背景:新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是导致新生儿脑损Torin 1抑制剂伤及死亡的重要疾病,包含不同的病理生理学机制和多种神经功能障碍。HIE治疗手段有限,低温治疗是目前唯一的能改善HIE神经损伤的方法,但幸存者仍然会出现严重的后遗症,如脑瘫、认知障碍、焦虑情绪等。因此,临床迫切需要寻找有效的HIE替代疗法。染料木AMG510细胞培养素磺酸钠(genistein-3′-Sodium Sulfonate,GSS)是由植物雌激素染料木素磺化修饰后获得的化合物,具有较强的水溶性。以往研究表明,GSS对大鼠脑中动脉栓塞和新生鼠HIE脑损伤均能发挥较好的神Spine biomechanics经保护作用,但在HIE中的作用机制尚不清楚。铁死亡是近年来确定的一种铁依赖的细胞死亡方式,与HIE密切相关,抑制铁死亡可以缓解HIE神经损伤。因此,本实验采用新生大鼠HIE模型,旨在明确GSS是否通过抑制脑缺血缺氧康复期铁死亡发挥作用,并探讨其作用的分子机制,为进一步揭示GSS的神经保护作用及机制提供充分的实验依据。目的:通过在体实验,观察新生大鼠脑缺血缺氧过程中脑组织中铁死亡的变化;明确GSS对HIE新生大鼠的脑保护作用;阐明GSS通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号通路减轻HIE新生大鼠铁死亡,从而发挥脑保护作用的机制。方法:选择出生7天的健康SD大鼠,雄雌兼用,体重为12～18 g,应用Rice-Vannucci方法构建新生大鼠HIE模型。为明确新生大鼠脑缺血缺氧过程中脑组织中铁死亡的变化,我们在新生大鼠缺血缺氧后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、21 d、28 d采集脑组织样本,DAB增强的普鲁士蓝铁染色方法检测新生大鼠脑铁沉积及脑损伤情况,WB实验检测脑损伤侧皮层GPX4、x CT、ACSL4蛋白的表达。为进一步阐明GSS是否通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号通路减轻HIE新生大鼠铁死亡,从而发挥脑保护作用的机制。本实验采用腹腔注射1 mg/kg GSS持续治疗21天,同时给予铁死亡的激动剂Erastin和GPR30的抑制剂G15进行干预。右脑/左脑重量比检测新生大鼠缺血缺氧后的脑梗死情况;Y迷宫实验评估新生大鼠缺血缺氧后的认知能力;高架十字迷宫和旷场实验评价新生大鼠缺血缺氧后的焦虑样行为;WB实验检测脑损伤侧皮层铁代谢相关指标TFR、FHC、FPN1,铁死亡相关指标GPX4、x CT、ACSL4,雌激素受体GPR30、ERα、Erβ、STAT3-Hepcidin信号通路相关指标STAT3、p-STAT3、Hepcidin的蛋白表达情况;透射电镜实验观察脑损伤侧皮层神经元铁死亡特征性线粒体损伤情况;DAB增强的普鲁士蓝铁染色方法检测新生大鼠脑铁沉积及脑损伤情况;免疫荧光染色检测脑损伤侧皮层Neu N、GPX4蛋白表达情况;免疫组织化学染色检测脑损伤侧皮层4-HNE、Hepcidin蛋白表达情况;分子对接技术分析GSS与雌激素受体GPR30、ERα、Erβ的结合力。结果:1.新生大鼠脑缺氧缺血过程中脑组织中铁死亡的变化铁染色结果表明,各时间点Sham组没有明显的铁聚集,而与Sham组相比,HI组脑缺血侧铁聚集逐渐增加,并在造模后第21 d铁沉积最多且脑缺失程度最大,随后逐渐恢复。全脑解剖组织图像显示,脑缺血缺氧侧从水肿到梗死,脑损伤程度逐渐增强,在造模后第21 d脑损伤最大,之后逐渐恢复。