冠心病,是一种缺血性疾病,在我国的发病率长年居于较高水平。中国心血管健康疾病报告显示,目前全国心血管疾病的患病人数高达3.3亿,其中冠心病1139万,占全国前列。心肌梗死是最严重的冠心病类型,由于供应血液的冠状动脉完全堵塞,而易发生心肌坏死。尽管通过血管重铸、溶栓、经皮动脉介入等方法,可以恢复心肌的血液供应,减少心肌梗死的发生,但这些办法无法从根本上修复已经发生梗死的心肌细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),是一种存在于骨髓中,能够进行自我复制和更新的非造血干细胞,其具有多向分化的能力。大量实验表明,在一定条件作用下骨髓间充质干细胞可以向心肌样细胞分化,用于移植到心肌梗死的区域。而诱导剂的使用使骨髓间充质干细胞的分化效率得到进一步提高,成为干细胞诱导分化选择的重点。近年来中药因其较小的药物毒性,较高的诱导分化效率,成为研究BMSCs诱导分化新的关注点。川芎嗪是从中药川芎中分离提取的一种生物碱单体,Baricitinib纯度具有诱导BMSCs定向分化的能力,同时川芎嗪也是一种钙离子拮抗剂,具有钙离子拮抗的作用。钙离子作为细胞内第二信使,在细胞代谢、细胞增殖等细胞功能的调节中发挥着不可或缺的作用。它能够参与多种细胞不同生长时期的调节,如细胞分裂、生长、分化和凋亡等。细胞内Ca~(2+)浓度的改变是介导Ca~(2+)传递的重要因素,当细胞受到物理化学等因素刺激时,细胞内Ca~(2+)浓度发生改变,从而影响细胞的生物学功能和生长分化。鉴于川芎嗪诱导分化和钙离子拮抗的作用,本实验主要目的在于研究Ca~(2+)信号在川芎嗪诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用。本实验采用全骨髓贴壁法分离提取BMSCs,并应用流式细胞术对培养至第3代的BMSCs进行表面抗原鉴定。运用MTT增殖实验检测不同浓度的川芎嗪对BMSCs增殖的影响,筛选川芎嗪作用于BMSCs的最适浓度,并对培养至第3代的BMSCs进行分组诱导。实验设置空白对照组,230μmol·L~(-1)川芎嗪组,230μmol·L~(-1)川芎嗪+10μmol·L~(-1)硝苯地平组,230μmol·L~(-1)川芎嗪+0.5 mmol·L~(-1) EGTA组。加药诱导4周后,分别进行形态学PUN30119研究购买和分子生物学方面的观察检测:应用Western blot检测心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,c Tn T),心肌肌钙蛋白I(Cardiac troponin I,c Tn I),结蛋白Desmin的表达;运用免疫荧光细胞染色检测心肌特异性蛋白c Tn T,c Tn I的表达;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测不同加药诱导组1周、2周和4周心肌特异性基因GATA-4的表达情况。在倒置显微镜下观察细胞的生长状况,细胞培养72h,短梭形细胞增多,细胞向外伸展;培养至7天,细胞贴壁生长,体积变大,呈梭形;加药诱导28d,细胞紧密排列,形状趋向一致,呈现方向性平行排列。流式细胞术结果表明,CD29的阳性表达率91.0%,CD45的阳性表达率2.4%,CD90的阳性表达率高达95.1%,为纯化的BMSCs,可以用于后续实验。MTT增殖实验结果显示,230μmol·L~(-1)为川芎嗪作用于BMSCs的最适浓度,差异具有统计学意义(P<0.05)。故选取230μmol·L~(-1)的川芎嗪用于后续实验。免疫荧光细胞染色结果显示,空白对照组呈阴性或弱阳性表达,其它加药诱intermedia performance导组均呈阳性表达。川芎嗪组、川芎嗪+硝苯地平组、川芎嗪+EGTA组的c Tn T,c Tn I阳性表达水平显著高于空白对照组;川芎嗪+硝苯地平组、川芎嗪+EGTA组的c Tn T,c Tn I阳性表达水平高于川芎嗪组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,川芎嗪组、川芎嗪+硝苯地平组、川芎嗪+EGTA组的c Tn T,c Tn I,Desmin表达水平明显高于空白对照组;川芎嗪+硝苯地平组、川芎嗪+EGTA组的c Tn T,c Tn I,Desmin表达水平高于川芎嗪组,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-q PCR结果显示,G A T A-4基因在各诱导组1 w开始表达,4 W的川芎嗪+硝苯地平组的GATA-4基因表达水平明显高于1W。与空白对照组相比,川芎嗪组、川芎嗪+硝苯地平组、川芎嗪+EGTA组GATA-4基因的表达显著上调;川芎嗪+硝苯地平组,川芎嗪+EGTA组的G A T A-4基因表达水平明显高于川芎嗪组,差异具有统计学意义(P<0.05)。综上实验结果表明,川芎嗪能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,Ca~(2+)信号在川芎嗪诱导BMSCs向心肌样细胞分化的过程中起负调控作用。