登革病毒(Dengue Virus,DENV)属于黄病毒科RNA病毒,经伊蚊传播感染人后轻度会引起发烧、肌痛和皮疹等症状,甚至会出现登革出血热(Dengue haemorrhagic fever,DHF),还可能出现有休克危险的登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)。自1779年发现至今,DENV疫情暴发呈现暴发频率高等特点,波及范围较广,逐渐发展为全球性问题。目前对于DENV的抗病毒药物和预防疫苗仍未出现,给人类健康及经济发展造成巨大影响。目前研究DENV的细胞模型主要是蚊子来源以及鼠源,在人源体外模型研究中仍存在不足,且DENV感染导致的出血热及强免疫反应的机制研究仍不完善。而人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells,h BMSC)不仅是造血器官,还是重要的免疫器官,将h BMSC作为DENV感染的细胞模型,对于研究DENV导致的出血热及强炎症反应等临床症状的发生机制具有优越的适用性。目前,还没有DENV在h BMSC上建立感染模型的研究,基于此本论文开展了DENV感染h BMSC的体外模型研究。本论文取得的主要成果如下:首先选择了云南省主要流行的具代表性的DENV四种血清型病毒,利用C6/36细胞中从血浆中分离病毒。依据病毒全长序列分型显示,DENV-1、2、3、4四种血清型的基因型分别为I型、亚洲I型、III型及I型;经RT-q PCR分析显示,盲传三代之后病毒载量均从10~7copies/m L提高到10~(9-)10~(10)copies/m L;间接免疫荧光实验显示,四种血清型均能表达DENV-NS1蛋白;通过噬斑法测得DENV-1、2、3、4四种血清型的滴度分别为1.5×10~7PFU/m L、3.75×10~7PFU/m L、2×10~6PFU/m L、5.562×10~7PFU/m L。通过本实验成功分离获得具有感染性的DENV四种血清型病毒,为下一步建立h BMSC体外感染模型奠定了基础。其次建立了DENV四种血清型病毒感染h BMSC的细胞模型。通过观察细胞病变,发现DENV四种血清型均会导致细胞病变,其中DENV-2、4血清型导致h BMSC发生严重细胞病变,在96 hpi病变率达90%以上,DENV-1、3血清型在96 hpi病变率分别达到70%和50%;经RT-q PCR分析病毒增殖动力曲线显示,上清中DENV四种血清型病毒载PCI-32765采购量均在48 hpi进入平台期;正负链检测显示,正负链在各时间点均能同时被检测到且变化趋势一致;噬斑法测上清中病毒滴度显示,DENV-2、4血清型病毒滴度均在48 hpi达到峰值随后下降,DENV-1、3血清型病毒滴度随时间而增加;间接免疫荧光实验显示DENV四种血清型均在hAhR抑制剂 BMSC中稳定表达DENV-NS1蛋白;炎症ocular pathology因子检测结果显示,炎症因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-Iβ、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、MCP-1均在DENV感染后表达升高,其中DENV-2、4感染后引起的变化最显著。通过本实验证实了DENV四种血清型均对h BMSC易感,尤其是DENV-2和DENV-4,建立了DENV四种血清型病毒感染h BMSC的体外感染模型。最后对h BMSC感染DENV-2后的差异表达蛋白分析显示,一共鉴定出272个差异表达蛋白,其中158种蛋白表达上调,114种蛋白表达下调;GO功能分析显示差异表达蛋白主要作用于细胞解剖实体和蛋白质复合物,通过细胞过程、代谢过程、生物调节及刺激应答和信号传导等过程,对结合以及催化活性等功能造成影响;KEGG分析显示共富集到195个信号通路,主要通路为溶酶体、EBV感染、HPV感染、还涉及到RIG-I样受体信号通路、TNF信号通路,表明差异表达蛋白主要集中于响应病毒侵袭以及免疫应答通路中;蛋白互作网络分析表明DENV-2感染后蛋白ISG15和CXCL10极显著上调,使h BMSC启动病毒防御机制,抗病毒能力明显增强;SOD2的上调和CTSB的下调,促使细胞凋亡,反应了DENV-2的致病性;同时发现了另外三种关键蛋白,即TNFAIP6、THBS1和CCN2,经研究它们分别在免疫调节和血液稳态以及骨细胞及血管内皮细胞增殖发挥重要作用,且在相关文献中未见报道。综上所述,本研究通过对DENV四种血清型病毒的分离培养及在h BMSC上建立细胞感染模型,并研究DENV-2感染h BMSC之后的蛋白组差异,揭示了四种血清型的基因型、对h BMSC的感染特性以及引起的蛋白质之间的差异表达,更全面地了解DENV感染过程中与宿主的相互作用,对阐明DENV引起的出血热及强免疫反应的机制及表征疾病特征、鉴定DHF和DSS的分子标志物以及找到抗DENV的新策略提供了重要参考。