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根系是在植物生长发育过程中起重要作用的器官,植物根系生物量的积累和生长发育状况均与糖代谢联系密切。蔗糖磷酸合酶(SPS)是调控蔗糖合成和淀粉分解的关键限速酶,对光合产物在淀粉和蔗糖间的分配起到重要作用。植物中的蔗糖是由SPS催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸果糖(F6P)生成6-磷酸蔗糖(S6P),再由蔗糖磷酸化酶(SPP)催化形成的。前人的研究表明SPS基因共分为A、B、C、D四个亚家族且SPS基因家族成员在植物中存在时空特异性表达。但目前对大豆中SPS基因家族的研究不够深入,因此本研究通过生信分析鉴定出大豆SPS基因家族的6位成员,对其进行系统进化分析和基因结构特征分析,通过基因表达模式预测和时空表达分析筛选出在大豆根系中表达量最高的大豆SPS基因家族成员Gm SPSA-2基因;克隆该基因构建过表达载体,转化拟南芥获得T1代转基因阳性拟南芥植株,侵染大豆获得过表达Gm SPSA-2阳性发根,测定其表型来验证Gm SPSAhepatic fibrogenesis-2基因对拟南芥和大豆根系的影响。具体研究结果如下:1、大豆中共鉴定出6个SPS基因家族成员,通过系统进化分析将其分为A、B、C三个亚家族。LOC100127429(Glyma.13G161600)和LOC100798787(Glyma.17G109700)是A亚家族成员,这两个成员分别命名为Gm SPSA-1和Gm SPSA-2,其分别定位在13号和17号染色体上;LOC100806543(Glyma.14G029100)、LOC100813168(Glyma.08G308600)和LOC100807527(Glyma.18G108100)是B亚家族的成员,这三个成员分别命名为Gm SPSB-1、Gm SPSB-2和Gm SPSB-3,其分别定位在14号、8号和18号染色体上;LOC100786531(Glyma.06G323700)是C亚家族的成员,命名为Gm SPSC,定位在6号染色体上。共线性分析表明Gm SPSA-1和Gm SPSA-2存在共线性关系;Gm SPSB-1、Gm SPSB-2和Gm SPSB-3存在共线性关系;Gm SPSC不存在共线性关系。大豆SPS基因家族成员外显子数目有12-14个,保守基序分布相似。除Gm SPSA-2外,大豆SPS各基因家族成员启动子区域均含大量顺式作用元件。2、对大豆SPS基因家族成员进行时空表达分析,结果表明大豆SPS基因家族成员的时空表达存在特异性。在根部相对表达量最高的基因为Gm SPSA-2,其在生殖生长时期时相对表达量较高;茎部和荚皮中相对表达量最高的基因为Gm SPSC,其在生殖生长时期Serine Protease抑制剂相对表达量较高;叶、花和籽粒中相对表达量最高的基因为Gm SPSB-1,其在生殖生长时期相对表达量较高。3、构建p Earley Gate-Gm SPSA-2植物过表达载体,转化col野生型拟南芥植株。对T1代转Target Protein Ligan抑制剂基因阳性拟南芥植株和阴性对照拟南芥植株进行定量分析和表型测定,结果表明:过表达Gm SPSA-2阳性拟南芥植株根系中目的基因的表达量是阴性对照拟南芥植株根系的6.54-8.38倍;其根长是阴性对照拟南芥植株根长的1.24-1.7倍;其根重是阴性对照拟南芥植株根重的1.5-1.67倍;其淀粉消耗能力是阴性对照拟南芥植株根系的3.1-4.1倍。利用该过表达载体对东农50进行发根转化。对过表达Gm SPSA-2阳性大豆发根和阴性对照发根进行定量分析和表型测定,结果表明:大豆过表达Gm SPSA-2阳性发根中目的基因的表达量是阴性对照发根的15.1-27.6倍;其淀粉的消耗能力是阴性对照发根的1.41-1.47倍。以上结果表明Gm SPSA-2基因可以调控淀粉的消耗,从而影响植株根系的生长发育状况和生物量的积累。

姜黄素是一种从中药姜黄中提取的活性多酚，目前研究表明姜黄素具有很高的药用价值，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用，并可用于治疗多种疾病。近年来，越来越多的研究证明姜黄素在治疗溃疡性结肠炎方面具有显著的疗效。溃疡性结肠炎是结肠的慢性炎性疾病，其特征在于结肠黏膜的弥漫性浅表炎症，且病变从直肠延伸至盲肠。国内外研究表明，姜黄素可通过多种作用机制发挥显著的溃疡性结肠炎治疗作用，本文主要从其作用机制方面进行总结。(1)调节细胞因子表达，姜黄素可减轻炎性组织中性粒细胞浸润，抑制促炎性细胞因子TNF-α,IL-8和IL-1β的产生，增加了抗炎细胞因子（IL-4,IL-10和IL-13）并引起炎症反应的减少，降低免疫反应，发挥抗炎及治疗溃疡性结肠炎作用；(2)抑制NF-κB的活化，NF-κB是炎症环境中的关键因素，姜黄素通过调节NF-κB/IkB通路和促炎细胞因子的下调表达来抑制NF-κB的活化，阻断细胞质IκCross infectionB蛋白的降解，从而防止炎症级联反应和即将发生的结肠黏膜损伤。(3)调节M1/M2巨噬细胞极化和TLR信号通路的平衡，研究发现，姜黄素可以通过抑制TLR信号通路的激活，抑制巨噬细胞活化并MRTX849调节M1/M2巨噬细胞极化和效应功能，从而抑制促炎细胞因子的释放，改善溃疡性结肠炎的症状。(4)调节肠道微生物环境稳态，姜黄素和肠道微生物群之间存在双向相互作用。肠道微生物群积极参与姜黄素代谢，导致姜黄素生物转化（去甲基化、羟基化、脱甲氧基化）和代谢物的产生，另外姜黄素可有效促进有益细菌菌株的生长，改善肠道屏障功能，并抵消促炎介质的表达。综上所述，姜黄素可以调节细胞因子表达，调节信号通路和肠道菌群来治PD-0332991研究购买疗溃疡性结肠炎，在溃疡性结肠炎的治疗中具有极大的应用潜力。

