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目的:基于网络药理学及动物实验探讨双石通淋胶囊治疗良性前列腺增生(BPH)的作用机制。方法:通过TCMSP、SymMap和ETCM数据库筛选双石通淋胶囊的化学成分及靶点；利用GeneCards、DisGeNET和DrugBank数据库检索BPH疾病靶点；用STRING数据库构建蛋白互作网络；对关键靶点进行GO和KEGG富集分析；利用Cytoscape 3.7.2软件构建“双石通淋胶囊-活性成分-靶点-通路”图。分子对接预测核心成分与靶点的结合能力。采用去势联合皮下注射丙酸睾酮建立大鼠前列腺增生模型，造模同时进行灌胃干预，连续28 d,末次给药24 h后，比较各组大鼠体质量、前列腺湿质量及指数；HE染色和Masson染色观察前列腺组织病理变化和胶原沉积情况；Western blot法检测大鼠前列腺组织中EGFR、VEGFA、p-P38、p-AKT蛋白的表达。结果:双石通淋胶囊筛Elexacaftor核磁选出193种活性成分，包括槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、黄芩素、薯蓣皂素、等核心成分，对应靶点422个，与994个疾病靶点取交集后得到100个共同靶点，核心靶点包括AKhepatic impairmentT1、STAT3、EGFR、CASP3、VEGFA、等；GO富集分析发现生物途径主要包括酶结合、转录因子结合、蛋白激酶结合、等；细胞组分主要包括大分子络合物、转录因子复合物、核染质、等；分子功能包括酶结合、序列特异性DNA结合、转录因子结合、等；KEGG富集分析发现MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路等可能在双石通淋胶囊治疗良性前列腺增生中起关键作用。分子对接结果显示，汉黄芩素与VEGFA结合能力最强。HE和Masson染SB431542临床试验色显示，与假手术对照组相比，模型对照组大鼠前列腺组织增生及胶原沉积明显；与模型对照组相比，双石通淋胶囊2.5 g/kg组大鼠前列腺湿质量和指数明显降低(P<0.05);给药各组大鼠前列腺中EGFR、VEGFA、p-AKT、p-P38蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),给药各组的前列腺增生程度及胶原沉积明显减轻。结论:双石通淋胶囊通过多靶点、多通路治疗BPH,其作用机制可能与调控EGFR、VEGFA、p-P38、p-AKT的表达有关。

目的 分析总结12例非妊娠期单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）败血症患者和12例妊娠期LM败血症患者的临床特征，为临床诊治提供依据。方法 回顾性分析2010年10月—20获悉更多21年6月在首都医科大学附属北京朝阳医院住院治疗并经血培养确诊的12例非妊娠期LM败血症患者（非妊娠组）和12例妊娠期LM败血症患者（妊娠组）的临床特征。结果 临床表现包括发热、胃肠道症状等，妊娠组4例可见胎心异常（33.3%），非妊娠组患者5例合并中枢神经系统感染（41.7%）。妊娠组WBC[(15.44±6.59）×10~9/L vs.(7.58±3.89）×10~9/L,P=0.002]、中性粒细胞计数[（11.94±6.17）×10~9/L vs.(6.45±3.65）×10~9/L,P=0.hospital-associated infection015]及淋巴细胞计数[（2.32±1.39）×10~9/L vs.(0.66±0.55）×10~9/L,P=0.001]均明显高于非妊娠组患者；C-反应蛋白则低于非妊娠组患者[13.35(35.28)mg/L vs.42.5(161.23)mg/L,P=0.011]。所有患者经验性初始治疗均以头孢菌素为主，其中妊娠组7例，非妊娠组8例。血培养阳性后调整治疗方案，最终非妊娠组5例患者死亡；妊娠组孕妇无死亡，但仅有2例孕妇顺利分娩活胎。其中1例新生儿诊断LM败血症（早发型），经青霉素钠联合美罗培南抗感染后基本病愈。结论 LM感染易误诊漏诊，妊娠期早期及时准确的治疗可避免妊娠不良结局。临床中若患者出现发热或可疑败血症时，无论免疫功能是否更多存在缺陷，尽早选用覆盖LM的抗菌药物及尽快明确病原学能够极大改善预后。

