H1N1是感染哺乳动物最重要的A型流感病毒亚型,能够导致动物上呼吸道和下呼吸道感染,引起发烧、咳嗽、食欲不振、精神萎靡等临床症状,影响动物生长发育,严重还会引起死亡,不仅给养殖业带来重大的经济损失,同时也威胁着全球公共卫生安全。非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1)是一种只存在于流感病毒感染的细胞中,而在病毒粒子中不存在的病毒蛋白,其在调节宿主基因表达、拮抗干扰素(interferon,IFN)、抑制宿主先天性免疫应答、调节细胞凋亡及影响病毒毒力等方面发挥着重要作用。通过比对Geen Bank和GISAID中H1N1毒株的NS基因序列,发现流行于2009年以前和流行于2009年及以后的毒株在第90、123、125、131和205这5个位点氨基酸存在明显差异。据此,本研究在此基础上构建了6种不同的NS1模式,随后分别与真核表达载体p EGFP-N1连接,并通过反向遗传技术拯救各模式病毒以检测NS1蛋白对IFN-β和细胞凋亡的影响差异。GFP荧光强度和Western blot实验结果显示,各模式p EGFP-NS1能够正常的表达及定位。在加入干扰素诱导剂之后,各NS1模式蛋白的表达均受到了抑制,且与p EGFP-NS1/P1相比,p EGFP-NS1/P6受到的抑制作用更为显著。在此基础上检测了NS1模式对IFN-β及其相关基因的影响差异。双荧光素酶实验结果显示p EGFP-NS1/P2的NF-κB和IRF3启动子活性高于其他模式,而p EGFP-NS1/P5和p EGFP-NS1/P6的NF-κB和IRF3启动子活性低于其他模式。qPCR实验结果显示,与pEGFP-NS1/P1相比,pEGFP-NS1/P2的RIG-I、IFN-β和ISGs的转录水平均明显升高,p EGFP-NS1/P5和p EGFP-NS1/P6的RIG-I、IFN-β、Mx和ISGselleck GSK J415的转录水平均明显降低。ELISA实验结果显示,与p EGFP-NS1/P1相比,p EGFP-NS1/P2无论是在24 h还是在48 h的细胞和细胞上清中IFN-β和ISG15的表达都明显升高,而p EGFP-NS1/P6明显降低。而后检测neuromuscular medicine了在细胞凋亡诱导下各NS1模式对IFN-β的表达的影响差异,由qPCR和ELISA结果可知,与p EGFP-NS1/P1相比,p EGFP-NS1/P2的IFN-β和ISG15的转录和表达都明显升高,而p EGFP-NS1/P6明显降低。随后检测了在干扰素诱导下各模式NS1对凋亡蛋白的影响差异,由qPCR和Western blot结果可知,与p EGFP-NS1/P1相比,p EGFP-NS1/P2的促凋亡蛋白Bax和caspase-3的转录和表达都明显升高,而p EGFP-NS1/P5和p EGFP-NS1/P6的抗凋亡蛋白Bcl-2转录明显降低。caspsae-3活性检测实验结果可知,与p EGFP-NS1/P1相比,p EGFP-NS1/P2的caspase-3活性明显升高,而p EGFP-NS1/P5和p EGFP-NS1/P6明显降低。成功拯救病毒后通过TCID_(50)测得各模式NS1病毒有着相似的增殖趋势,且r NS1/P6病毒的增殖能力强于其他模式病毒,q PCR和caFUT-175细胞培养spase-3活性试验检测NS1模式病毒对IFN-β和凋亡蛋白的影响与质粒水平结果相似。综上,质粒水平和病毒水平的实验结果显示,NS1-P6拮抗IFN-β及调节细胞凋亡的能力强于其他模式,而NS1-P1/P2则相对较弱。本研究通过构建6种不同的NS1模式,重在探究不同NS1蛋白氨基酸模式对拮抗IFN-β及调节细胞凋亡能力差异,从而揭示NS1 ED区调节IFN和细胞凋亡的分子基础。