为了探究紫苏粕多糖（Perilla meal Polysaccharide， PMP）抗氧化活性以及对H_(2)O_(2)诱导LO2肝细胞氧化损伤的保护作用及其机制，采用水提醇沉法提取PMP，检测PMP对羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O_(2)-·）、亚硝酸盐（NO_(Hepatic organoids2)~(-)）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）的清除作用；建立LO2细胞氧化损伤模型，在细胞水平探讨PMP的抗氧化能力，并进一步研究PMP对LO2肝细胞氧化应激损伤的保护作用机制。结果显示，PMP对·OH、O_(2)-·、NO_(2)~(-)、DPPH·具有一定的清除能力，其EC_(VX-445体内50)值分别为：964.59，6376.84，275.24，333.55 μg/mL；在保Transmembrane Transporters抑制剂护LO2肝细胞氧化损伤方面，选择浓度800 μmol/L H_(2)O_(2)处理24 h作为肝细胞氧化损伤模型的构建条件，PMP可显著提高H_(2)O_(2)诱导损伤的LO2细胞活力（P<0.05 vs 损伤组），当PMP浓度达1000 μg/mL时，细胞存活率可提高到92.46%。在保护LO2氧化损伤机制方面，PMP显著降低H_(2)O_(2)诱导的细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平，提升线粒体膜电位，提高细胞内谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase， CAT）的活性，减少丙二醛(Malondialdehyde，MDA）的水平，并通过显著上调凋亡蛋白Bcl-2的表达和下调Bax、PARP的表达改善氧化应激损伤引起的细胞凋亡，提高细胞的增殖活性。因此，紫苏粕多糖表现出一定的抗氧化活性，为紫苏多糖的进一步开发提供理论基础。

背景：细胞衰老是一种应激反应，它会引起细胞周期停滞。衰老细胞的特点是长时间和一般不可逆的细胞周期停止，这种状态耗尽了器官中的分裂细胞池，并损害了组织再生，最终导致与年龄相关的器官损伤，急性衰老的诱导可以限制纤维化，但挥之不去的衰老细胞会推动疾病的发展。目的：整理与剖析近年来基于细胞外信号通路与高糖环境的关系，初步探索中医药延缓肾系膜细胞细胞衰老的机制与方法。方法：以Wnt/β-catenin，mesangial precision and translational medicinecell， high glucoseMAPK抑制剂 environment，aging”或“Wnt/β-catenin，肾系膜细胞，高糖环境，衰老”为主题检索词，检索中国期刊全文数据厍、PudMed、知网数据库，纳入Wnt/β-catenin信号通路、高糖环境对肾系膜细胞细胞衰老影响的相关文章，检索时间范围为2000-2022年，最终选择73篇文献进行综述。结果：本文总结出高糖环境会加速肾系膜细胞的衰老，通过抑制Wnt/β-catenin信www.selleck.cn/products/imidazole-ketone-erastin号通路可以延缓其衰老。结论:高糖环境可以加速肾系膜细胞衰老进程，靶向延缓肾系膜细胞衰老可能成为治疗糖尿病肾病的新思路。

目的:1.研究系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosue,SLE)患者外周血干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)水平、自然杀伤(Natural killer,NK)细胞计数及CD4~+T细胞亚群绝对计数水平。2.分析SLE患者IFN-α水平与NK细胞计数之间的相关性及其与疾病活动指标的相关性。3.比较短期小剂量白Alisertib浓度介素-2(Low-dose Interleukin-2,Ld-IL2)治疗前后SLE患者外周血中IFN-α水平、NK细胞计数及CD4~+T细胞亚群的变化。方法:选取山西医科大学第二医院风湿免疫科住院及门诊确诊的71例SLE患者为研究对象,排除肿瘤及其他自身免疫病患者,以及妊娠或哺乳期妇女。同时选取我院体检中心同时期的年龄、性别匹配的30例健康体检者作为健康对照组。分别于清晨抽取这两组的空腹静脉血2管,第1管采用酶联免疫吸附试验测定IFN-α水平,第2管采用流式细胞仪术检测外周血NK细胞数,CD4~+T细胞各亚群计数。