种以持续发热,咳嗽,浑身肌肉酸痛,嗅觉味觉丧失为主要症状的疾病,具有极高的传染性。自2019年,发现首例新冠肺炎以来,新冠病毒迅速席卷全球,对人类的生命健康造成了巨大的威胁。SARS-Co V-2通过S蛋白与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,实现对宿主的入侵。在这一过程中,来源于宿主的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)对S蛋白的切割是必不可少的。现如今,急需针对新冠病毒开发有效的疫苗和药物,而合适的新冠易感动物模型能够在其研发和评估阶段发挥重要作用。目前已开发出用于新冠研究的小鼠模型,但存在诸多弊端。猪作为与人类在体积,器官大小,解剖特征,基因组学和病理学等方面都十分相似的生物,尤为适合作为人类疾病的研究模型。本研究提出了将人源TMPRSS2基因定点整合至猪ROSA26基因位点的思路,基于前期针对猪ROSA26位点建立的定点整合体系,成功筛选并获得了hTMPRSS2基因在猪ROSA26位点定点整合的猪胎儿成纤维细胞,最终结合体细胞核移植技术和胚胎移植技术,成功获得了2头F0代hTMPRSS2基因编辑猪。此外,基因编辑猪模型在饲养、扩繁和个体攻毒等过程中常面临猪源病菌感染的威胁,阻碍了基因编辑猪用于后JQ1体内实验剂量续疫苗、药物开发等相关的研究进程。有研究表明,TMPRSS2的过表达可提高宿主细胞对PEDV的易感性。因此,本研究进一步GSK1120212以PK15细胞为研究对象,基于CRISPR/Cas9介导的定点基因编辑策略,获得了多种TMPRSS2基因编辑细胞,并探讨了hTMPRSS2在猪ROSA26位点的整合对PEDV感染的影响,为后续hTMPRSS2基因编辑猪的饲养、扩繁及个体攻毒实验提供了数据和参考。具体研究结果如下:1.借助CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过同源重组实现了在猪基因组ROSA26位点处引入外源基因hTMPRSS2,筛得了hTMPRSS2基因定点整合的胎儿成纤维细胞,并以此为供体细胞,利用体细胞核移植和胚胎移植技术,获取了表达hTMPRSS2的F0代基因编辑猪。通过解剖阳性及野生型猪,分离得到不同组织及成纤维、肾皮质细胞。2.通过电转染,挑取单克隆的方式筛得了hTMPRSS2基因在猪ROSA26位点定点整合的PK15细胞。使用野生型PK15与阳性PK15细胞以相同比例接种PEDV病毒,提RNA反转录后,利用q PCR检测两组病毒拷贝数差异。结果表明hTMPRSS2的插入使原本对冠状病毒PEDV不易感的PK15细胞获得更强的感染能力。随后,我们设计了导向猪源TMPRSS2基因的sg RNA打靶载体,同样借助CRISPR/Cas9基因编辑系统,筛选出了p TMPRSS2基因敲除的PK15细胞,用以确认TMPRSS2参与PEDV的感染。细胞接毒结果显示,与野生型相比,TMPRSS2基因的缺失导致了PEDV感染PK15细胞的拷贝数降低。3.扩大培养由阳性及野生型猪分离得到的原代肾皮质细胞,并将其以MOI为0.01感染PEDV,进一步在细胞水平上评估hTMPRSS2在猪ROSA26strip test immunoassay位点的整合对猪源病毒的影响。实验结果证明,PEDV在阳性猪肾皮质细胞中的拷贝是野生型中的100倍。