目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)严重影响人类健康,目前研究认为circRNA可参与多种疾病的细胞增殖、分化和代谢过程,包括DKD。本研究目的是探究circUBXN7在DKD患者血浆、模型小鼠肾组织和高糖下人肾小管上皮细胞中的表达及功能调控作用,并阐明circUBXN7是通过何种机制参与DKD的发展,为DKD的临床诊断提供新的依据。方法:采用circRNA芯片技术,检测6例正常人和6例糖尿病肾病患者血浆中差异表达的circRNAs,分析筛选出9个DKD密切相关的circRNAs。通过q RT-PCR验证这9个circRNAs在高低糖培养的HK2细胞中的表达,聚焦到表达差异最显著且表达丰度最高的circUBXN7。进一步通过q RT-PCR验证circUBXN7在DKD患者及正常对照人群血浆中的表达水平。利用生物信息学分析cirFG-4592研究购买cUBXN7的来源及环化位点,并通过Sanger测序验证其环化位点,g DNA实验验证circUBXN7是否是转录后水平环形转录本。采用RNA酶消化和放线菌素D处理后验证circUBXN7的稳定性,并通过核质分离实验和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)确定circUBXN7的定位。随后,我们构建了circUBXN7的过表达慢病毒和敲低si RNAs,通过q RT-PCR、western blot和免疫荧光(immunofluorescence,IF)探究过表达和敲低circUBXN7后对HK2细胞的上皮间质转化(epithelial mesenFetal Immune Cellschymal transition,EMT)及纤维化的影响。为探索circUBXN7的产生机制,通过q RT-PCR,染色质免疫沉淀实验(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)和双荧光素酶实验验证SP1与UBXN7启动子区域的结合,过表达和沉默SP1后检测circUBXN7和UBXN7的表达水平。为探究circUBXN7调控HK2细胞EMT和纤维化的机制,我们通过RNA pulldown、RIP、荧光原位杂交、免疫荧光验证circUBXN7与IGF2BP2结合和共定位。通过m6A2Target数据库检测SP1是IGF2BP2通过阅读m6A修饰位点结合的潜在靶基因,然后通过RIP和western blot实验验证IGF2BP2通过m6A基序识别并结合SP1的m RNA并调控其表达。然后,确定circUBXN7通过特异性结合m6A阅读蛋白IGF2BPCeralasertib采购2,识别SP1并调控其表达,从而影响糖尿病肾病的EMT和纤维化。最后,我们通过尾静脉向db/db小鼠注射circUBXN7过表达和敲低的慢病毒,构建circUBXN7上下调的模型小鼠,通过活体体内成像,q RT-PCR,FISH确认circUBXN7过表达和敲低慢病毒成功感染到小鼠肾脏。然后通过q RT-PCR,western blot和免疫荧光等探究circUBXN7在DKD小鼠在体内对肾脏组织的EMT和纤维化,DKD小鼠病情进展等的影响。结果:circRNA芯片检测发现在DKD患者血浆中有339个差异表达的circRNAs,其中有116个上调,223个下调。进一步分析发现,9个circRNAs与DKD密切相关(|Log_2(fold change)|>0.585,FDR<0.05),其中有4个上调,5个下调。q RT-PCR结果显示,circUBXN7在DKD患者血浆和高糖培养的HK2细胞中均高表达。Sanger测序结果找到circUBXN7的环化位点AGCA,通过g DNA实验我们发现circUBXN7是环形转录本且不存在于g DNA中。RNA酶消化和放线菌素D处理后,circUBXN7比内参和linear UBXN7更稳定。核质分离实验和FISH表明,circUBXN7主要定位于细胞质中。q RT-PCR、western blot和免疫荧光结果均表明,circUBXN7上调后可抑制E-ca的表达,促进Vim和α-SMA的表达,并且使Col-Ⅰ和TGFβ1表达水平升高,反之亦然。q RT-PCR和western blot结果表明,SP1在DKD病人和高糖下HK2细胞中高表达。Ch IP,双荧光素酶和q RT-PCR结果说明,转录因子SP1可以结合UBXN7的启动子区域,进而调控circUBXN7和UBXN7的表达。RNA pulldown和RIP结果显示,circUBXN7能与IGF2BP2特异性结合。RIP和western blot结果显示,IGF2BP2通过识别SP1的m RNA上的m6A基序与之结合,并且调控SP1的表达水平。放线菌素D实验,q RT-PCR和western blot说明,circUBXN7通过稳定SP1的m RNA来调控SP1的表达。RIP结果表明,circUBXN7过表达后,SP1可以更多地富集到IGF2BP2。Western blot结果显示,敲低IGF2BP2后,circUBXN7对SP1的促进作用减弱,说明circUBXN7通过募集IGF2BP2来稳定SP1并促进其表达。Western blot结果显示,下调SP1可以削弱过表达circUBXN7对HK2细胞EMT和纤维化的促进作用,相反,上调SP1可以抵消沉默circUBXN7后对HK2细胞EMT和纤维化的抑制作用。circUBXN7上下调慢病毒感染db/db小鼠后,活体成像,q RT-PCR和FISH显示,circUBXN7上下调慢病毒成功感染到肾脏组织。肾功能指标(24h尿蛋白量和尿微量白蛋白/尿肌酐)提示circUBXN7加重DKD小鼠病情。组织q RT-PCR,western blot和IF等表明circUBXN7促进DKD小鼠肾脏的EMT和纤维化,促进DKD病情发展。结论:高糖下肾小管上皮细胞转录因子SP1活化,通过入核结合circUBXN7基因启动子并促进其转录,异常高表达的circUBXN7特异性结合m6A阅读蛋白IGF2BP2,识别并促进胞质SP1的表达,形成SP1-circUBXN7/IGF2BP2-SP1正反馈环路,最终促进肾小管上皮细胞EMT、纤维化和DKD的发生发展。