目的 确定剪切波弹性成像(SWE)在评估自身免疫性肝炎(AIH)患者的肝脏硬度值(LSM)和治疗反应中的有效性。方法 收集2017年6月至2022年10月期间入院诊治的AIH患者65例。根据METAVIR分类对AIH肝纤维化状态进行分期。对AIH患者进行标准化治疗，其中类固醇治疗为泼尼松联合或不联合硫唑嘌呤。比较治疗前后不同肝纤维化分期AIH临床资料，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析LSM对AIH肝纤维化分期的预测价值。结果 65例AIH患者中F1、F2、F3及F4期分别为16例、21例、15例及13例。F1期AIH患者PLT、Alb为238(193,420)×10~9/L、41.2(38.0,43.3)g/L,F2期为194(13selleck合成0,253)×10~9/L、37.4(36.2,40.4)g/L、F3期为167(92,233)×10~9/L、37.0(35.1,39.0)g/L、F4期为118(74,170)×10~9/L、34.4(32.2,37.1)g/L,差异有统计学意义(P<0.05)。F1期AIH患者APRI、FIB-4及LSM为Rescue medication2.6(1.7,4.1)、3.0(2.0,4.5)、7.2(5.0,9.7)kPa, F2期为4.4(2.8,6.8)、6.4(3.4,8.3)及12.7(7.7,15.3)kPa、F3期为5.7(3.0,7.2)、9.3(5.8,13.2)、13.0(9.2,18.7)kPa、F4期为2.3(1.4,3.8)、8.7(6.4,12.9)、15.4(13.3,21.5)kPa,差异有统计学意义(P<0.05)。LSM对≥F2期AIH肝纤维化诊断截断点、AUC分别为8.7 kPa、0.90(0.81～0.96);对F4期AIH肝纤维化诊断截断点、AUC分别为13.6 kPa、0.85(0.75～0.93),高于APRI、FIB-4(P<0.05)。65例AIH患者中接受、未接受类固醇治疗分别为43例、22例。与基线时比，接受、未接受类固醇治疗AIH患者随访时ALT、AST均显著降低(P<0.05);与基线时[4.7(3.4,7.2)、8.2(6.5,13.2)及13.3(9.7,21.5)kPa]比，接受类固醇治疗AIH患者随访时APRI、FIB-4及LSM均显著下降[0.6(0.4,0.8)、3.3(1.Vorinostat4,4.9)及7.5(3.2,9.4)kPa,P<0.05],而未接受类固醇治疗AIH患者基线、随访时APRI、FIB-4及LSM差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SWE是评估AIH患者肝纤维化的有效方法。在随访过程中LSM可作为评估AIH治疗反应的参数。

特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）是全球发病率最高的慢性炎症性皮肤病，临床主要表现为湿疹样皮肤病变、瘙痒和干皮症。近来有研究发现，AD患者的皮损中的感觉神经元可同时与角质形成细胞（keratinocyte,KC）、免疫细胞异常互作，导致神经免疫紊乱的发生。其中，参与神经免疫紊乱的感觉神经元有2类，包括组胺能感觉神经元和非组胺能感觉神经元。在神经免疫紊乱中，KC和免疫细胞可通过分泌白细胞介素-4 (interleukin-4,IL-4)、IL-13、IL-31、IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素等促炎细胞因子以及C-X-C模体趋化因子配体12 (C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)、CXCL10等趋化因子激活感觉神经元以诱发瘙痒，还可分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经鞘胚素等神经肽诱导感觉神经元过度生长，以促进genetic connectivity神经免疫互作。同时，感觉神经元过度释放的降MDV3100作用钙素基因相关肽和P物质等神经肽可作用于KC和免疫细胞，从而加剧皮肤炎症。近年来，诸多靶向神经免疫紊乱的药物处于临床前研究、临床试验等阶段，或已上市用于AD治疗，其中该课题组发现局麻药物利多卡因可靶向神经免疫紊乱并能够在临床上缓解AD患者的瘙痒及皮肤炎症。目前，神经免疫紊乱在AD中的作用鲜少被系统性讨论。基于此，该文围绕参与神经免疫紊乱的感觉神经元种类，KC、免疫细胞及感觉神经元在神经免疫紊乱中的作用，以及靶向selleck激酶抑制剂神经免疫紊乱的治疗策略进行综述。