并收集71例SLE组的临床资料(年龄、性别、是否初诊及疾病病程等)以及相关实验室化验指标:红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation Rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、补体C_3、C_4、ANA抗体滴度及ds-DNA抗体。通过计算SLE组各患者的与疾病活动度相关的系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评分,将SLE患者组分为低疾病活动组(27例)和中高疾病活动组(44例)。研究内容分为4部分:1.将71例SLE患者与30例健康人分别作为病例组与健康对照组,比较两组受试者外周血IFN-α水平、NK细胞绝对计数及CD4~+T淋巴细胞亚群的差异;2.将71例患者分为低疾病活动组27例和中高疾病活动组44例,并纳入健康受试者,比较三组受试者IFN-α水平、NK细胞绝对计数及CD4~+T淋巴细胞亚群的差异。3.分别分析IFN-α水平与NK细胞计数之间的相关性及其与疾病活动指标的相关性。4.在71例SLE患者中选取49例作为受试者,在使用标准治疗(包括糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂或联合使用)的基础上,加用小剂量IL-2短期治疗(50WIU,皮下注射,连用5天),比较Ld-IL2治疗前后SLE患者外周血IFN-α表达水平、NK细胞计数及CD4~+T淋巴细胞亚群计数的变化。结果:1.SLE患者外周血中IFN-α水平升高,NK细胞绝对计数及CD4~+T细胞绝对计数下降,差异有统计学意义(P<0.001);Th2细胞绝对计数、Treg细胞绝对计数及Th17/Treg细胞比值下降,差异有统计学意义PEG300分子量(P<0.01);Th1细胞绝对计数、Th17细胞绝对计数及Th1/Th2细胞比值差异无统计学意义(P>0.05)。2.与健康对照组相比,低疾病活动组SLE患者IFN-α水平升高,NK细胞绝对计数降低,差异有统计学意义(P<0.05),CD4~+T细胞亚群差异无统计学意义(P>0.05)。与低疾病活动组相比,中高疾病活动组SLE患者NK细胞绝对计数、CD4~+T细胞绝对计数降低,IFN-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),CD4~+T细胞亚群差异无统计学意义(P>0.05)。3.SLE患者外周血IFN-α水平与NK细胞绝对计数(r=-0.243,P=0.042)呈负相关。IFN-α水平与SLEDAI评分(r=0.487,P<0.001)、ESR(r=0.438,P<0.001)正相关,与补体C_3水平呈负相关趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);NK细胞绝对计数与SLEDAI评分(r=-0.483,P<0.001)、ESR(r=-0.307,P=0.009)呈负相关,与补体C_3水平呈正相关(r=0.284,P=0.016)。4.Ld-IL2治connected medical technology疗后,SLE患者的白细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数及补体C_3均升高,差异有统计学意义(P<0.01);ESR及SLEDAI评分下降,差异有统计学意义(P<0.001);血小板、C-反应蛋白及补体C_4治疗前后差异均无统计学意义(P>0.05)。IFN-α水平及Th17/Treg细胞比值降低,差异有统计学意义(P<0.05),NK细胞绝对计数、CD4~+T细胞绝对计数、Th1细胞绝对计数、Th2细胞绝对计数、Treg细胞绝对计数升高,差异有统计学意义(P<0.05),Th17细胞绝对计数、Th1/Th2细胞比值差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.SLE患者体内存在免疫状态紊乱,外周血中IFN-α水平升高,NK细胞计数及CD4~+T细胞亚群计数降低;2.SLE患者IFN-α水平与NK细胞绝对计数呈负相关;且均与疾病活动度相关;3.短期Ld-IL2治疗可能通过恢复IFN-α水平,NK细胞数量及CD4~+T细胞亚群计数改善SLE患者体内免疫失衡。但其长期疗效有待进一步的研究。

目的探讨CXC趋化因子配体10(CXCL10）基因对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y氧化损伤、钙稳态失衡及核因子E2相关因selleck激酶抑制剂子2(Nrf2）、BCL2相互作用蛋白3(BNIP3）表达的影响。方法采用H_2O_2损伤SH-SY5cytotoxicity immunologicY细胞，分为对照组（未经H_2O_2损伤的SH-SY5Y细胞）、模型组（H_2O_2干预的SH-SY5Y细胞）、NC-siRNA组（H_2O_2干预的SH-SY5Y细胞转染NC-siRNA）及CXCL10-siRNA组（H_2O_2干预的SH-SY5Y细胞转染CXCL10-siRNA),peDNA3.1.D组（H_2O_2干预的SH-SY5Y细胞转染空载体）及CXCLl0/peDNA3.1组（H_2O_2干预的SH-SY5Y细胞转染CXCL10/peDNA3.1）。