Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡的关键调控因子,可根据功能分为抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白及BH3-only蛋白。Bcl-2和Bcl-XL是其中两种重要的抗凋亡蛋白,已有研究表明其影响多种癌症的发生发展及耐药性产生。目前基于Bcl-2和Bcl-XL的结构信息已研发出线性肽和小分子化合物两类抑制剂。其中,线性肽由于自身不稳定性及穿膜效率低始终难以进入临床试验。而小分子抑制剂易引发Bcl-XL依赖的血小板减少症,被FDA批准上市的只有Venetoclax(ABT-199),但也面临患者用药后产生Bcl-2中G101V耐药突变的挑战。因此亟需发现以Bcl-2为靶点的新型特异性抑制剂并克服上述继发性耐药。本论文与厦门大学吴川六教授团队合作,利用噬菌体展示技术筛选到能分别与Bcl-2和Bcl-XL结合,但优先结合Bcl-2的环肽Cp1。之后,本论文基于两种蛋白分别与Cp1的复合物晶体结构信息,阐释了 Cp1针对两种蛋白的选择性机制和抗耐药机制,进而优化并筛选到优先靶向Bcl-XL的环肽Cp3。首先,本论文进行了环肽对两种蛋白选择性机制的研究。Pexidartinib核磁我们分别以1.95 (?)和2.0(?)分辨率解析出Bcl-2与Cp1、Bcl-XL与Cp1的复合物结构。与已报道的配体结合模式不同,Cp1以基本不引起α3和α4螺旋构象变化的新模式结合于两个蛋白的配体口袋。此外,Bcl-2和Bcl-XL与Cp1互作的氨基酸残基高度保守,差异在于Bcl-2的D111残基与Cp1的G6残基形成氢键,而Bcl-XL对应残基是A104,无法与Cp1形成氢键。同时表面等离子共振实验表明,Bcl-2的D111A位点突变,可使Bcl-2与Cp1的亲和力由0.79μM降为5.9 μM。上述结果说明Bcl-2和Bcl-XL的D111/A104残基差异是Cp1实现Bcl-2选择性的关键因素之一。另外,本论文进行了环肽能否克服Bcl-2临床耐药突变的研究。我们以1.85 (?)分辨率解析出含G101V耐药位点突变的Bcl-2-G101V突变体蛋白与Cp1的复合物结构。已有相关研究指出,Bcl-2发生G101V位点突变,会使空间邻位E152残基构象变化,进而对Venetoclax的结合产生位阻效应,导致二者亲和力下降180倍,引发耐药。而我们的共晶结构显Immune signature示,Cp1与Bcl-2-G101V的V101及E152残基的距离分别为7.7 A和9.9 A,距离较远,因此该突变不会导致对环肽的位阻效应。与之一致的是,表面等离子共振实验表明Cp1与突变前后的Bcl-2的亲和力无较大差异,KD值分别为0.79 μM和1.14μM。基于上述结构信息,我们优化并筛选到对Bcl-XL具有选择性的环肽Cp3,并以1.4 A分辨率解析出Bcl-XL与Cp3的复合物结构。与第一部分相呼应,Cp3的P6残基与Bcl-XL的A104残基形成面面互作,而与Bcl-2的D111残基产生位阻效应。由此我们提出环肽的选择性“开关”假说,即环肽既可通过ZD1839临床试验G6残基与Bcl-2的D111残基形成氢键,表现出Bcl-2优先选择性,又可通过P6残基与Bcl-XL的A104残基形成面面相互作用,表现出Bcl-XL优先选择性。最后,我们验证了穿膜肽(TAT)修饰后的环肽对肿瘤细胞的促凋亡效果。利用流式细胞术测得Cpl-TAT与Cp3-TAT均可抑制Jurcat、El4和Daudi三种肿瘤细胞生长,且同等浓度下Cp3-TAT对Daudi细胞的抑制效果优于上市药物Venetoclax。此外,Annexin V-FITC/PI双染实验显示Cp1-TAT和Cp3-TAT显著提高了细胞凋亡比例,说明Cp1-TAT和Cp3-TAT以促进细胞凋亡的方式抑制细胞增殖。综上,本论文分别解析了 Bcl-2-Cp1、Bcl-XL-Cp1和Bcl-XL-Cp3复合物结构,揭示环肽与两个蛋白的结合模式和选择性机制,为环肽选择性和亲和力优化提供结构依据;解析了 Bcl-2-G101 V-Cp1复合物结构,表明环肽有望为克服临床耐药突变提供新思路;验证了环肽以促进细胞凋亡的方式抑制细胞增殖。本研究将为开发新一代靶向Bcl-2高选择性抑制剂提供新的参考。