目前,我国作为发展中国家所面临的人口老龄化问题极为严峻,心脏病、高血压、糖尿病等生活习惯病及精神类疾病已经成为威胁老年人健康的主要疾病。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质,当人体缺乏GABA时,会导致焦虑、抑郁、疲倦、紧张等负面情绪。因此,提高谷物类主食中的GABA含量对老年人和易焦虑人群的健康大有裨益。近年来,发芽糙米以其丰富的营养价值引起了人们的关注,GABA富集技术已经成为发芽糙米领域的研究热点。目前,有关盐胁迫富集GABA的研究主要集中在大豆、苦荞、玉米和粟谷种子中,盐胁迫对发芽糙米中GABA富集的影响还未深入研究,盐胁迫下发芽糙米GABA代谢相关基因的表达变化并未阐明。鉴于此,本研究选取盐胁迫浓度(0、50、100、150、200 mmol/L Na Cl)和发芽时间(12、24、36、48、60 h)作为考察因素,探讨了盐胁迫对发芽糙米中GABA等生物活性物质含量的影响,构建了发芽糙米的转录组测序文库,全面分析了盐胁迫后发芽糙米GABA代谢相关基因的表达变化。研究结果如下:(1)总体上看,盐胁迫后发芽糙米的还原型谷胱甘肽、总酚、类黄酮和氨基酸含量均显著提高,其最大富集量分别为232.5μg/g(FW)、1.72 mg/g(DW)、1.36 mg/g(DW)和92.06μmol/g(DW),与对照相比分别提高了约102%、43%、19%和78%。随着盐浓度的增加,还原型谷胱甘肽、总酚和类黄酮含量均呈现逐渐上升或先上升后下降的趋势。发芽糙米的粗灰分含量在0.75%-1.15%之间,盐胁迫3-Methyladenine核磁后发芽糙米的粗灰分含量显著降低,且随着盐浓度的增加,粗灰分含量呈现先降低后升高的趋势。发芽糙米的直链淀粉含量在8.31%-13.11%之间,随着发芽时间的延长,直链淀粉的含量逐渐降低,盐胁迫对发芽糙米中直链淀粉含量的影响并无规律可循。(2)发芽糙米的GABA含量在157.9-609.6 mg/kg(FW)之间,盐胁迫后发芽糙米的GABA含量整体上显著提高,在150 mmol/L Na Cl胁迫发芽48 h GABA含量达到最大,为609.6 mg/kg(FW),与对照相比增加了约2.86倍,随着盐浓度的增加,GABA含量呈现Pathologic response逐渐上升或先上升后点击此处下降的趋势。(3)本研究利用RNA-Seq技术对正常生长和盐胁迫条件下的发芽糙米进行了转录组分析,共筛选到8917个差异表达基因,其中上调表达基因4801个,下调表达基因4116个。通过GO富集分析和KEGG富集分析,鉴定到3条与GABA富集直接相关的代谢途径,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)、精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)和β-丙氨酸代谢(ko00410),筛选出10余个与GABA代谢直接或间接相关的差异表达基因,如Os GABA-T3、Os GABA-T1、Os CML41、Os CML48、Os PAO3、Os PAO6、Os SPMS1等。

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是重要的亚热带经济果树。龙眼体胚发生系统是木本植物体胚发生的优良模式系统。快速碱化因子(RALF)家族广泛分布于植物Taurine配制与真菌中,是对植物的细胞扩张、根系生长、有性生殖和应对胁迫等都具有影响的一类植物短肽激素。现有研究证明RALF肽在植物的生殖生长中具有重要调控作用。研究龙眼RALF基因家族在体胚发生早期的表达模式和功能可以为植物胚胎发育过程中的分子调控机制提供具有价值的参考依据。因此,本研究基于龙眼基因组数据库对RALF基因家族进行全基因组鉴定、生物信息学分析与表达模式分析;验证候选基因Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9的序Initial gut microbiota列,并构建p CAMBIA1301过表达载体,通过稳定遗传转化龙眼胚性愈伤组织对龙眼体胚发生早期Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9的生物学功能进行初步探究;验证了Dl RALF基因家族拮抗芸苔素内酯调控龙眼早期体胚发生。