采用实时荧光定量（qRT-PCR）检测各组细胞CXCL10 mRNA、MTT检测各组细胞活性、相关试剂盒检测氧化应激指标、流式细胞仪检测各组细胞Ca~(2+)荧光强度和免疫印迹检测各组细胞Nrf2、BNIP3表达。结果对照组、模型组、NC-siRNA组、CXCL10-siRNA组、peDNA3.1.D组和CXCLl0/peDNA3.1组中CXCL10 mRNA水平分别为1.02±0.08、1.44±0.14、1.40±0.17、0.73±0.05、1.49±0.18和2.20±0.16，差异有统计学意义（F=77.400,P<0.05）；与对照组相比，模型组细胞活性、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、Nrf2、BNIP3降低，丙二醛（MDA）、CaMRTX849~(2+)荧光强度升高（P<0.05）；模型组、NC-siRNA组、peDNA3.1.D组上述指标比较无意义（P>0.05），与模型组相比，CXCL10-siRNA组细胞活性、GSH、SOD、CAT、Nrf2、BNIP3升高（P<0.05),MDA、Ca~(2+)荧光强度升降低（P<0.05),CXCL10/peDNA3.1组细胞活性、GSH、SOD、CAT、Nrf2、BNIP3降低（P<0.05),MDA、Ca~(2+)荧光强度升高（P<0.05）。结论下调CX-CL10基因可提高H_2O_2损伤后SH-SY5Y细胞活性，并可抗氧化应激，降低细胞内游离Ca~(2+)水平，这可能与激活Nrf2/BNIP3信号通路相关。

目的:探讨肾动脉支架置入术治疗动脉粥样硬化性肾动脉狭窄(ARAS)治疗效果。方法:选取内蒙古自治区人民医院2020年6月至2022年6月收治的55例动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者,均行肾动脉支架置入术,并进行为期12个月的随访Tailor-made biopolymer,观察并记录患者术后1个月、6个月、12个月血压、口服降压药、肾脏功能的变化情况,以及术后有无发生主要心血管不良事件、支架再狭窄、术后并发症等问题。分析肾动脉狭窄的介入治疗是否可以使患者受益。结果:55例患者均接受肾动脉支架置入术,手术成功率100%。治疗12个月后,术后一个月血压(收缩压131.36±6.84mm Hg,舒张压82.33±3.69mm Hg)、术后六个月血压(收缩压130.33±6.30mm Hg,舒张压81.29±2.61mm Hg)、术后十二个月血压(收Nirogacestat体内实验剂量缩压129.45±5.8Etoposide8mm Hg,舒张压81.42±2.27mm Hg)与术前测量血压(收缩压157.00±7.52m m Hg,舒张压92.55±4.37mm Hg)相比,其血压水平明显下降((49)<0.05)。55例患者术后口服降压药(2.65±0.64)种类与术前口服降压药(1.15±0.35)种类相比明显下降((49)<0.05)。术后一个月[肌酐(77.87±16.97)μmol/L、胱抑素C(1.034±0.215)mg/L、肾小球滤过率(67.40±32.69)ml/(min·1.73 m~2)]、术后六个月[肌酐(77.98±16.98)μmo l/L、胱抑素C(1.028±0.214)mg/L、肾小球滤过率(67.55±32.63)ml/(min·1.73 m~2)]、术后十二个月[肌酐(77.85±16.97)μmol/L、胱抑素C(1.024±0.216)mg/L、肾小球滤过率(67.33±32.58)ml/(min·1.73 m~2)]较术前[肌酐(77.88±17.13)μmol/L、胱抑素C(1.029±0.222)mg/L、肾小球滤过率(67.44±32.90)ml/(min·1.73 m~2)]相比变化不大((49)>0.05)。结论:肾动脉支架置入术是一种有效解除动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的治疗手段,可以有效降低患者肾血管性高血压,但对于肾脏功能保护方面目前并无确切效果。

目的·研究F-box蛋白38 (F-box only protein 38,FBXO38)对眼部黑色素瘤增殖的作用以及潜在的调控通路。方法·使用FBXO38短发夹RNA (short hairpin RNA,sh RNA)和FBXO38过表达质粒构建FBXO38敲低以及过表达的人皮肤黑色素瘤A375和葡萄膜黑色素瘤OMM2.3细胞系，并通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和Western blotting在转录和蛋白水平验证FBXO38的敲低和过表达效率。通过克隆形成实验、Brd U免疫荧光染色和CCK8细胞增殖实验，探究FBXO38对黑色素瘤细胞增殖的影响。使用肿瘤基因组图谱计划数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA），分析FBXO38高表达和低表达组中的差异表达基因，并进行京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集，揭示与FBXO38相关的信号通路。