WB结果表明,与Sham组比,随着时间的延长,HI组GPX4蛋白表达逐渐下降,在第21 d降低趋势最显著,随后趋于稳定;HI组x CT蛋白表达早期无明显变化,但在第14d开始有所下降;HI组ACSL4蛋白表达在第21 d表达升高,其余时间点的表达均降低;此外,随着新生鼠的发育,Sham组GPX4蛋白表达呈递增的趋势;x CT蛋白表达出现先升后降的趋势;ACSL4蛋白表达出现先降后升的趋势。2.GSS对HIE新生大鼠的脑保护作用Neu N免疫荧光和右脑/左脑重量比结果表明,HI组Neu N的荧光强度显著降低,神经元大量丢失,表现出明显的脑萎缩,而GSS治疗可以明显减少神经元的丢失,促进脑损伤的恢复;Y迷宫结果显示,与Sham组大鼠相比,HI组大鼠自发交替行为和探索行为减少,给予GSS治疗后得到明显改善;高架十字迷宫结果显示,与Sham组大鼠相比,HI组大鼠进入开放臂及在开放臂探头的频率和时间显著减少,给予GSS治疗可显著增加大鼠进入开放臂和探头的频率和时间;旷场实验结果表明,与Sham组大鼠相比,HI组大鼠进入中心区的频率和在中心区停留的时间均显著降低,而给予GSS治疗后,进入中心区的频率和停留时间均有所提高。3.GSS通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号通路减轻HIE新生大鼠铁死亡,从而发挥脑保护作用(1)GSS通过抑制铁死亡缓解HIE新生大鼠脑损伤铁染色和透射电镜结果表明,与Sham组相比,HI组铁沉积明显增多、线粒体明显萎缩并呈空泡状,而GSS治疗后铁沉积显著减少,线粒体恢复趋于正常;免疫组化和WB结果表明,与Sham组相比,HI组GPX4、x CT、TFR、FHC蛋白表达均明显下降,ACSL4、4-HNE蛋白表达明显升高,而GSS治疗后GPX4、x CT、TFR、FHC蛋白表达显著上调,ACSL4、4-HNE蛋白表达显著下调。在给予铁死亡诱导剂Erastin进行干预后,发现Erastin取消了GSS对HIE新生大鼠认知障碍、焦虑行为及脑损伤的抑制作用;透射电镜结果表明,与HI+GSS组相比,Erastin干预后线粒体明显变小,甚至出现空泡化;WB实验结果表明,与HI+GSS组相比,Erastin干预后GPX4、x CT蛋白表达下调,ACSL4蛋白表达上调。(2)GSS通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号通路减轻HIE新生大鼠铁死亡分子对接和WB结果表明,GSS与三种雌激素受体的结合力为:GPR30>ERβ>Erα;免疫组化和WB结果表明,与Sham组相比,HI组GPR30蛋白表达减少,p-STAT3、Hepcidin蛋白表达升高,FPN1蛋白表达降低,而给予GSS治疗后GPR30蛋白表达显著增加,p-STAT3、Hepcidin蛋白表达显著降低,FPN1蛋白表达显著升高。在给予GPR30抑制剂G15进行干预后,发现G15取消了GSS改善HIE新生大鼠认知障碍、焦虑情绪及脑损伤的作用;透射电镜结果发现,与HI+GSS组相比,G15干预后线粒体体积明显变小,甚至出现空泡化;WB结果表明,与HI+GSS组相比,G15干预后GPX4、x CT蛋白表达下调,ACSL4、p-STAT3、Hepcidin蛋白表达上调。结论:1.铁死亡参与了HIE病理过程,且随时间呈进行性增强。2.GSS长期治疗缓解HI诱导的新生大鼠认知障碍和焦虑情绪。3.GSS长期治疗抑制HI诱导的新生大鼠脑组织铁死亡。4.GSS通过GPR30调控STAT3-Hepcidin信号通路抑制HI诱导的新生大鼠铁死亡,改善神经功能损伤。