棉花纤维是重要的天然纺织原材料,关系着国计民生。棉花纤维可以分为长绒和短绒两类:长绒在开花前后起始分化,长度长且整齐,是重要的天然纺织原材料;短绒在开花后4-6天分化起始,长度短且剥绒工序繁琐,无法用于纺织工业。已有研究提出长、短绒分化起始可能由同一套核心调控网络决定,但机制目前还不明确。本实验室前期获得了基于徐州142与徐州142无绒无絮突变体杂交的3个近等基因系有LF(长绒多有短绒)、LM(长绒多无短绒)和LL(长绒少无短绒)。本研究利用这套遗传背景一致、单位点差异的近等基因系进行了如下研究:1.GhMYB25-like＿At SNPA314T控制长绒少无短绒突变体www.selleck.cn/products/PD-0325901LL的表型。为了解析LM自交群体的遗传特性,对其纤维表型进行考察,发现在LM自交群体中长绒少与长绒多的单株的比例为1:3,长绒多相对于长绒少为显性性状;无短绒与有短绒单株的比例为3:1,无短绒相对于有短绒为显性性状;长绒多少或者短绒有无均由同一个单基因/位点控制。为了克隆该突变位点,在LM自交群体中挑选LF表型和LL表型的极端单株通过混合分离分析法(BSA),将突变位点初步定位到A12染色体上一个2.24Mb的区间。进一步精细定位发现纤维表型与转录因子GhMYB25-like＿At上的SNP A314T共分离,SNP A314T位于GhMYB25-like＿At的DNA结合域上,导致氨基酸由带正电的碱性赖氨酸(K)突变成不带电的非极性甲硫氨酸(M)。2.亚基因组特异敲除株系GhMYB25-like＿At CR2表型揭示LL的GhMYB25-like＿AthapT是显性负性突变。研究GhMYB25-like＿AthapT功能最直接的方式是对GhMYB25-like＿At进行单碱基编辑,但由于PAM结构域的限制无法实现。因此本研究在GhMYB25-like＿At基因的不同位置上设计了靶点进行编辑。在GhMYB25-like＿At CR1敲除株系中,sgRNA1特异靶向GhMYB25-like＿At基因组序列的起始密码子后的11-32bp,导致移码突变,翻译在11aa处提前终止,相当于特异完全敲除At亚组基因。在GhMYB25-like＿At CR2敲除株系中,sgRNA2特异靶向起始密码子后的336-358bp,导致移码突变,翻译在111aa处提前终止,产生了可能丧失正常功能但又可以翻译的非全长蛋白。已有研究表明同时敲除At/Dt两个亚组的GhMYB25-like,既无长绒也无短绒。GhMYB25-like＿At特异敲除株系的纤维表型分析发现,与野生型相比,CR1种子表皮的长绒没有明显变化,短绒略有减少,且表型没有同时敲除At/Dt两个亚组的GhMYB25-like突变体明显,表明GhMYB25-like At、Dt亚组间存在功能冗余。CR2种子表皮的长绒略有减少,但短绒几乎完全消失。突变蛋白(GhMYB25-like＿AthapT或GhMYB25-like＿AtCR2)导致的短绒表型变异相较于At亚组特异完全敲除蛋白(GhMYB25-like＿AtCR1)更加明显,这表明GhMYB25-like＿AthapT和GhMYB25-like＿AtCR2对于短绒这个表型是显性负性突变,突变蛋白的存在可能干扰了 GhMYB25-like_Dt正常蛋白的功能,使表型变异更明显。3.LF、LL胚珠外珠被scRNA-seq和GhMYB25-like＿At敲除株系RNA-seq共同揭示了纤维起始相关转录因子表达下调导致长绒、短绒起始分化受阻。为了鉴定可能参与调控LF与LL长绒起始发育差异的基因,本研究对LL开花前1.5天(-1.5 Dcontinuous medical educationPA),-1,-0.5和0DPA的胚珠进行scRNA-seq,并整合已报道的LF同时期的胚珠scRNA-seq数据,获得了 LF、LL单细胞表达图谱。scRNA-seq显示在-1.5 DPA,LF与LL前体纤维细胞的发育状态没有差异,但是在-1 DPA之后,LL的纤维细胞发育逐渐停滞,并随着发育进程二者的细胞状态差异逐步扩大。但GhMYB25-like＿At的表达模式在LF、LL中没有显著差异,都在-1到0 DPA的纤维细胞中特异高量表达。在-1、-0.5 DPA的LF和LL纤维细胞中鉴定到367个差异表达基因,其中纤维起始相关TF GhHD-1、GhPDF2和GhMYB25在LL-1和-0.5 DPA纤维细胞中表达下调,说明这些纤维起始相关TFs可能作为GhMYB25-like的下游参与调控长绒起始。且与野生型相比,在-0.5 DPA胚珠表皮中,这些TFs的表达量在GhMYB25-like＿At特异完全敲除株系CR1中略有下调,在显性负性突变株系CR2中显著下调,敲除株系的基因表达模式与其表型一致。5DPA是纤维短绒起始发育的关键时期,对LF、LL的5 DPA胚珠表皮RNA-seq数据分析发现,GhHD-1、GhPDF2和GhMYB25等长绒起始相关TFs在短绒起始阶段的LL胚珠表皮中也下调表达,说明这些TFs共同参与调控长绒和短绒的起始。4.GhMYB25-like＿AthapT丧失了作为转录因子的部分功能,并抑制GhMYB25-like激活下游基因的能力,表现出显性负性效应。为了在分子层面上解析GhMYB25-like＿AthapT的显性负性效应,首先通过EMSA实验证明了 GhMYB25-like＿AthapT蛋白相较于正常GhMYB25-like蛋白,对其直接下游基因GhHD-1、GhPDF2和GhMYB25启动子上MYB顺式作用元件的亲和力下CP-690550 IC50降,说明GhMYB25-like＿AthapT丧失了部分作为转录因子的功能。进一步LCI和BiFC实验证明GhMYB25-like＿AthapT蛋白可以与正常GhMYB25-like蛋白互作,并通过LUC实验证明GhMYB25-like＿AthapT蛋白抑制了正常GhMYB25-like蛋白对下游纤维起始相关TFs的激活能力。以上结果说明,在长绒少无短绒突变体LL中,GhMYB25-like＿AthapT作为一个功能丧失的突变蛋白拥有了新的功能,通过抑制正常GhMYB25-like蛋白的功能,打破了 GhMYB25-like的功能冗余,抑制长绒和短绒的起始。并且进化选择分析发现GhMYB25-like＿AthapT作为衣分的负效应因子,在陆地棉改良过程中没有被选择利用于育种。本研究首次在植物中通过遗传定位和基因编辑发现并鉴定了天然的显性负性基因GhMYB25-like＿AthapT,并在分子生物学层面对GhMYB25-like＿AthapT显性负性效应的机制进行了解释。进一步明确了纤维起始分化“司令官”基因GhMYB25-like的调控网络,深入解析了棉纤维发育调控机制,为单细胞命运决定基础理论解析提供新的线索,为棉花育种提供了理论指导。