进一步通过CCK8细胞增殖实验检测信号通路抑制剂对不同FBXO38表达量细胞的抑制率。同时通过q RT-PCR和Western blotting，验证在敲低FBXO38之后该通路是否激活。结果·q RT-PCR和Western blotting验证A375和OMM2.3细胞NN2211化学结构系中的FBXO38的m RNA及蛋白质表达水平，发现与对照组相比敲低组的FBXO38表达水平下降，与野生型相比过表达组的FBXO38的表达水平提高（P<0.05）。克隆形成实验、Brd U免疫荧光染色和CLethal infectionCK8细胞增殖实验显示，敲低FBXO38显著增强A375和OMM2.3细胞的增殖能力（P<0.05），反之过表达FBXO38抑制A375和OMM2.3细胞增殖（P<0.05）。KEGG通路富集分析显示，在皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤中，FBXO38的表达影响磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K-Akt)通路激活。与对照组相比，PI3K抑制剂LY294002和m TOR1抑制剂Everolimus对FBXO38敲低组的抑制率显著提升（P<0.05），对FBXO38过表达组的抑制率则显著下降（P<0.05）。Western blotting结果显示，敲低FBXO38之后，与PI3K-Akt通路相关的PTEN、P21和P53蛋白水平下降，而MDM2蛋白水平上升。q RT-PCR结果显示在FBXO38敲低细胞中P53转录水平显著下降（P<0.05），而MDM2转录水平显著上升（P<0.05）。结论·FBXO3Lapatinib核磁8通过PI3K-Akt信号通路参与调控眼部黑色素瘤细胞的增殖。

化疗是胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)患者常用的治疗手段之一,由于CCA在诊断时多处于晚期,约70%的患者确诊时已不适用手术治疗。化疗在一定程度上也无法取得预期效果,由于复杂的耐药机制,CCA对抗肿瘤治疗药物不敏感,甚至耐药,一些耐药机制通常协同作用,使CCA细胞在不同程度上免于药物的抑制作用。研究显示,已有多达一百多个基因参与了包括CCA在内的不同肿瘤的耐药过程。高通量测序技术发展促进了生物信息学的发展,同时科研人员也鉴定出了众多耐药性相关基因。人体中仅有不到2%的基因组编码蛋白质,另有超过98%的转录产物是短链和长链非编码RNA(主要为micro RNA及lnc RNA)。lnc RNA即长链非编码RNA,它们由200多个核苷酸组成,且不具有蛋白质编码功能。与物种间高度保守的微小RNA(micro RNAtumour-infiltrating immune cells)不同,lnc RNA在物种之间不太保守,通常低水平表达并具有较高的组织和发育特异性。lnc RNA参与基因组重要的功能调节,参与了基因转录、剪接和表观遗传学过程,并且参与了细胞周期、细胞分化、发育和生物多能性过程。近年来的研究显示lnc RNAs参与肿瘤治疗的耐药/敏感性过程。在过去的十年中,科研人员已经发表了许多关于lnc RNA和抗癌药物耐药性的研究论文。FALEC(focally amplified long non-coding RNA in epithelial cancer,上皮性癌症局灶扩增长非编码RNA)是位于1q21.2号染色体的lnc RNA,由566个核苷酸组成。研究分析显示FALEC在上皮癌中的表达上调,并通过靶向不同功能基因、调控消化道肿瘤的侵袭和转移,FALEC还介导了前列腺癌的治疗耐药性。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)是胆管癌化疗方案中的常用药物之一,前瞻性临床研究及回顾性研究发现,胆管癌患者接受氟尿嘧啶为基础的二线治疗可以获益。但5-Fu治疗后耐药性的发展导致晚期CCA患者的预后不佳,因此阐明5-Fu潜在的耐药性机制有助于治疗患者预后的改善。在肿瘤中,肿瘤细胞内部支架的变化能够驱动肿瘤细胞的生长和迁移,另外还能使肿瘤细胞在无需获得特定基因突变的情况下,巧妙地避开药物的影响,使肿瘤细胞对包括化疗药物在内的药物产生耐药性。SHOC2(SHOC2 leucine rich repeat scaffold protein,SHOC2富含亮氨酸重复支架蛋白)是一种介导蛋白质相互作用的支架蛋白,研究表明,SHOC2作为支架可加速RAS-RAF(Rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma,大鼠肉瘤蛋白-快速加速纤维肉瘤)相互作用,增强MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)信号传导。ERK(extracellular signal-regulated kinase,细胞外信号调节激酶)-MAPK通路在大多数肿瘤中上调,而针对ERK-MAPK通路的靶向抑制及化疗药物则在临床上受到耐药性和毒性的影响,使临床疗效受到影响。