主要研究结果如下:1龙眼RALF家族全基因组鉴定及生物信息学分析Dl RALF基因家族具有10个成员,本物种内存在4对具有共线性关系的成员,与无患子科其他植物之间也存在较强的共线性关系;亚细胞定位预测均定位在胞外;Dl RALF家族基因成员启动子中含有大量的光响应元件、逆境胁迫响应元件、组织特异性生长元件和激素响应元件。本研究结果表明,Dl RALF基因家族成员高度保守,进化方式与其他无患子科植物类似,且具有功能多样性。2龙眼RALF基因家族的表达模式分析通过对Dl RALF基因家族的表达模式进行分析发现,Dl RALF基因家族成员在体胚发生不同阶段表达模式差异较大,且响应5-氮胞苷、温度、干旱、光质和Dl MIR408-OE等多种处理。基于对Dl RALF基因家族成员的生物信息学与表达模式分析,选定具有完整保守基序、响应多种处理且可能参与调控龙眼体胚发生的成员Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9作为候选基因。候选基因Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9以不同模式响应生长素、脱落酸与茉莉酸甲酯的调控。推测Dl RALF基因家族响应包括生长素和脱落酸在内的多种处理,并参与调控龙眼体胚发生及各器官生长发育。3龙眼RALF家族在胚性愈伤组织中的遗传转化研究及转录水平的调控研究为进一步探究Dl RALFs在龙眼体胚发生早期的功能,将携带关键成员序列的p CAMBIA1301过表达载体稳定遗传转化龙眼胚性愈伤组织,获得Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE、Dl RALF9-OE和Dl MIR408-OE龙眼胚性培养物细胞系材料并探究Dl RALFs/Dl MIR408潜在的基因互作调控网络。结果显示:Dl MIR408上调Dl RALF4和Dl RALF5的表达,而显著下调了Dl RALF9的表达;Dl RALF4与Dl RALF9下调dlo-mi R408-3p的表达;Dl RALF4、Dl RALF9和Dl MIR408调控Dl YUC家族成员Dl YUC4与Dl YUC8以及糖基化磷脂酰肌醇通路上成员Dl GPI8与Dl FER的表达;Dl RALF5对上述成员的表达量影响均不显著。推测Dl RALF4、Dl RALF9与Dl MIR408共同构建基因互作调控网络并参与生长素合成代谢和糖基化磷脂酰肌醇途径等通路,Dl RALF基因家族成员可能通过这一通路参与龙眼体胚发生中的生长与形态建成。4龙眼体胚发生早期Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系的生理生化功能研究对Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE龙眼胚性培养物细胞系中生理生化指标进行测定,比较分析发现:Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系均具有碱化胞外介质这一典型功能;与空载(Empty vector,EV)相比,Dl RALF4-OE与Dl RALF9-OE细胞系中内源IAA含量上升,Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系中内源ABA含量下降,这3个基因都具有降低内源BR含量的作用,说明Dl RALF基因家族在龙眼胚性培养物中具有调控内源激素IAA、ABA和BR含量的作用;Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系中SOD和POD的活性与类黄酮含量均较EV显著上升,Dl RALF4和Dl RALF5显著提升了羟自由基清除率,但Dl RALF9降低了羟自由基清除率,这3个候选基因均显著提高了龙眼体胚发生早期的总抗氧化能力。因此,推测Dl RALF基因家族通过提高抗氧化物的含量和抗氧化物的活性增强了龙眼胚性培养物的抗氧化能力,保证胚性细胞氧化还原环境平衡,并起到维持龙眼愈伤组织胚性和抵抗胁迫的作用。