人诱导性多能干细胞(iPSC)因其具有无限扩增及多向分化潜能,已经在基础研究和再生医学领域发挥着重要作用。为充分挖掘iPSC的巨大潜力,常需要对其进行CRISPR-Cas9基因编辑。然而,由于许多致病基因位于iPSC闭合染色质区域内,限制了 CRISPR-Cas9技术在这些位点的编辑效果。通过使用HDAC抑制剂对电转后iPSC短暂处理,我们发现非开放位点的非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)效率分别提高了 1.5倍和3倍左右。此外,HDAC抑制剂还可以提升iPSC中Cas9核酸酶及sgRNA编辑元件的表达水平,从而进一步促进基因组的整体切割。其次,CRISPR-Cas9基因编辑技术存在的脱靶切割问题也是该技术临床应用中需要关注的重点。我们对目前常用的GUIDE-seq脱靶分析方法进行了一系列优化,并将该新方法命名为OliTag-seq。在OliTag-seq中,Caatypical mycobacterial infections9产生的双链断裂位点(DSB)中dsODN的全长插入效率提高了 1.7倍,一轮PCR采用三引物混合方式也大大简化了建库流程。同时,我们进一步验证了染色质可及性会影响Cas9的特异性切割,iPSC因其染色质疏松而表现出更Tezacaftor抑制剂好的脱靶识别能力。此外,组成型Casselleck CX-54619表达与HDAC抑制剂瞬时开放染色质也进一步改善了脱靶识别。利用OliTag-seq,我们对几个CAR-T相关位点的sgRNA识别出了多个新的脱靶位点。另外,鉴于目前CRISPR-Cas9技术发展尚未成熟,相关基因治疗临床试验还比较少,我们又聚焦于传统的慢病毒载体疗法。我们系统优化了蓝鸟公司针对β-地中海贫血的BB305慢病毒载体,对HBB编码区潜在的转录终止信号进行了沉默突变,并将LCR增强子元件由2.6kb精简到1.9kb,同时设计了HBG2突变型启动子,开发得到新型HBB慢病毒载体。与BB305载体相比,该新型载体滴度提高了 6倍左右,β-珠蛋白表达水平提高了 40%以上,并在小鼠体内表现出更好的治疗效果,有望显著降低β-地中海贫血的基因治疗成本。最后,我们对上述新型HBB慢病毒载体在基因组中的整合安全性进行了分析,并初步探索了慢病毒整合位点的数据分析方法。我们借鉴INSPIIRED中提到的方法,在PCR过程中引入一个阻断型寡核苷酸,并测试了多个PCR条件,以最大程度地富集得到3′-LTR及整合位点邻近基因组序列。通过对OliTag-seq流程进行修饰来分析HBB慢病毒载体整合位点的数据,我们发现其在HBG2、TBC1D5、MROH1等基因处的整合位点丰度较高,且大多集中在内含子区域,这与已知的慢病毒载体倾向整合性一致。综上所述,我们围绕干细胞基因编辑与基因治疗研究方向进行了多个技术开发,一定程度上解决了 iPSC非开放位点基因编辑的技术难题,我们也对上市药物BB305慢病毒载体进行了系统优化,在提高载体滴度的同时也提高了 β-珠蛋白的表达水平。此外,我们还针对CRISPR-Cas9基因编辑及慢病毒载体基因治疗的安全性问题开发了分析流程。我们期望本研究论文能对β-地中海贫血基因治疗或癌症免疫治疗发挥指导作用,也期待我们的技术成果早日实现临床或产业转化。