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目的 探讨小柴胡汤加味联合磷酸奥司他韦颗粒治疗儿童流行性感冒(流感)的疗效。方法 选取该院2020年5月至2021年5月收治的130例流感儿童为研究对象，按随机数字表法将其分为对照组和治疗组，每组65例。对照组患儿仅给予磷酸奥司他韦颗粒，治疗组在对照组基础上给予小柴胡汤加味治疗。2组连续治疗1周。比较2组症状体征消失时间、血常规指标、临床疗效、血清白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、不良反应发生情况。结果 治疗组患儿发热、咳嗽、咽痛、疲劳消失时间明显短于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗后，2组白细胞、淋巴细Dinaciclib抑制剂胞数明显减少，且治疗组明显少于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗组患者总有效率显著高于对照组，差异有统计学VX-661体外意义(P<0.05)。治疗后，2组血清IL-6和TNF-α水平显著下降，且治surface disinfection疗组明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗组不良反应发生率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 小柴胡汤加味联合磷酸奥司他韦颗粒治疗儿童流感疗效明显，能促进患儿症状体征的改善，抑制炎症反应。

目的 探究罗伊适应模式干预在胸腔镜下肺癌根治术患者中的应用效果。方法 采用便利抽样法，选取2021年10月—2022年4月某医院收治的进行胸腔镜下肺癌根治术治疗的82例非小细胞肺癌患者，按随机数字表法分组，对照组(41例)MLN8237开展常规护理，试验组(41例)开展罗伊适应模式干预，对比两组患者的自我效能感、希望水平、癌因性疲乏感、生活质量及并发症发生率。结果 护理后，试验组的自我决策、正性态度、自我减压评分高于对照组(P<0.05);试验组的行为态度、积极态度及亲密关系评分高于faecal microbiome transplantation对照组(P<0.05);试验组的情感疲乏、躯体疲乏及认知疲乏评分低于对照组(P<0.05);试验组的健康调查简表(SF-36)各维度评分均高于对照组(P<0.05);试验组的并发症发生率(4.88%)低于对照组(14.63%),但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 对进Blebbistatin试剂行胸腔镜下肺癌根治术治疗的非小细胞肺癌患者应用罗伊适应模式干预，可增强患者的自我效能感，减轻其癌因性疲乏感，提高其希望水平和生活质量。

五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)中富含三萜类成分人参皂苷,包括达玛烷型四环三萜和齐墩果酸型五环三萜。在人参各药用部位中,以达玛烷型皂苷为主,按照C-6位是否连接有羟基,又可分为原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷。本论文考察了原人参三醇型皂苷(Protopanaxatriol-type Saponins,PTS)和其苷元 PPT(Protopanaxatriol,PPT)的抗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)以及抗脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury,CI/RI)的新生物活性,同时研究了其作用机制及药代动力学。取得了以下创新性成果:一、PTS抗UC的药理作用研究1.PTS中单体皂苷(元)的含量测定采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定了 PTS中人参皂苷(元)Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、F1及 PPT 的含量,分别为 19.68%、30.21%、2.87%、8.41%、1.56%、3.28%和 4.15%,总含量占 PTS 的 70.16%。2.PTS对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的影响建立了 LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,以细胞上清液中炎症因子释放量为指标,评价了 PTS的抗炎活性。