H5N1是一种高致病性、高传染性和高突变性禽流感病毒,通过感染呼吸系统引起鸡、鸭、鹅等禽类的感染。H5N1亚型禽流感在目前规模化养殖体系里集中爆发会对养殖业造成极大的经济损失,也会对公共卫生安全造成重大威胁。疫苗接种是预防死亡和降低禽流感发病率的最具成本效益的干预措施。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗作为一种新型疫苗具备更安全、更易制造和存储,并且具有在病毒大流行时能够快速的大量的生产等方面的优势,是非常具有应用前景的新型疫苗。但由于DNA疫苗只截取了病毒部分抗原表位的序列,因此其免疫原性不如减毒或灭活疫苗,此外DNA转染后在组织中易被降解,不能自由透过细胞膜导致细胞有效摄取量较少等因素也限制了其广泛使用。改善DNA疫苗递送体系,并添加合适的佐剂增强宿主对DNA疫苗的特异性免疫应答能够有效解决目前DNA疫苗应用存在的瓶颈问题。近些年来,纳米技术发展迅速,越来越多的纳米材料投入到DNA疫苗的载体应用当中。研究发现纳米载体能够保护DNA疫苗在细胞外不被DNA水解酶降解,具有较好的抗原储库效应,能够持续缓慢的释放抗原,增加APCs对抗原的摄取,从而高效的、持久的刺激宿主产生免疫应答,是一种极具前景的DNA疫苗递送方法。在DNA疫苗的开发中,佐剂的作用同样不能忽视。2018年Mn~(2+)的佐剂作用被开发出来,胞内高浓度的Mn~(2+)可以激活c GAS-STING信号转导通路,而c GAS-STING信号被认为是先天免疫和适应性免疫的桥梁,胞内过载Mn~(2+)有助于促进树突状细胞(DCs)的成熟和迁移,增强杀伤性T细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞)毒性效应,因此Mn~(2+)作为一种新型金属离子佐剂备受学术界的关注。另外,在细胞中存在多种2价金属离子,如Mg~(2+),Fe~(2+),Cu~(2+),Co~(2+)等,这些2价金属离子在细胞内调节不同的生理功能。人为的将这些2价金属离子细胞内过载,可能会产生一些特殊的生物学效应。这些2价金属离子能否像Mn~(2+)一样具有佐剂作用值得我们深入研究,因此开发一种通用的2价金属离子佐剂筛选的平台,对发现更多2价金属离子佐剂具有重要的意义。在本研究中,我们成功构建一种具有水性内核结构的磷酸锰核心,将H5N1质粒DNA疫苗(pDNA HA Re11)高效装载于水性内核当中,表层覆盖DOPA\DOTAP\DSPE-PEG2000的脂质纳米粒(pDNA HA Re11@Nano Mn)。这种脂质纳米粒具有高效运载及保护pDNA疫苗的作用,能够增强抗原递呈细胞吞噬及活化,并且细胞内过载Mn~(2+)可以激活Ⅰ型干扰素反应,增强免疫细胞的活化。结果证明,pDNA HA Re11@Nano Mn可以有效的递送pDNA HA Re11,同时激活宿主的细胞免疫和体液免疫应答。进一步我们以这种金属离子脂质纳米粒的制备方法包载Co~(2+),Mg~(2+),Ca~(2+)二价金属离子,通过体内、外实验中证实了这种金属离子脂质纳米粒的制备方法可以拓展为2价金属离子佐剂筛选平台,用以筛选出更多更为优秀的金属离子佐剂。主要研究结果如下:1.通过粒径selleckchem Naporafenib,电位和包封率最终确定形成pDNA HA Re11@Nano Mn的最佳Mn/P摩尔比为1:100。PSS测得其水合粒径为46.49±1.71 nm,Zeta电位为18.23±2.22 m VBiotic interaction。pDNA HA Re11@Nano Mn具有较好的包封率(83.31%±1.84%),其Mn~(2+)的含量为4.62±0.256 m M。另外pDNA HA Re11@Nano Mn具有较好的储存稳定性和胶体稳定性。在体外实验验证中,pDNA HA Re11@Nano Mn能够有效保护pDNA HA Re11不被DNase I降解,有效提高pDNA HA Re11的递送效率。并且pDNA HA Re11@Nano Mn体外释放体现出p H响应性。2.pDNA HA Re11@Nano Mn含有的金属阳离子和阳离子脂材具有较好的缓冲容量,使得pDNA HA Re11@Nano Mn具有p H响应性。缓冲容量测定实验、红细胞裂解实验以及激光共聚焦实验均证实pDNA HA Re11@Nano Mn通过溶酶体逃逸过程将pDNA HA Re11递送至细胞质内进行表达。我们进而验证了pDNA HA Re11@Nano Mn能够激活BMDGSK1120212化学结构Cs,促进其成熟分化并释放细胞因子,为下一步体液免疫和细胞免疫激活打下基础。3.pDNA HA Re11@Nano Mn有较好的抗原储库效应。pDNA HA Re11@Nano Mn能够显著提高小鼠血清中HI滴度,提高小鼠血清中特异性抗体Ig G水平,相比较市售Al佐剂,pDNA HA Re11@Nano Mn能够同时激活小鼠的体液免疫和细胞免疫。于此同时,pDNA HA Re11@Nano Mn具有较好的体内应用安全性。4.通过pDNA HA Re11@Nano Mn制备方法制备了pDNA HA Re11@Nano Co,pDNA HA Re11@Nano Mg,pDNA HA Re11@Nano Ca三种脂质纳米粒,通过体外表征,3种脂质纳米粒具有相似的形态、稳定性和装载效率。通过体内、外实验证实我们构建的脂质体制备方法能够搭载多种2价金属离子,在体内和体外实验中证实可有效验证2价金属离子是否具有佐剂作用,并比较其免疫激活的能力。可将这种2价金属离子脂质纳米粒制备方法进一步拓展为2价金属离子佐剂的筛选平台。