本研究通过分析上述基因在CCA体内及体外的变化,探索这些基因在CCA中的作用,同时明确这些基因在5-Fu耐药过程中扮演的角色,最终为CCA化疗药物的耐药机制研究及临床应用提供可靠参考。第一部分临床样本中长链非编码RNA FALEC与胆管癌5氟尿嘧啶耐药相关性的初步研究CCA是一种少见的胆道系统恶性肿瘤。CCA的异质性导致其治疗时缺乏有效的靶向治疗。对CCA的分子特征的进一步明确有助临床治疗方案的优化。随着测序技术的不断发展,非编码功能的RNA不断被发现,其中就包括lnc RNA。lnc RNA是一类长度大于200 bps的非编码RNA的总称。大量的研究证据显示lnc RNA在包括CCA在内的肿瘤发展过程中扮演重要角色。抗癌治疗对肿瘤及其生态系统具有强大的诱导变化作用。化疗和放疗会增加基因组的不稳定性,对存活细胞和非肿瘤细胞产生广泛的影响,通过诱导宿主的获得性耐药,削减抗肿瘤治疗的反应。耐药是影响肿瘤化疗效果的重要因素,近些年的研究还显示lnc RNAs介导了肿瘤细胞的耐药性或敏感性。研究显示FALEC在包括舌癌、胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤中异常表达。FALEC通过靶向STAT3(signal transducer and activator of transcription 3,信号转导和转录激活子3),NUPR1(nuclear protein 1,transcriptional regulator,核蛋白1,转录调节因子),PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,丙酮酸脱氢酶激酶1),PTEN(phosphatase and TENsin homolog,同源性磷酸酶-张力蛋白)等基因调控胃癌、食管癌,结直肠癌这些肿瘤细胞的生长或增殖;通过靶向ECM1(extracellular matrix protein 1,细胞外基质蛋白1),AKT1(Akt serine/threonine kinase 1,Akt丝氨酸/苏氨酸激酶1),PTEN,FALEC进一步调控胃癌和卵巢癌中肿瘤细胞的侵袭和转移。在去势前列腺癌中,FALEC通过增强PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase 1,聚(ADP-核糖)聚合酶1)介导了耐药性过程。5-Fu是治疗CCA的化疗药物,但其疗效因耐药性而受到影响。FALEC在CCA的5-Fu治疗耐药过程中的作用还有待于进一步的阐明。目的:分析不同临床特征CCA患者手术切除样本中FALEC的表达差异;分析5-Fu耐药诱导细胞系中FALEC的表达变化,并为第二部分的研究奠定工作基础。方法:采用RT-q RT-PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,实时荧光定量聚合酶链反应)方法,分析从临床收集的CCA手术切除样本中FALEC较非肿瘤对照组织的表达,以及接受5-Fu方案不同治疗反应患者样本中的表达差异。最后在体外采用浓度递增法诱导培养5-Fu耐药的CCA细胞系,分析耐药细胞系中FALEC的表达变化。结果:1.与非瘤对照切除组织相比,FALEC在肿瘤组织中的水平明显增加(P=0.003),并且TNM分期高的肿瘤组织中FALEC水平较TNM分期低的肿瘤组织中明显增加(P=0.0033),FALEC在不同部位CCA中的表达没有差异。2.对5-Fu治疗方案抵抗的患者,样本中FALEC水平明显高于5-Fu敏感的患者(P=0.0072)。3.CCA细胞系Hu CCT1,QBC939,Huh-28中FALEC水平高于人肝内胆管上皮细胞HIBEC。4.CCA细胞系经5-Fu诱导后,FALEC表达均增加,采用上调表达明显的2株细胞系QBC939-R和Huh-28-R(P=0.0021,P=0.0032 vs未诱导细胞系)用于进一步的研究。小结:1.FALEC在CCA患者肿瘤组织中表达明显升高,并且随着疾病严重程度而增加;2.5-Fu治疗耐药CCA患者样本及经5-Fu刺激后的CCA细胞中FALEC表达水平明显增加,提示CCA肿瘤组织中FALEC水平升高与5-Fu耐药有关。第二部分长链非编码RNA FALEC对胆管癌细胞生物学行为的影响Lnc RNA可根据长度、功能、位置和靶向机制进行分类,其中根据其功能机制可分为诱饵、支架、信号和引导lnc RNA。除了直接参与基因表达的调节,lnc RNA也可以作为竞争性内源RNA(ce RNA),与其他RNA转录物竞争相同的mi RNA,通过mi RNA相关通路发挥后续的调节功能。在体外研究中,通过外源构建的载体,上调或下调细胞中异常表达的基因,评估基因对靶细胞相关功能的影响,为基因进一步的机制研究打下基础。si RNA(small interfering RNA;小干扰RNA)是长度为20到25个核苷酸的双链RNA寡核苷酸序列,也被称为沉默RNA。si RNA可通过专一性的方式调节基因的表达。使用si RNA沉默lnc RNA是确定lnc RNA功能的有效技术手段。第一部分的研究结果显示,FALEC在5-Fu治疗耐药的临床样本中及5-Fu诱导的耐药细胞中均出现表达上调,提示上调表达的FALEC可能参与了CCA的5-Fu耐药过程,并可能促进CCA细胞恶性生物学行为。