5 Dl RALFs响应外源芸苔素内酯并参与调控龙眼体胚早期发生芸苔素内酯与RALF肽在调控根系生长上具有拮抗关系,且芸苔素内酯在棉花等多个物种中具有调控体胚发生的作用。因此,通过芸苔素内酯处理龙眼胚性愈伤组织,进一步探究Dl RALF基因家族与芸苔素内酯的互作关系及其在龙眼体胚发生早期的功能。结果显示,基于球形胚(GE)诱导培养基和添加高浓度生长素类似物2,4-D的继代培养基下添加外源芸苔素内酯促进龙眼体胚早期发生,抑制龙眼胚性培养物的增殖,其中0.5 mg/L浓度芸苔素内酯处理的差异最为显著;芸苔素内酯对IAA和ABA的含量均具有抑制作用,而芸苔素内酯和2,4-D在调控内源激素含量上可能具有拮抗作用;Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9受到芸苔素内酯和2,4-D的调控,但在不同浓度、不同天数和不同组合方式的芸苔素内酯处理中的表达模式不同;Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9均下调芸苔素内酯合成基因Dl CYP92C6的表达MCC950分子量。综上所述,Dl RALF基因家族关键成员具有拮抗芸苔素内酯的作用,而芸苔素内酯促进龙眼体胚早期发生,抑制龙眼胚性培养物的增殖,这可能是芸苔素内酯与其他激素例如IAA、ABA和RALF肽激素互作而调控的。综上所述,Dl RALF基因家族与Dl MIR408相互作用于激素串扰网络和糖基化磷脂酰肌醇通路,并通过与IAA、ABA和BR等植物激素互作参与龙眼体胚发生的过程;此外,Dl RALF基因家族关键成员通过调控抗氧化物的含量与活性,起到调控龙眼胚性培养物氧化环境稳态和抵抗逆境胁迫的作用。

目的 分析前列腺增生症术后患者尿路感染的病原菌检测结果、耐药性及CYP1A2基因多态性。方法 以2019年1月-2022年5月山东省泰山医院收治的前列腺增生症术后患者206例为研究CFTR抑制剂对象，根据患者术后是否发生尿路感染将其分为感染组(63例)和未感染组(143例)。比较两组一般资料及临床特点、CYP1A2基因多态性，统计前列腺增生症术后尿路感染患者感染病原菌分寻找更多布情况及其耐药性。结果 感染组合并糖尿病患者占比高于未感染组，住院时间长于未感染组(P<0.05);感染组等位基因A占比和基因型AA占比均高于未感染组；63例前列腺增生症术后尿路感染患者共分离出72株病原菌，其中革兰阴性菌检出41株，占比为56.94%Recurrent hepatitis C,检出率最高的病原菌为大肠埃希菌，占比为27.78%;革兰阳性菌检出31株，占比为43.06%,检出率最高的病原菌为屎肠球菌，占比为18.06%;大肠埃希菌对氨苄西林耐药性较高，耐药株数为17株，对头孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、呋喃妥因、头孢哌酮、亚胺培南较敏感；屎肠球菌对青霉素G耐药性较高，耐药株数为11株，对呋喃妥因、万古霉素较敏感。结论 前列腺增生症术后尿路感染患者具有合并糖尿病患者占比高、住院时间长的特点，其主要感染病原菌种类为大肠埃希菌、屎肠球菌，选择敏感度较高的抗菌药物对患者进行治疗有助于尽快控制患者病情。

目的 评估胚系乳腺癌易感基因（BRCA）联合动态监测血清癌抗原125(CA125)在晚期上皮性卵巢癌（EOC）病人初治铂敏感性预测及判断预后中的价值。方法 收集并回顾性分析2017年1月至2020年1月在蚌埠医学院第一附属医院行满意减瘤术且术后采用TC（紫杉醇+卡铂）/TP（紫杉醇+顺铂）方案静脉化疗的EOC病人151例的临床病理资料。分析胚系BRCA与EOC病人临床病理特征之间的关系；计算曲线下面积（AGSK1349572小鼠UC）值等评估胚系BRCA、治疗早期血清CA125水平及两者联合预测晚期EOC病人初治铂敏感性的效能；分析胚系BRCA、治疗早期血清CA125与晚期EOC病人无进展生存期（PFS）的关系；并对所有EOC病人的PFS进行多因素生存分析。结果 胚系BRCA致病突变率为28.5%(43/151)。