研究背景:目前,肺癌一直是全世界最普遍的恶性肿瘤,它是造成肿瘤死亡率的重要因素。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要类型,分为肺鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)、肺部腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)以及大细胞癌。对于早期NSCLC患者,临床多采用手术的方法进行治疗;对于中后期的NSCLC患者来说,联合治疗是首选,传统放化疗仍然是治疗NSCLC的主要手段。尽管近年来肿瘤分子生物学、基因组学、靶向治疗等领域得到了发展,但大多数晚期NSCLC患者的平均5年生存率仅为19%。值得注意的是,肿瘤的发生可能与必要基因的变化显著相关。靶向用药的出现减少了NSCLC病人的总体存活量,而对于某些敏感基因靶向治疗不敏感的病人,开发针对罕见和难治靶点的有效、低毒的靶向用药,仍然是治疗临床需要突破的问题。所以,深入探讨NSCLC的发生机理,并寻求最新的诊断靶点,从而早期治疗,改善病人的正常生活量势在必行。Ⅵ型胶原alpha 6链(COL6A6)属于Ⅵ型胶原(COL6)家族,由一个6789-bp的编码区编码。作为一种细胞外基质蛋白,COL6A6在多种人体组织中显著表达,包括肺、肾、肝、脾、胸腺、心脏、骨骼肌,并在维持细胞结构完整性和调节细胞功能方面发挥重要作用。已有研究指出,COL6A6参与多种肿瘤的发生发展:COL6A6可抑制垂体腺瘤的生长和转移,同时也有研究证实了COL6A6的高表达与乳腺癌的早期病理阶段有显著的相关性。COL6基因家族的许多成员都被认为对于肿瘤的形成和演变具有至关重要的影响。然而,目前在很大程度上尚不清楚COL6A6是否与NSCLC相关。在结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌和其他肿瘤的发展过程中,通过JAK-STAT途径传递信号是必不可少的。先前的研究表明,JAK-STAT在非小细胞肺癌中过度表达,并促进细胞增殖。研究发现,JAK-STAT加速了非小细胞肺癌的侵袭和转移,这与患者预后不良有关。然而,COL6A6和JAK-STAT信号通路之间的关系尚未被探索。研究目的:本研究首次尝试将COL6A6基因应用于美国国家公共资料库中的癌症基因组图谱计划(TCGA),以探究其在不同类型癌症中的表达及其表现特征,并发现其在NSCLC中的m RNA及相关蛋白表达状况,以及其与临床资料的相关性,从而为癌症筛查提供重要的参考依据。同时,COL6A6与肺癌患者的生存和预后之间存在着密切的联系,进一步,我们建立了COL6A6基因敲除组,以研究COL6A6基因对NSCLC细胞生长、转移和侵袭性的作用。另外,对COL6A6基因及其相关编码基因进行GO、KEGG富集,同时对COL6A6基因进行集合富集分析(GSEA),进一步探讨COL6A6基因在NSCLC中的作用机制。研究方法:第一章:基于公共数据库对COL6A6基因生物信息学研究及临床验证1.利用公共数据库(TCGA、GTEx、GEPIA、TIMER)检测COL6A6基因在人类多种肿瘤组织和癌旁组织中的m RNA水平。2.通过从TCGA数据库系统中加载的肺腺癌和肺鳞癌数据集,我们使用R软件对NSCLC患者的COL6A6基因表达进行了比较,以探究它们之间的差异。3.收集17例NSCLC样本及对应的癌旁组织标本;GSK126浓度4.蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测COL6A6基因的蛋白表达;5.人类蛋白图谱数据库(The Human Protein Atlas,HPA)中下载COL6A6基因的免疫组织化学图像;6.基于TCGA-LUAD数据集和TCGA-LUSC数据集分析目的基因COL6A6在临床变量分组之间的差别,分析COL6A6与患者的病理分期、TNM分期、性别、年龄等临床资料之间的关系,阐明COL6A6基因在NSCLC中预后及诊断意义。第二章:COL6A6调控NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭能力的研究1.体外培养成人的肺癌细胞株(A549、H1299、H520、H1975)和正常肺上皮细胞系统(Beas-2B)。2.