背景及目的:胰腺癌是消化系统预后最差的恶性肿瘤之一,5年生存率仅约10%。胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是胰腺癌最主要病理类型,目前,根治性手术切除仍是治疗PDAC的唯一方法,但能够接受手术切除的患者比例不足20%。对于进展期胰腺癌患者,化疗、放疗、靶向治疗等效果十分有限。PDAC具有独特的间质特征:广泛且显著的纤维间质。活化的胰腺星形细胞(Pancreatic stellatecells,PSCs)是肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)中最丰富的间质细胞,分泌大量细胞外基质,介导间质纤维化的形成。同时,PSCs参与TME的调控和胰腺癌细胞(Pancreatic cancer cells,PCCs)之间信号的传递,对PDAC的代谢和进展至关重要。随着对肿瘤代谢的深入研究,干预肿瘤代谢在恶性肿瘤的治疗和预后预测等多个层面实现突破。PDAC具有独特的代谢特征,表现为肿瘤细胞和间质细胞间的代谢重编程,以及肿瘤细胞对谷氨酰胺(Glutamine,Gln)依赖增加。然而,PSCs介导的肿瘤和间质之间的Gln代谢相互作用及具体机制尚不清楚。本实验旨在研究GS介导PSCs的Gln代谢对PCCs增殖的调控作用及分子机制。方法:本研究利用PDAC原位小鼠模型尾静脉注射[U-13C]-Gln,进行同位素示踪的定性代谢流分析,解析肿瘤组织对Gln的摄取情况。通过单细胞转录组基因集、实时定量荧光PCR和蛋白质印迹(Western blot,WB),分析Gln代谢通路关键酶的转录及蛋白表达水平,明确TME中不同细胞类型尤其是间质和肿瘤细胞之间的代谢异质性。通过PDAC组织芯片、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和多重免疫荧光(Multiplexedimmunofluorescence,mIF)染色等分析谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)在肿瘤及间质的表达水平与临床病理特征之间的关系。利用克隆形成实验探究Gln浓度对PSCs和PCCs细胞增殖的影响。线粒体压力测试评估PSCs对PCCs代谢的影响。采用代谢组学明确PSCs向PCCs提供的代谢物。使用小干扰RNA抑制GS表达,以CCK-8实验检测PSCs-PCCs体外共培养模型中肿瘤细胞的增殖能力。通过Gln合成分泌、NADPH/NADP+比值和细胞周期检测研究GS介导PSCs促肿瘤增殖的机制。建立GS敲降的稳转PSCs与PCCs混合的PDAC原位小鼠模型,通过小动物超声成像和IHC评价体内实验中GS的促肿瘤增殖作用。经数据库预测Wnt/β-catenin与GS潜在的结合位点,联合染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)、荧光素酶报告基因、免疫荧光染色等技术,同时利用回复实验、构建突变体和截短体,探讨上游信号通路对GS的转录调控作用,明确PSCs中Wnt/β-catenin介导Gln代谢促进PCCs增殖的分子机制。结果:在PDAC原位小鼠模型尾静脉注射[U-13C]-Gln后,正常组织中13C-Gln浓度迅速增加,相比之下,肿瘤组织中13C-Gln的富集度低于癌旁正常组织。此外,肿瘤核心区域Gln及TCA循环中间产物的水平均呈现下降趋势。单VX-765半抑制浓度细胞RNA测序数据集分析显示,Gln合成代谢通路关键酶GS、谷氨酸草酰乙酸VX-661使用方法转氨酶2、谷氨酸脱氢酶在间质细胞中高表达,在肿瘤细胞中低表达。PDAC组织的IHC结果表明,包括PSCs在内的间质成纤维细胞是表达GS的主要细胞类型。利用PCCs与PDAC来源的PSCs,在mRNA和蛋白水平中证实上述结果。基于IHC分析,GS在间质细胞中的表达水平明显高于肿瘤细胞(P<0.001)。PDAC肿瘤或间质中GS的高表达分别与肿Biostatistics & Bioinformatics瘤低分化相关(P<0.01;P=0.015)。间质中GS高表达与淋巴血管侵犯及T1-T2分期显著相关(P=0.003;P=0.034)。单因素和多因素分析显示,肿瘤和间质中GS高表达是PDAC患者不良预后的独立预测因素(P<0.05)。mIF进一步显示GS和PSCs标志物平滑肌肌动蛋白共表达。体外实验中,随着Gln浓度的降低,PCCs增殖能力下降,而PSCs无影响。此外,线粒体压力测试显示PSCs分泌的Gln可增加PSCs的基础耗氧率。PSCs和PCCs交叉共培养的代谢组学结果证实,PSCs向PCCs提供差异代谢物是Gln。PSCs-PCCs的2D共培养模型中,敲降PSCs中GS,PSCs分泌的Gln和PCCs摄取的Gln水平显著降低,PSCs和PCCs的NADPH/NADP+比值下降,且PCCs细胞周期中G1期细胞明显增多。同时,GS敲降的PSCs条件培养基培养PCCs,抑制肿瘤细胞的增殖。利用GS敲降的稳转PSCs与PCCs混合成功构建PDAC原位小鼠模型,敲低GS组小鼠肿瘤体积和重量明显减小,且Ki-67增殖指数下降。机制上,在PSCs中转染si-β-catenin后,GS的mRNA和蛋白水平均降低;Wnt3a处理激活Wnt/β-catenin通路,可诱导β-catenin入核增加,胞质中GS表达升高。进一步利用ChIP和荧光素酶报告基因实验分析,TCF7被证实为β-catenin的转录共激活因子,其直接与GS启动子区域结合,激活PSCs中GS的表达。回复实验中,敲低β-catenin显著抑制PSCs中GS表达和Gln合成,PSCs条件培养基培养PCCs后,肿瘤细胞的增殖明显降低。过表达GS可挽救由β-catenin敲低导致的GS表达下降、Gln合成能力降低和PSCs促肿瘤作用减弱。结论:深入理解间质细胞-肿瘤细胞相互作用机制,有助于寻找肿瘤能量代谢通路新靶点。本研究发现,PDAC中间质细胞和肿瘤细胞之间存在代谢异质性,PSCs中Gln合成代谢通路的关键酶高表达,尤其是GS显著上调。肿瘤及间质中GS高表达是PDAC患者不良预后的独立预测因子。PSCs通过上调Gln的合成分泌、NADPH/NADP+比值和细胞周期促进PCCs增殖。Wnt/β-catenin通路与GS启动子直接结合并上调GS的表达。PSCs通过Wnt-β-catenin-TCF7-GS轴介导Gln代谢并促进PCCs的增殖。