白血病是一种以某种未完全分化的幼稚造血细胞大量增生为特征的血液系统恶性疾病,占肿瘤总发病率的3%左右,是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。目前最常见的白血病类型包括急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)、急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)、慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)和慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)。不同类型的白血病中基因的突变类型、蛋白表达及分子机制是不同的,所以在治疗时要根据具体的疾病类型进行不同的治疗。目前,白血病经过常规治疗后的完全缓解率很高,总体缓解率介于30%-70%之间,儿童急性淋巴细胞白血病的完全缓解率高达95%左右,成人急性淋巴细胞白血病的完全缓解率在75%左右,除急性早幼粒细胞白血病外,急性白血病的完全缓解率在70%以上,但是由于耐药性等原因,白血病预后较差且存在较高的复发率。因此,寻找新的白血病治疗靶点,研究新的、更加有效的治疗方式对于白血病的治疗非常重要。c-Myc作为一种转录因子,在细胞的生长发育、生理代谢和衰老等许多生物活动中起着至关重要的作用。在大多数的人类肿瘤类型中,c-Myc蛋白selleck与不良预后相关。血液疾病中,c-Myc也是参与细胞转化和癌症发展的关键基因。有研究表明,c-Myc是胚胎造血发育及成人造血所必需的,并且c-Myc在调节造血干细胞的自我更新和诱导分化过程中发挥重要作用。弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphomas,DLBCL)是一组在病理组织学形态、基因表型和临床表现上为异质性的大B细胞增生性病变。Meta分析又称荟萃分析,是将多个研究目的相同的结果进行合并分析的统计学方法,在更大的样本量下以更高的检验效能回答相关的医学问题。Meta分析一般遵循以下几个步骤:选题、文献检索、提取数据、文献质量评估、数据分析、报告结果等基本过程。本研究中,我们对c-Myc蛋白过表达在DLBCL中的不良预后进行了Meta分析。我们整理了最新发表的关于DLBCL的临床文献,最终筛选出36篇文献纳入本次研究。分析结果表明,c-Myc蛋白过表达使DLBCL患者的总生存期(Overall survival,OS)和无进展生存期(Progression-free survival,PFS)显著降低。另外检测了BCL2蛋白和BCL6蛋白过表达及BCL2/BCL6蛋白与c-Myc蛋白同时表达对DLBCL患者预后的影响,统计分析显示,BCL2蛋白是导致DLBCL患者的出现不良预后的危险因素,存在BCL2蛋白过表达或BCL2与c-Myc双表达都会使DLBCL患者的OS和PFS降低。研究发现BCL6蛋白是DLBCL的良性预后因素,但是关于BCL6与c-Myc双表达的文献数量较少,无法做统计分析。因为c-Myc在血液肿瘤中的作用,研究直接靶向c-Myc的小分子化合物是治疗血液疾病的潜在方法。10074-G5抑制c-Myc与Max的结合,从而抑制基因的转录。在其他癌症类型中如乳腺癌、神经母细胞瘤等,发现10074-G5可以抑制癌细胞的增殖,但是在白血病之间的研究和应用较少。EN4在2020年合成使用,目前只在乳腺癌细胞中进行了研究。我们选择了以上两种c-Myc抑制剂探究其对白血病细胞的作用,本次选取了两种鼠源的急性髓系白血病细胞MLL-AF9和MLL-ENL,四种不同类型的人源白血病细胞包括人急性髓系白血病细胞Molm13、人急性T淋巴白血病细胞Jurkat、人单核细胞白血病细胞TMedicago lupulinaHP-1和人组织细胞淋巴瘤细胞U937。首先,我们采用MTT比色法检测了两种抑制剂在不同白血病细胞中的半数抑制浓度,即IC_(50)值。通过MTT细胞增殖实验发现,使用10074-G5和EN4处理的白血病细胞与未用抑制剂处理的相比,白血病细胞的增殖速率受到了显著的抑制。