目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染成纤维细胞诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员E1(Serpin family E member 1,Serpin E1)的表达与胃癌细胞之间的相互作用,探讨成纤维细胞来源的Serpin E1促进胃癌细胞生长和腹膜转移的机制。方法:(1)蛋白免疫印迹(Western bolt)检测2株胃上皮/癌细胞系(GES-1、AGS)、3株人原代胃癌细胞(GC-1、GC-2、GC-3)、1株胃纤维细胞系(Hs738)及3株人原代胃癌相关纤维细胞(CAF-1、CAF-2、CAF-3)中Serpin E1的表达。(2)以H.pylori感染复数(MOI)为50感染胃成纤维细胞,用Western bolt及免疫荧光(IF)检测Serpin E1表达,细胞因子芯片(含36种细胞因子)及酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清中Serpin E1水平。(3)用Transwell小室构建人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与成纤维细胞共培养模型,上室加入HUVECs,下室加入H.pylori感染或未感染的成纤维细胞及其来源的条件培养基,检测HUVECs迁移到下室面的细胞数,评价趋化作用。(4)用Transwell小室构建HUVECs(下室)与高表达Serpin E1cancer and oncology的Hs738细胞(Hs738 Serpin E1,加入上室)共培养模型,Western bolt、IF检测HUVECs中血管内皮生长因子a(VEGFa)的表达。(5)构建Hs738 Serpin E1与HUVECs直接与间接共培养模型,EILSA检测共培养上清中VEGFa的浓度。(6)4周龄雄性BALB/c裸鼠各5只,原代胃癌细胞和高表达Serpin E1 Hs738以4:1的比例混合皮下注射入裸鼠右侧腋,28天后麻醉处死小鼠,检测移植瘤的体积(V=1/2×长度×宽度2)和重量来评估肿瘤生长;以同样比例将混合细胞腹腔注射到裸鼠,28天后麻醉处死小鼠,计数裸鼠腹膜中肿瘤结节,取肿瘤结节制备组织切片,HE染色评价病理变化,免疫组织化学(IHC)检测Ki67、Serpin E1、CD31、VEGFa表达。(7)用外源性重组蛋白Serpin E1(recSerpin E1)处理HUVECs,Transwell实验检测recSerpin E1对HUVECs趋化作用,Western bolt、IF检测HUVECs 中 VEGFa表达,加入Serpin E1抗体,Western bolt检测HUVECs中VEGFa表达,小管形成实验检测HUVECs管状形成。(8)recSerpin E1、Serpin E1抗体及MAPK信号通路阻断剂(E)-Osmundacetone单独或共处理HUVECs,Western bolt检测P38、ERK1/2、JNK及其磷酸化蛋白和VEGFa的表达。(9)收集裸鼠腹膜转移的肿瘤结节,GC+Hs738 Serpin E1及GC+Hs738 NC组各3个,进行转录组学研究。以差异倍数>1.2及FDRS≤0.05为条件筛选差异表达基因(DEGs);进行GO、KEGG通路富集分析;利用GEPIA在线工具及胃腺癌TCGA数据库,分析Top15 DEGs在胃癌组织中的表达及生存分析。结果:(1)Serpin E1主要在胃成纤维细胞中表达。(2)H.pylori感染CAFs后Serpin E1的表达增加,培养上清液中Serpin E1水平增加。(3)H.pylori感染的CAFs和Hs738细胞及其来源的条件培养基增加了 HUVECs从Transwell上室迁移到Transw此网站ell下室的细胞数(p<0.05),促进HUVECs的趋化作用。(4)高表达Serpin E1的Hs738细胞促进HUVECs中VEGFa的表达与分泌(p<0.05)。(5)Hs738 Serpin E1与GC细胞共注射能促进裸鼠皮下移植瘤的生长,其瘤体体积及重量显著高于Hs738 NC与GC细胞共注射组(p<0.05);裸鼠腹腔注射实验显示:高表达Serpin E1的Hs738与GC细胞共注射能促进GC细胞在腹腔中扩散,腹腔中肿瘤结节数显著多于Hs738 NC+GC共注射组。HE染色显示:三组裸鼠腹腔肿瘤结节存在着局灶性坏死,但GC+Hs738 Serpin E1组与GC+Hs738 NC组中局灶性坏死显著减轻,尤其是GC+Hs738 Serpin E1组中局灶性坏死减轻最明显;IHC分析显示:肿瘤结节中VEGFa和CD31的表达随着Serpin E1表达增加而增加(p<0.05)。(6)与对照组比较,1ng/mL 与 10ng/mL recSerpin E1均增加了 HUVECs从Transwell上室到下室的迁移细胞数,1ng/mL recSerpin E1处理组中作用最强(p<0.05)。1ng/mL与5ng/mL recSerpin E1处理两株内皮细胞后VEGFa表达显著增加(p<0.05)。加入Serpin E1抗体(1μg/mL和2μg/mL)能抑制recSerpin E1诱MG132抑制剂导的VEGFa表达与管状形成,当Serpin E1抗体浓度达到2μg/mL时,VEGFa表达及管状形成抑制最明显(p<0.05)。(7)与对照组比较,recSerpin E1增强了 P38 MAPK的磷酸化及VEGFa表达,但对ERK1/2和JNK MAPK没有显着影响;加入Serpin E1抗体(2μg/mL)及入MAPK通路抑制剂(E)-Osmundacetone 能抑制了 recSerpin E1 介导的 P38 磷酸化和 VEGFa 表达(p<0.05)。(8)转录组学结果显示:GC+Hs738 Serpin E1 及 GC+Hs738 NC组内样本数据相对集中,有较好重复性;筛选出178个DEGs,其中39个基因上调,139个基因下调;DEGs主要参与细胞过程、生物调节及代谢过程等生物过程;参与细胞及细胞组分等细胞组成;参与结合及催化活性等分子功能;参与丁酸代谢、代谢途径及多种物质代谢等KEGG通路,这些信号通路与代谢通路与肿瘤的发生、发展密切相关。(9)Top15 DEGs中7个DEGs(CTSS、KRT80、PDZK1IP、SEMA3C、FSTL1、SLC27A2、LOX)在胃腺癌组织中的表达显著高于正常组织,FSTL1、LOX的表达与胃癌患者10年生存率负相关(p<0.05)。结论:(1)Serpin E1主要在胃成纤维细胞中表达。(2)H.pylori感染可诱导成纤维细胞表达Serpin E1,高表达Serpin E1的Hs738能促进GC细胞的裸鼠皮下生长和腹膜转移。(3)Serpin E1激活P38 MAPK-VEGFa信号参与GC生长。