目的:研究不同进食频率对糖稳态的影响和HDAC3在进食频率调节组织节律蛋白中的作用,以期为糖尿病的防治在进食方面提供科学的指导意见。方法:1进食频率对组织节律蛋白的调节在糖稳态中的作用:将4周龄48只KK~(ay)小鼠饲养在宁夏医科大学动物实验中心,恒温恒湿,14小时黑暗,10小时光照,反复循环,自由获取水,饲料为一般混合粉末饲料。黑暗时间为上午7点至下午9点(ET0-14),光照时间为下午9点至次日上午7点(ET14-24)。适应性喂养三天后,将小鼠随机分为三餐组和多餐组,60天后,剩余小鼠肝脏和骨骼肌组织于-80℃保存,检测血糖、胰岛素、肝糖原、肌糖原,以及Western Blot法检测肝脏和骨骼肌组织中生物钟的节律蛋白表达。2 HDAC3在进食频率调节组织节律蛋白中的作用:称取组织重量,加入一定量的PBS,匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右后,收集上清,且对标准品进行稀释。然后分别对空白孔、标准孔、待测样品孔进行加样。用封板膜封板后置37℃温育30分钟,同时将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用。小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次。每孔加入酶标试剂50u L,空白孔除外温育,洗涤,显色,最后加终止液,测定吸光度值。酶联免疫分析法检测肝脏、骨骼肌中HDAC3的LGX818纯度含量,Pearson相关分析HDAC3与组织蛋白节律的关系。结果:1进食方式对KK~(ay)小鼠肝脏生物钟节律蛋白表达的影响:三餐组规律进食和六餐组进食的生物钟蛋白表达都表现为正常的24h节律。相比较三餐组,六餐组的正反馈调节因子Bmal1在4时、8时蛋白表达减少(P<0.05),反馈调节作用逐渐减弱。而DEC1蛋白表达除昼夜时点20时以外,在其它时点均为上调,并且在8时,蛋白表达显著增加(P<0.01),20时蛋白表达降低(P<0.05);六餐组Erra蛋白与三餐组相比在0时、8时表达增加(P<0.05)。Rev-erba在8时和12时六餐组表达水平升高(P<0.05),22时表达水平降低。六餐组正反馈调节因子的节律谷时与三餐组趋于一致,Dec1节律蛋白表达峰时推迟8个小时,而Rev-erba的峰时提前4个小时,Bmal1蛋白表达均在8时达到高峰,且6餐组蛋白表达明显减少(P<0.05),这个情况说明Bmal1的表达可能更容易受进食行为等因素的影响。对于负反馈调节因子Cry1蛋白和Per2蛋白表达在夜间显著上升(P<0.05),在8时Cry1蛋白水平明显增加(P<0.01),12时蛋白水平明显降低(P<0.01),这说明CRY蛋白是进食周期同步所不可缺少的。2进食方式对KK~(ay)小鼠骨骼肌生物钟节律蛋白表达的影响:在光照开始前,六餐组Bmal1蛋白表达水平很快开始下降(P<0.01),且呈先升高后下降趋势,两组进食方式都在8时达到最高峰;日落以前,在0时、4时、8时、12时,六餐组Dec1蛋白含量均低于三餐组,差异有统计学意义(P<0.05),蛋白含量表达下降(P<0.05);六餐组Erra蛋白含量在8时低于三餐组,差异有统计学意义(P<0.05),在16时,三餐组含量高于六餐组,差异具有显著性意义(P<0.01),而在中午12时,Erra蛋白表达相反,六餐组蛋白表达含量增加,且高于同一时点三餐组(P<0.05)。对于Rev-erba蛋白表达含量随时间变化逐渐升高,两种进食方式可能在24h节律内循环反复,在0时六餐组蛋白表达水平明显低于三餐组(P<0.01),在4时和8时,6餐组逐渐升高(P<0.05)。Cry1作为负反馈调节因子,三餐组蛋白水平均高于六餐组(P<0.05),六餐组蛋白抑制效果减弱,且0时抑制效果不明显(P<0.01);三餐组Per2蛋白表达在20时含量水平达到高峰,差异具有明显统计学意义(P<0.01),且同时六餐组在夜间进行以后加餐以后,六餐组含量显著高于三餐组含量(P<0.01)。3进食频率对血糖和胰岛素的影响:三餐组0时血糖浓度高于六餐组,而在早晨8时进餐以后,六餐组含量稍高于三餐组(P<0.05);在夜间4时,六餐组胰岛素浓度高于三餐组,在12时,三餐组胰岛素浓度高于六餐组(P<0.05),在白天,血糖和胰岛素变化趋势一样。六餐组全天的平均血糖水平低于三餐组,但是血糖峰值高于三餐组,而且血糖的每日变化幅度也更大;与三餐相比,六餐进食会升高机体每日的平均胰岛素水平Tibiocalcaneal arthrodesis、胰岛素峰值和每日变化幅度。4进食节律对肌糖原和肝糖原的影响:三餐组和六餐组的肌糖原、肝糖原含量均具有良好的节律性,都是先降低再升高,三餐组肌糖原(6.81±1.16)、肝糖原(11.81±1.45)含量都在0点达到最大值。在白天,六餐组肝糖原含量均高于三餐组,且差异具有显著性意义(P<0.01);在16时,六餐组肌糖原含量(5.94±0.42)高于三餐组(2.50±0.51)。5进食节律对肝脏、骨骼肌中HDAC3的影响:在夜间0时和4时,三餐组的肝脏HDAC3含量高于六餐组,且差异有统计学意义(p<0.05);而在骨骼肌中,0时、8时六餐组HDAC3含量高于三餐组,4时六餐组HDAC3含量(15.13±0.64)显著高于三餐组(10.99±0.55)(P<0.01),HDAC3含量表达升高,增加了时钟蛋白的去乙酰化程度,在12时三餐组(12.69±0.86)含量高于六餐组(9.38±0.99)含量,差异具有统计学意义(P<0.05)。6 HDAC3与小鼠肝脏组织节律蛋白相关性的关系:采用Pearson相关分析,发现在肝脏三餐节律蛋白的表达中,肝脏中HDAC3含量与Per1/2/3有显著相关性,且呈现正相关。在肝脏六餐中节律蛋白的表达中,HDAC3含量与节律蛋白没有相关性。骨骼肌三餐中节律蛋白的表达中,HDAC3含量与节律蛋白无相关性;而发现在骨骼肌六餐中节律蛋白的表达中,HDAC3含量与Per2呈正相关。在肝脏和骨骼肌这些外周组织中,发现Rev-erba蛋白在三餐组和六餐组中的表达与HDAC3均具有负相关,且在骨骼肌中的相关表达更显著。结论:我们的研究表明,体内不同的生物钟受到食物信号的影响亦有差别,多个振荡器指导着人类的生物钟。在负反馈环上,HADC3存在昼夜节律变化,通过时间上分离的对立功能对Alpelisib生产商于昼夜节律蛋白的震荡表达进行调控,其失调可能导致机体正常代谢活动。进一步印证了本研究中进食频率最终导致HDAC3对节律蛋白的影响的差异。