结果显示,PTS(25、50、100 μg/ml)可呈剂量依赖性地降低NO、TNF-α、IL-1β及IL-6含量,说明PTS对炎性损伤具有较好的保护作用。3.PTS对DSS诱导的UC小鼠的影响建立了 DSS诱导的小鼠UC模型,以宏观指标评分、组织病理学、结肠及血清中炎症因子水平为指标,考察了 PTS(25、50、100 mg/kg)对UC小鼠的治疗作用。结果显示,PTS可以显著减缓UC小鼠体重下降、降低疾病活动指数、改善结肠病理损伤、降低炎症因子和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)水平,表明PTS具有良好的抗UC活性。4.PTS抗UC的代谢组学研究采用基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,检测小鼠血清和结肠中的代谢物变化,探究与PTS抗UC作用密切相关的生物标志物及代谢途径。结果发现,PTS可通过回调木酮糖、核黄素、19-羟色酮等29个生物标志物、及其所涉及的核黄素代谢、花生四烯酸代谢等11条代谢通路途径,而发挥抗UC活性。5.基于网络药理学及分子对接技术探讨PTS抗UC的作用机制采用网络药理学技术构建了“PTS-UC-交集靶点”网络,采用分子对接技术将主要成分与关键靶点进行对接,推断了 PTS抗UC的潜在机制。结果表明,PTS可能通过影响STAT3、PIK3CA、VEGFA、AKT1和FGF2等关键靶点,从而调节 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、PI3K-Akt、VEGF 等信号通路,而发挥抗UC活性。PTS中的7个主要成分与上述5个关键靶点的结合能均小于-6.4 kcal/mol,表明均具有良好的结合作用。二、PTS及PPT抗CI/RI活性及机制的研究1.PTS对CI/RI大鼠的影响采用线栓法建立了大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型,以神经功能缺失评分、脑梗死体积、组织病理学形态、氧化及炎症因子水平为指标,评价了PTS(25、50、100 mg/kg)对CI/RI大鼠的保护作用。结果表明,PTS中、高剂量可以显著降低神经系统损伤、脑梗死体积、减轻神经元损伤、改善细胞形态、提高尼氏小体数量、调节氧化因子含量、减少炎症因子水平。具有抗CI/RI的生物活性。2.PTS中主要成分对OGD/R-PC12细胞的影响采用OGD/R-PC12细胞模型,模拟体外脑缺血再灌注损伤,以细胞存活率、氧化及炎症因子为指标,评价了 Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2、F1及PPT(6.25,12.5,25 μM)对OGD/R-PC12细胞的保护作用。结果表明,7种成分可以显著增加细胞存活率、降低MDA、TNF-α和IL-6含量、升高SOD含量。对体外脑缺血再灌注损伤具有较好的保护作用。其中,PPT(12.5 μM)urine liquid biopsy活性最强,优于阳性对照药物尼莫地平。3.PPT对CI/www.selleck.cn/products/erastinRI大鼠的影响采用线栓法建立了大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型,以神经功能缺失评分、脑梗死体积、血脑屏障完整性、组织病理学形态、氧化及炎症因子水平为指标,评价了 PPT(5、10、20 mg/kg)对CI/RI大鼠的保护作用。结果表明,PPT可以显著降低神经系统损伤和脑水肿、脑梗死体积、修复血脑屏障、减轻神经元损伤、改善细胞形态、提高尼氏小体数量、调节氧化因子含量、减少炎症因子水平。显示出较强的抗CI/RI活性。4.PPT对OGD/R-PC12细胞凋亡、自噬和血管生成相关蛋白的影响建立了 OGD/R-PC12细胞模型,测定了 PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果表明,PPT能显著提高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和Bcl-2/Bax蛋白的表达;降低 cleaved-Caspase 9/Caspase 9、cleaved-Caspase 3/Caspase 3 线粒体凋亡蛋白的表达;促进自噬相关蛋白p-mTOR/mTOR和血管形成相关蛋白HIF-1α的表达;PPT与Akt、HIF-1α、mTOR、PI3K等关键蛋白的分子对接结果表明,结合能均小于-7.0 kcal/mol。