胚系BRCA与确诊年龄、治疗前血清CA125、遗传性乳腺癌和卵巢癌（HBOC）家族史等具有相关性（P<0.05）；胚系BRCA、第一周期化疗后血清CA125单独预测晚期EOC病人初治铂敏感性的AUC为0.63、0.76；胚系BRCA与第一周期化疗后血清CA125串联预测晚期EOC病人初治铂敏感性的效能最高，AUC为0.79,95%CI:(0.69,0.90)，灵敏度为69.7%，特异度为89.2%；在晚期EOC病人中，BRCA野生型+第一周期化疗后CA125>35 U/mL组病人的PFS生存曲线显著低于BRCA突变型+第一周期化疗后CA125≤35 U/mL组、BRCA突变型+第一周期化疗后CA125>35 U/mL组、BRNirogacestat体外CA野生型+第一周期化疗后CA125≤35 U/mL组（P=0.013、0.007、0.003）。多因素Cox回归分析显示第一周期化疗后血清CA125水平是EOC病人肿瘤无进展生存时间（PFS）的独立预后因素。结论 胚系BRCA联合血清CA125动态监测对晚期EInnate and adaptative immuneOC病人铂敏感性及预后有一定的预测价值。胚系BRCA野生型且第一周期化疗后血清CA125水平未正常提示EOC病人铂耐药及易复发的风险高。

人诱导性多能干细胞(iPSC)因其具有无限扩增及多向分化潜能,已经在基础研究和再生医学领域发挥着重要作用。为充分挖掘iPSC的巨大潜力,常需要对其进行CRISPR-Cas9基因编辑。然而,由于许多致病基因位于iPSC闭合染色质区域内,限制了 CRISPR-Cas9技术在这些位点的编辑效果。通过使用HDAC抑制剂对电转后iPSC短暂处理,我们发现非开放位点的非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)效率分别提高了 1.5倍和3倍左右。此外,HDAC抑制剂还可以提升iPSC中Cas9核酸酶及sgRNA编辑元件的表达水平,从而进一步促进基因组的整体切割。其次,CRISPR-Cas9基因编辑技术存在的脱靶切割问题也是该技术临床应用中需要关注的重点。我们对目前常用的GUIDE-seq脱靶分析方法进行了一系列优化,并将该新方法命名为OliTag-seq。在OliTag-seq中,Caatypical mycobacterial infections9产生的双链断裂位点(DSB)中dsODN的全长插入效率提高了 1.7倍,一轮PCR采用三引物混合方式也大大简化了建库流程。同时,我们进一步验证了染色质可及性会影响Cas9的特异性切割,iPSC因其染色质疏松而表现出更Tezacaftor抑制剂好的脱靶识别能力。此外,组成型Casselleck CX-54619表达与HDAC抑制剂瞬时开放染色质也进一步改善了脱靶识别。利用OliTag-seq,我们对几个CAR-T相关位点的sgRNA识别出了多个新的脱靶位点。另外,鉴于目前CRISPR-Cas9技术发展尚未成熟,相关基因治疗临床试验还比较少,我们又聚焦于传统的慢病毒载体疗法。我们系统优化了蓝鸟公司针对β-地中海贫血的BB305慢病毒载体,对HBB编码区潜在的转录终止信号进行了沉默突变,并将LCR增强子元件由2.6kb精简到1.9kb,同时设计了HBG2突变型启动子,开发得到新型HBB慢病毒载体。与BB305载体相比,该新型载体滴度提高了 6倍左右,β-珠蛋白表达水平提高了 40%以上,并在小鼠体内表现出更好的治疗效果,有望显著降低β-地中海贫血的基因治疗成本。最后,我们对上述新型HBB慢病毒载体在基因组中的整合安全性进行了分析,并初步探索了慢病毒整合位点的数据分析方法。我们借鉴INSPIIRED中提到的方法,在PCR过程中引入一个阻断型寡核苷酸,并测试了多个PCR条件,以最大程度地富集得到3′-LTR及整合位点邻近基因组序列。通过对OliTag-seq流程进行修饰来分析HBB慢病毒载体整合位点的数据,我们发现其在HBG2、TBC1D5、MROH1等基因处的整合位点丰度较高,且大多集中在内含子区域,这与已知的慢病毒载体倾向整合性一致。综上所述,我们围绕干细胞基因编辑与基因治疗研究方向进行了多个技术开发,一定程度上解决了 iPSC非开放位点基因编辑的技术难题,我们也对上市药物BB305慢病毒载体进行了系统优化,在提高载体滴度的同时也提高了 β-珠蛋白的表达水平。此外,我们还针对CRISPR-Cas9基因编辑及慢病毒载体基因治疗的安全性问题开发了分析流程。我们期望本研究论文能对β-地中海贫血基因治疗或癌症免疫治疗发挥指导作用,也期待我们的技术成果早日实现临床或产业转化。