通过构建外源si RNA,在CCA细胞中沉默FALEC并评估细胞增殖、迁移的功能变化有助于明确FALEC在CCA及5-Fu耐药中的功能。目的:通过构建外源高效的FALEC干扰序列,分析沉默FALEC后对CCA 5-Fu耐药细胞增殖,迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法:设计FALEC干扰序列,评估干扰序列在CCA 5-Fu耐药细胞中对FALEC的干扰效率。采用CCK-8法和细胞克隆形成实验检测沉默FALEC后对细胞增殖能力的影响。再通过细胞划痕实验和Transwell实验分析沉默FALEC后,CCA 5-Fu耐药细胞中迁移和侵袭能力的改变情况。结果:1.同转染阴性对照序列(si-NC)的细胞株相比,FALEC沉默后(si-FALEC)FALEC在QBC939-R和Huh-28-R细胞中明显降低(P均<0.001)。2.CCK-8实验分析显示QBC939-R和Huh-28-R转染si-FALEC后,两株细胞的增殖能力均出现了明显的降低。3.转染si-FALEC后,CCA耐药细胞株克隆形成能力较转染阴性对照序列的细胞株(si-NC)明显减低(P=0.0031,P=0.0004)。4.沉默FALEC后CCA耐药细胞株QBC939-R和Huh-28-R的迁移能力下降明显(P均<0.001)。5.沉默FALEC削弱了5-Fu耐药株QBC939-R和Huh-28-R细胞的侵袭能力(P均<0.001)。小结:在5-Fu耐药细胞系中使用si RNA沉默FALEC明显降低了耐药细胞系增殖、侵袭等恶性行为,表明CCA细胞中上调的FALEC与5-Fu治疗的不良预后有关。第三部分长链非编码RNA FALEC在胆管癌中影响5氟尿嘧啶药物抵抗的机制研究CCA的发生机制复杂,新的分子标记物为疾病的致病机制及驱动其进展的信号通路研究提供了新的思路。mi RNAs表达失调是肿瘤形成的重要因素之一。除了直接吸收mi RNA或ce RNA,lnc RNA还可作为mi RNA的前体发挥其作用。lnc RNA和mi RNA也可以竞争性结合m RNA的相同位点,防止mi RNA靶向的m RNA降解。在线lnc RNA数据库收集了众多高通量测序数据,这些数据库为lnc RNA的作用和功能研究提供了详实的参考内容,有效提高了lnc RNA功能研究的效率。微小RNA mi R-20a-5p与肿瘤发展密切相关,其参与多种机制发挥调控功能,包括持续增殖信号、逃脱生长抑制、侵袭性和转移性激活、复制永生、血管生成、抵抗细胞死亡和避免免疫损伤等。体内研究证实外源上调表达mi R-20a-5p抑制了MAPK/ERK及c AMP/PKA(cyclic AMP/protein kinase A,环状AMP/蛋白激酶A)信号通路的激活,从而显著改善了荷瘤裸鼠治疗的耐药性。支架蛋白是许多关键信号通路中的重要调控因子,支架蛋白SHOC2与Ras-Raf-ERK信号通路激活有关。它可以促进c-Raf的激活,从而激活c-Raf-MEK(MAPK/ERK kinase,MAPK/ERK激酶)-ERK信号通路。许多研究报道了SHOC2在调节耐药性中的重要作用,在非小细胞肺癌细胞中,SHOC2是EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂)治疗敏感性的关键调节蛋白,SHOC2缺失则进一步增强了MDA-MB-231乳腺癌细胞对MEK抑制剂的敏感性。在线生物信息学工具的进一步分析还显示,SHOC2可能是mi R-20a-5p潜在的靶向调节功能基因。因此在第三部分的研究中探索和验证了FALEC经mi R-20a-5p/SHOC2作用通路参与5-Fu在CCA耐药中的机制。目的:利用在线生物信息学工具,探索能够潜在结合FALEC的mi RNA,并研究调节5-Fu耐药的作用通路。方法:1.使用在线网站工具ENCORI和DIANA-Lnc Base分析能够与FALEC潜在结合的RNA及mi RNA基因。2.使用双荧光素酶报告实验验证FALEC与靶基因的结合情况。3.通过构建的靶mi R-20a-5p模拟物(mi R-20a-5p mimic)及阴性对照序列,转染5-Fu耐药细胞系QBC939-R和Huh-28-R。并分析敲除FALEC后靶基因表达的变化。4.采用CCK-8(cell counting kit-8,细胞计数试剂盒-8)法评估上调mi R-20a-5p后耐药细胞增殖的变化及不同浓度5-Fu下细胞药物敏感性的变化。5.根据在线工具网站预测结果和文献检索结果,确定mi R-20a-5p调节的靶基因及相关信号通路。6.采用相关性分析、功能获得及功能失去研究,确定相VX-765体外关基因间的相互调节关系。7.采用蛋白免疫印迹分析方法,分析验证相关通路中关键蛋白的表达变化。结果:1.生物信息学及文献检索结果提示FALEC可能通过吸附mi R-20a-5p发挥调节作用。2.对5-Fu敏感组织和耐药组织检测后发现5-Fu耐药组织中mi R-20a-5p的水平明显降低。同时还发现mi R-20a-5p在QBC939-R和Huh-28-R细胞中比未经诱导的细胞表达明显降低。3.-Fu耐药细胞系QBC939-R和Huh-28-R中沉默FALEC后,mi R-20a-5p的表达水平明显增加。4.双荧光素酶实验显示mi R-20a-5p同FALEC野生型序列共转染细胞中荧光素酶活性明显降低。