这一结果在细胞体外克隆实验中也得到了证实。使用这两种抑制剂处理的白血病细胞与未处理的细胞相比,克隆的数量显著减少,克隆形态明显较小。接下来我们探究了10074-G5和EN4对白血病细胞的细胞凋亡、细胞周期和细胞分化的影响。结果显示,10074-G5和EN4显著促进了各类白血病细胞的凋亡,并且呈现剂量依赖型的方式,而这两种抑制剂对于细胞周期的影响并没有一致的趋势。在两种鼠源的急性髓系白血病细胞中,10074-G5使MLL-AF9的G1期细胞减少,促进细胞进入S期,而对MLL-ENL的细胞周期无显著影响。EN4对MLL-AF9细胞的周期无影响,但是促进了MLL-ENL的G1期阻滞。对于其他四种人源白血病细胞,除THP-1外,10074-G5使G1期细胞增多,进入S期的细胞减少,而使THP-1的G1期细胞减少,S期细胞增多。EN4使Molm13和Jurkat细胞G1期减少,G2/S期的细胞增加。使用两种单核细胞的标记物CD11b和CD14检测这两种抑制剂对四种人源白血病细胞分化的影响。结果显示,10074-G5和EN4显著增加了四种细胞CD11b和CD14的阳性率,即促进了人白血病细胞向单核和粒细胞方向分化。我们还将c-Myc抑制剂与传统的化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)联合使用,探究c-Myc抑制剂是否能够增强Ara-C的效果。实验结果发现,c-Myc抑制剂与Ara-C联合使用与单独使用Ara-C相比,白血病细胞的增殖都受到了抑制。在联合用药后,白血病的凋亡出现了不同的结果。在MLL-ENL、U937、Jurkat细胞中,联合使用Ara-C和10074-G5与单独使用Ara-C相比,会促进细胞的凋亡。而在MLL-ENL、THP-1细胞中,联合用药后细胞的凋亡数量小于单独使用Ara-C的细胞凋亡数量,Molm13的凋亡数量无显著差异。联合使用Ara-C和EN4与单独使用Ara-C相比,在两种鼠源的白血病细胞MLL-AF9和MLL-ENL,两种人源白血病细胞U937和THP-1中,细胞的凋亡数量无显著性差异,在Molm13和Jurkat细胞中凋亡数量是增加的。通过检测细胞周期发现,Ara-C联合使用10074-G5和EN4与只使用Ara-C相比,两种小鼠白血病细胞G1期细胞减少,进入S期的细胞增多,对Molm13的细胞周期无显著影响。总之,Ara-C与两种c-Myc抑制剂联用后对细胞增殖的抑制作用增强。最后,我们设计并成功构建了四种c-Myc突变体c-Myc~(ΔN2)、c-Myc~(Δ36-70)、c-Myc~(V264G)和c-Myc~(L420P),分别影响c-Myc-CDK8信号通路、c-Myc-p TEFB信号通路、c-Myc-WDR5信号通路和c-Myc-Max信号通路,来探Pevonedistat配制讨c-Myc的各种功能单位和亚型在AML发生发展中的作用。总体而言,本论文首先进行了c-Myc蛋白过表达对DLBCL患者预后影响的Meta分析。整理并分析了c-Myc蛋白、BCL2与BCL6蛋白过表达对DLBCL患者OS和PFS的影响。结果显示,c-Myc和BCL2蛋白过表达是DLBCL的不良预后因素,BCL6蛋白过表达是良性预后因素。Meta分析是一项需要不断纳入最近临床数据,更新分析结果的研究。本Meta分析通过纳入最新的相关临床数据,为DLBCL的临床治疗提供一定的理论数据。接下来选择了两种c-Myc抑制剂10074-G5和EN4,探究c-Myc抑制剂对白血病细胞的作用。结果发现两种抑制剂均可以显著抑制白血病细胞的增殖。后续实验证明,10074-G5和EN4抑制白血病细胞增殖的原因是促进了细胞凋亡的发生,并促进白血病细胞向单核细胞方向分化。同时发现,与单独使用Ara-C相比,将两种c-Myc抑制剂与Ara-C联用对白血病细胞的抑制效果更好。本研究的创新性在于选择的两种抑制剂中10074-G5在血液肿瘤中应用较少,EN4为最新合成的小分子抑制剂,未在血液肿瘤中有过研究,探究它们在白血病细胞中的作用机制,可以为开发治疗白血病的小分子药物提供一定的实验数据。