昆虫作为自然界中分布最广、数量最多的生物,与高等动物相比,有其独特的免疫系统和免疫机制。昆虫的免疫分为体液免疫和细胞免疫两种先天性免疫类型。ENF肽作为昆虫中广泛分布的细胞因子,参与了昆虫体内的多种生理功能,其中最主要的便是参与昆虫体内的免疫反应。当昆虫受到病原入侵时,体内的ENF肽将会被丝氨酸蛋白酶激活,从前体剪切为具有活性的形式,进而激活体内免疫反应。目前对于ENF肽的研究,大部分都集中于前期ENF肽是如何激活免疫反应的,但是后期免疫反应是如何解除以维持体内免疫平衡,防止过度反应的机制尚不清楚oncology (general)。有趣的是在很多昆虫体内除有ENF肽以外,还存在一类可以特异性结合ENF肽的蛋白,称为ENF肽结合蛋白。如生长阻抑肽结合蛋白可以特异性结合生长阻抑肽,并起到沉默其活性的功能。因此ENF肽结合蛋白在昆虫的免疫反应和自体调节过程中发挥着重要功能,是免疫反应应答环节中的重要一环。综上所述,在ENF肽参与免疫反应的过程中,存在着ENF肽激活免疫反应,免疫反应结束后由ENF肽结合蛋白终止的免疫反馈调节机制,而在这个机制中最重要的一环—ENF肽的受体蛋白尚不清楚。ENF肽受体蛋白的筛选与鉴定有利于我们更好的理解细胞因子在昆虫体内是如何发挥生理功能并维持机体稳态的,对于我们研究免疫反应解除机制也具有重要意义。本文以筛选鉴定ENF肽受体蛋白为主要研究内容,利用免疫共沉淀和液质联用技术,从家蚕脂肪体中钓取与ENF肽(PP)相互作用的受体蛋白,并进一步从细胞、组织、个体水平上鉴定ENF肽的受体蛋白参与免疫反应的调控机制。获得的主要研究结果如下:1、家蚕ENF肽(PP)受体蛋白的筛选我们采用免疫共沉淀技术,从家蚕脂肪体组织中钓取能与PP结合的膜受体蛋白,通过对差异条带挖胶进行质谱鉴定,共鉴定到191种具有跨膜序列的蛋白,进一步对这些跨膜蛋白进行生物信息分析及功能注释,从中筛选出10种可能的受体蛋白靶标。我们对这些受体蛋白靶标基因进行分子克隆,克隆得到其中9个目的基因的CDS序列,并利用同源重组技术,将其中8个目的基因构建到含有红色荧光标签的细胞过表达载体中。我们在BmE细胞上过表达这些带有红色荧光标签的目的基因后添加带有FITC标记的ENF肽PP,利用共聚焦显微镜对两者的定位进行观察,结果显示,神经肽F受体NFR和G蛋白偶联受体Mth2可以与PP发生荧光共定位的现象。体外Pull-down技术验证了NFR和Mth2均可以与PP发生结合,因此我们初步锁定NFR和Mth2为潜在的ENF肽的受体蛋白。2、家蚕ENF肽(PP)受体蛋白的鉴定为验证受体蛋白NFR和Mth2是否介导了ENF肽诱导的免疫反应,我们在BmE细胞上过表达NFR和Mth2,成功过表达48小时后向过表达细胞中添加PP进行刺激,并检测下游抗菌肽等基因的表达水平变化。其中NFR过表达后,抗菌肽等基因并无明显变化,而Mth2过表达后,下游抗菌肽Cecropin A、Moricin以及免疫激活早期基因肽聚糖识别蛋白PGRP-S2等出现明显的上调表达。同时在BmE细胞上成功干涉Mth2基因后添加PP刺激,下游Attacin、Moricin等抗菌肽基因,及肽聚糖识别蛋白PGRP-S2出现明显下调。由此可见,Mth2参与了PP引起的免疫反应调控,而NFR则不参与。进一步对Mth2进行生物信息分析,Mth2属于GPCR中的B类Methuselah(Mth)促胰液素样受体蛋白,该蛋白拥有7个跨膜结构域,在N端具有巨大的胞外结构域可以接受细胞外肽类等物质。我们利用原核表达方式表达了Mth2的N端胞外区(Mth2-Nter),发现其主要以包涵体的形式存在于沉淀中,于是采用包涵体蛋白纯化的方式获得Mth2-Nter蛋白,并进行了多克隆抗体制备。同时,我们还利用昆虫细胞杆状病毒表达体系对Mth2-Nter及Mth2全长蛋白进行了表达纯化,以探究Mth2受体蛋白发挥的免疫功能。3、Mth2参与家蚕免疫的功能验证为验证Mth2作为ENF肽的受体蛋白参与免疫应答,我们进一步在组织水平上对Mth2的免疫功能进行验证:将Mth2的抗体与离体培养的脂肪体组织孵育,再添加PP进行刺激;或将重组表达的Mth2的蛋白与PP同时添加到离体培养的脂肪体组织中进行刺激,然后检测下游抗菌肽基因的表达水平。我们发现Mth2抗体和Mth2重Baricitinib细胞培养组蛋白的添加都能有效下调PP引起的下游体液免疫。ENF肽除在脂肪体中刺激抗菌肽等基因上调表达引起体液免疫外,也会引起下游血细胞中吞噬作用相关基因上调表达引起细胞免疫。向体外培养的家蚕血细胞中添加Mth2Talazoparib核磁的抗体再进行ENF肽PP的刺激,会导致下游的吞噬作用相关基因下调表达。这些组织水平的结果表明,Mth2作为ENF肽的受体蛋白参与了家蚕的免疫应答调控。同时,我们还利用了CRISPR/Cas9技术,创建了Mth2全身性敲除的转基因家蚕。在个体水平上向敲除Mth2的转基因家蚕注射ENF肽PP,与对照组相比,其下游抗菌肽等基因在3h呈现明显的下调表达,这表明在个体水平上Mth2也参与ENF肽所引起的免疫调控。对获得的转基因家蚕的经济性状进行统计,与对照组相比其茧重、茧层率、蛹重等均无明显差异。对生长周期进行统计,发现其生长周期从幼虫期到上簇期较对照组而言延长了2天,这表明Mth2与家蚕的生长发育周期、寿命长短相关并不影响家蚕的经济效应。