目的:基于线粒体自噬探讨青光安颗粒剂对DBA/2J小鼠视网膜及视神经组织中LC3、LAMP1、Caspase-3、Cyt C、Parkin表达的影响。方法:将20只C57BL/6J小鼠作为视神经空白组、视网膜空白组,每组10只;将60只DBA/2J小鼠采用随机数字法分为视神经模型组、视网膜模型组、视神经低剂量组、视网膜低剂量组、视神经高剂量组、视网膜高剂量组,每组10只。喂养小鼠至38周龄,期间观测小鼠眼压,待DBA/2J小鼠自动成模后开始灌胃。模型组每日以生理盐水灌胃;低剂量组、高剂量组分别灌胃青光安20.75 g/kg、103.75 g/kg,每日1次。各组小鼠均以常规饲料喂养。灌胃15 d后,所有视神经组取右眼视神经,所有视网膜组取左眼视网膜。各组采用Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(microtubuleassociated protein light chain 3,LC3)、溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)、细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)蛋白表达,采Roxadustat用RT-q PCR法检测E3泛素连接酶(Parkin)、LAMP1、Caspase-3 m RNA的表达。结果:1.眼压:小鼠喂养至38周龄LEE011体内后,DBA/2J小鼠眼压上升,造模成功。2.通过Western blot法检测了小鼠视神经和视网膜中LC3、LAMP1、Caspase-3、Cyt C的蛋白表达。视神经组中,与视神经空白组相比,视神经模型组Caspase-3、Cyt C、LAMP1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与视神经模型组相比,视神经低剂量组LAMP1、Cyt C、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05),视神经高剂量组LAMP1、Caspase-3、Cyt C、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均降低(P<0.05)。视网膜组中,与视网膜空白组相比,视网膜模型组Caspase-3、Cyt C、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与视网膜模型组相比,视网膜低剂量组Caspase-3、Cyt C、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均降低(P<0.05),视网膜高剂量组Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均降低(P<0.05)。3.通过RT-q PCR法检测了小鼠视神经和视网膜中Parkin、Caspase-3、LAMP1 m RNA表达。视神经组中,与视神经空白组相比,视神经模型组Parkin、Caspase-3、LAMP1m RNA表达水平均升高(P<0.05)。与视神经模型组相比,视神经低剂量组LAMP1、Caspase-3 m RNA表达水平降低(P<0.05),视神经高剂量组Parkin、Caspase-3、LAMP1 m RNAzebrafish-based bioassays表达水平均降低(P<0.05)。与视神经低剂量组相比,视神经高剂量组Parkin、Caspase-3、LAMP1 m RNA表达水平降低(P<0.05)。视网膜组中,与视网膜空白组相比,视网膜模型组Parkin m RNA表达水平降低(P<0.05)。与视网膜模型组相比,视网膜高剂量组Parkin m RNA表达水平升高(P<0.05)。与视网膜低剂量组相比,视网膜高剂量组LAMP1 m RNA表达水平降低(P<0.05),Parkin m RNA表达水平升高(P<0.05)。结论:1.青光安可通过调控青光眼小鼠视神经中Parkin、LAMP1、LC3、Caspase-3、Cyt C的表达,减少自噬体的堆积,使得线粒体自噬过程完整进行,对视神经具有保护作用。2.青光安可在一定程度上降低青光眼小鼠视网膜中LC3-II/LC3-I、Caspase-3的蛋白表达,升高Parkin m RNA的表达,加强线粒体自噬的信号,降低青光眼小鼠视网膜中过剩的线粒体自噬数量,有利于减少自噬体的堆积,以达到保护视网膜的目的。