5.通过在线工具(ENCORI、Target Scan、mi RDB和Mir Tar Base)筛选mi R-20a-5p的潜在靶向功能基因。结合文献检索结果及在线工具网站DIANA-mi RPath分析mi R-20a-5p的相关通路,结果提示MAPK通路与mi R-20a-5-p的调控功能有关。6.生物信息学分析显示MAPK通路中SHOC2是潜在的结合基因之一。7.临床收集样本中SHOC2 m RNA和mi R-20a-5p表达的相关性分析显示SHOC2 m RNA与mi R-20a-5p表达呈负相关。8.通过mi R-20a-5p mimic外源上调mi R获悉更多-20a-5p的表达后,5-Fu耐药细胞中SHOC2 m RNA及蛋白的表达水平出现明显下降。9.将FALEC过表达质粒(FALEC OE)转染QBC939和Huh-28细胞后,这2株CCA细胞系的耐药性增强;外源增强mi R-20a-5p表达后,5-Fu敏感性增强;沉默SHOC2后,FALEC OE导致的CCA细胞5-Fu耐药性显著下降。10.采用蛋白质印迹(western blot)检测上述不同处理细胞中SHOC2及MAPK信号通路的关键蛋白ERK1/2,p ERK1/2水平。FALEC过表达质粒增强了SHOC2和p ERK1/2蛋白水平;mi R-20a-5p mimic则削弱了FALEC过表达质粒的增强效沉默SHOC2后,FALEC OE增强的p ERK1/2蛋白水平同样明显下降。小结:1.在CCA中,FALEC可通过内源性竞争mi R-20a-5p发挥调节作用。MAPK通路中的SHOC2是FALEC调节的功能基因。2.在CCA中针对FALEC或mi R-20a-5p,靶向性下调或上调这2个基因的表达,可能是改善CCA治疗时5-Fu耐药的策略之一。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是全球养猪业的“头号杀手”,至今仍无有效的疫苗和药物,只能依靠严格检疫和扑杀措施进行防控。造成非洲猪瘟疫苗和药物研发受阻的主要原因在于对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)生物学特性认识的局限性。病毒完全依赖宿主的翻译系统合成病毒蛋白,因此病毒“劫持”宿主翻译系统的策略是决定病毒感染的关键。翻译起始因子eIF2α作为翻译起始调控的核心节点,能够控制蛋白翻译重编程和应激反应走向,对病毒毒力、嗜性、致病性具有重要影响。然而,目前关于ASFV翻译调控策略的认知非常匮乏。本研究主要围绕ASFV如何与真核翻译起始因子2a(eIF2a)信号通E7080价格路相互作用开展,主要内容如下:首先筛选了显著诱导eIF2α磷酸化的ASFV编码蛋白。构建ATF4-RLuc和ATF4-EGFP报告质粒,利用荧光素酶报告基因检测和免疫印迹技术,发现ASFV早期蛋白MGF110-7L诱导eIF2α磷酸化水平显著升高和激活转录因子ATF4表达上调,并激活细胞发生整合应激反应。其次验证了MGF110-7L蛋白的功能。eIF2α发生磷酸化后影响宿主细胞的翻译、应激颗粒形成和细胞周期等。为了研究MGF110-7L蛋白对宿主细胞翻译及应激颗粒形成的影响,利用激光扫描共聚焦显微镜和免疫印迹技术发现MGF110-7L蛋白诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成LEE011试剂,且ISRIB处理能够恢复MGF110-7L蛋白诱导的宿主翻译阻滞和应激颗粒形成,表明MGF110-7L蛋白依赖eIF2α发生磷酸化诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成。再者研究了MGF110-7L蛋白诱导eIF2α磷酸化的机制。生化试验表明过表达MGF110-7L蛋白激活蛋白激酶R(PKR)和PKR样内质网(ER)激酶(PERK),GSK2606414和C16处理可以恢复MGF110-7L蛋白诱导的eIF2α磷酸化,表明MGF110-7L诱导的eIF2α磷酸化是由PKR和PERK介导的,这一过程对宿主翻译阻滞和SGs形成至关重要。序列比对分析表明,不同年份和不同地区的12株高致病性毒株的MGF110-7L蛋白氨基酸序列高度保守,羧基端存在内质网滞留信号-KKDEBlood stream infectionF基序。利用激光扫描共聚焦显微镜技术证实MGF110-7L蛋白主要定位于内质网,并导致分泌途径的特定重组,暗示其可能通过调控细胞内蛋白分泌途径或相关膜性细胞器组分来为病毒增殖服务。进一步的蛋白质组学分析表明,MGF110-7L蛋白与宿主参与调节内质网稳态的蛋白存在相互作用。最后发现MGF110-7L蛋白诱导内质网应激。利用激光扫描共聚焦显微镜和免疫印迹技术发现MGF110-7L蛋白能够诱导宿主细胞发生内质网应激且激活未折叠蛋白反应IRE1-XBP1分支,细胞通过激酶PERK和PKR感应刺激信号,触发eIF2α磷酸化,进而诱导翻译阻滞和应激颗粒形成。综上,本文首次研究了ASFV多基因家族蛋白MGF110-7L的结构、定位及其潜在功能特征,并揭示了其与宿主细胞蛋白翻译系统之间的胁迫关系,为深入认识ASFV的病毒毒力、细胞嗜性、致病性及免疫逃逸等特性提供了新的科学参考。