通过Western blot检测各组细胞系中COL6A6的表达情况。3.选取H1299细胞构建敲除COL6A6细胞系(COL6A6-si),同时构建阴性对照组(NC-si)。4.通过细胞增殖实验(CCK8)检测敲除COL6A6对NSCLC细胞增殖能力的影响。5.通过划痕实验检测敲除COL6A6对NSCLC细胞迁移能力的影响。6.通过Transwell细胞侵袭实验检测敲除COL6A6对NSCLC细胞侵袭能力的影响。第三章:COL6A6调控NSCLC细胞生长的分子机制研究1.基于TCGA-LUAD、TCGA-LUSC数据集把COL6A6和所有基因的数据进行批量相关性分析,分别找到COL6A6的相关性基因,组成基因集。2.对基因集进行GO/KEGG富集分析。3.对COL6A6基因所进行的GSEA基因富集研究(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)。4.WB检测了COL6A6所敲除的JAK信号通路中蛋白JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达能力。研究结果:第一章:基于公共数据库对COL6A6基因生物信息学研究及临床验证1.COL6A6基因在人体各种癌症细胞和癌旁细胞中的m RNA表达水平存在显著差异,其中LUAD和LUSC组织中的表现量明显低于正常肺组织,这一结果表明col6a6基因在癌症过程中可能具有重要的生物学作用。2.COL6A6基因在NSCLC配对样本和非配对样本中的肿瘤组表达显著低于癌旁组。3.COL6A6基因在癌旁组织中的蛋白表达明显低selleckchem于NSCLC配对组织;4.免疫组织化学图像显示COL6A6基因主要定位于NSCLC的胞质和膜质;5.COL6A6基因与NSCLC患者的病理分期、TNM分期、性别、年龄等临床资料密切相关,COL6A6基因高表达对NSCLC具有良好的预后及诊断意义。6.单因素COX回归分析显示:COL6A6基因表达水平和临床病理分期与NSCLC患者的总生存时间密切相关,COL6A6基因高表达是NSCLC患者的良好预后因素。多因素COX回归研究结果表明:COL6A6基因的表达,是NSCLC良好独立预后因子。第二章:COL6A6调控NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭能力的研究1.在NSCLC细胞系(A549、H1299、H520、H1975)中的COL6A6基因含量明显低于正常上皮细胞(BEAS-2B),并且在4个NSCLC细胞系中,H1299细胞系的表达显著高于其他细胞系。2.选取H1299细胞构建敲除COL6A6细胞系(COL6A6-si),同时构建阴性对照组(NC-si)。敲除COL6A6基因后,与对照组比较,在q RT-PCR和Western blot中的H1299细胞系内COL6A6的基因表达程度均明显下降。3.细胞增殖实验(CCK8)结果显示,敲除COL6A6后,NSCLC细胞增殖能力比对照组明显增加。4.划痕实验显示,敲除COL6A6后,NSCLC细胞迁移能力明显加快。5.Transwell细胞侵袭实验显示,敲除COL6A6后NSCLC细胞侵袭能力显著增加。第三章:COL6A6调控NSCLC细胞生长的分子机制研究1.COL6A6及相关基因的GO/KEGG富集研究结果表明,COL6A6及相关基因与JAK-STAT信号途径有效富集。2.COL6A6基因的GSEA基因富集分析结果显示,COL6A6基因与JAK-STAT信号通路高度相关。3.WB测定结果表明,与对照组比较,通过COL6A6敲除的JAK信号通路中相关蛋plant bacterial microbiome白的表达程度明显增加。研究结论:1.COL6A6在NSCLC组织中表达低于癌旁或正常的肺组织。2.COL6A6蛋白的表达程度与NSCLC患者的临床病理分期、TNM分期、性别和年龄显著相关。3.COL6A6表达与NSCLC患者的总生存期相关,具有良好的诊断价值,可作为NSCLC患者预后的独立预测因素。4.COL6A6基因在肺癌细胞内的表达低于正常的人类肺上皮细胞。5.COL6A6的表达水平较低,可以显著提升NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。6.COL6A6可通过影响JAK信号通路来参与NSCLC的调控。