综上,PPT可能通过PI3K/Akt通路对OGD/R-PC12细胞凋亡、自噬和血管生成相关蛋白进行调控,而发挥保护细胞损伤作用。5.PPT抗CI/RI的代谢组学研究采用基于UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术,检测大鼠血清和脑组织中的代谢物变化,探究与PPT治疗CI/RI相关的生物标志物及其代谢途径。结果表明,PPT可通过回调L-苯丙氨酸、2-氨基萘、熊去氧胆酸等19个潜在的生物标志物,共涉及苯丙氨酸、酪氨酸和Protein Tyrosine Kinase抑制剂色氨酸生物合成等5条代谢通路途径,发挥抗CI/RI的作用。三、灌胃给予大鼠PPT的药代动力学研究建立了测定生物样品中PPT含量的UPLC-MS/MS方法,LLOQ、线性范围、特异性、准确度、精密度、稀释可靠性、提取回收率、基质效应和稳定性等均满足药代动力学研究的要求。测定了灌胃给予大鼠PPT(10、20、40 mg/kg)药-时曲线、组织分布、排泄、代谢。1.血浆药-时曲线PPT在血浆中含量较低,Cmax分别为243.94、391.93、572.55 ng/ml;体内吸收较快,Tmax0.92～1.00 h;消除较缓慢,t1/2 7.31～9.00h,CL 9.07～14.08 L/kg·h-1,MRT(0-t)9.22～9.53 h;血管外分布较高,Vd 95.86～182.46 L/kg。PPT在体内药代动力学属线性过程,且不存在性别差异。2.组织分布灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg)的组织分布研究结果表明,PPT在组织中的药物浓度明显高于血浆药物浓度,给药1.5 h至9 h,在组织中广泛分布。在1.5 h和3h时,PPT主要分布在小肠、肺、心中,且在3h时达到峰值,9 h时,PPT在脑组织中达到峰值。提示其抗脑缺血再灌注损伤与药物在脑中的分布有关。3.排泄灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg),经粪样排泄在4～8 h达到最大排泄速率,经尿样排泄在8～12 h达到最大排泄速率,粪样和尿样在72 h内累积排泄量分别为49.05±2.07%和3.81±0.21%,总累积排泄量为52.86%。粪便累积排泄较高可能与PPT的低水溶性有关。4.代谢PPT在体内存在广泛代谢,从灌胃给予大鼠PPT(20 mg/kg)的血浆、粪样和尿样中共鉴定了 13个代谢物,包括Ⅰ相代谢物3个和Ⅱ相代谢物10个。综上,本论文筛选出PTS及其苷元PPT的新生物活性,初步探讨了其作用机制,并阐明了 PPT体内药代动力学行为,为进一步研究与开发PTS及PPT创新药物提供了科学依据,也为UC及CI/RI提供了天然来源的候选药物。本论文创新点:1.发现了 PTS抗溃疡性结肠炎的药理作用;2.发现了 PTS及PPT抗脑缺血再灌注损伤的药理作用;3.开展了 PPT的药代动力学研究,获得了较系统的药动学参数。

目的探讨芪苈强心胶囊对心肌梗死大鼠线粒synthetic genetic circuit体Ca~(2+)转运相关基因的调控作用。方法采用冠状动脉左前降支结扎术建立心肌梗死大鼠模型。术后随机将动物分到模型组、芪苈强心组和卡托普利组;同时设有假手术组作为对照。治疗4周后,通过心脏大体结构观察大鼠心脏梗死范围,HE染色观察大鼠心肌组织病理形态变化;实时荧光(Real-Time)PCR检测大鼠心脏梗死边缘区线粒体Ca~(2+)转运相关基因三磷酸肌醇受体2(IP3R2),葡萄糖调节蛋白75(GRP75),电压依赖性阴离子通道1(VDAC1),线粒体融合蛋白2(Mfn2),以及线粒体凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax) mRNA表达变化;Western blot检测心肌组织Bcl-2,Bax蛋白表达变化;TUNEL染色检测心肌组织细胞凋亡率。结果与假手术组相比,模型组大鼠心脏左室前壁呈现大面积梗死区域,心肌组织结构紊乱;线粒体Ca~(2+)转运相关基因IP3R2,GRP75,VDAC1,Mfn2 mRNA表达显著升高(P <0.05,P <0.01);线粒体凋亡相关分子Bcl-2 mRNA和蛋白表达均明显下降(P <0.01),BaCobimetinib使用方法x mRNA和蛋白表达均显著升高(P <0.01),心肌细胞凋亡率显著增加(P <0.01)。与模型组相比,芪苈强心MS-275组和卡托普利组心脏大体标本的梗死范围缩小,心肌纤维排列相对规整;线粒体Ca~(2+)转运相关基因IP3R2,GRP75,VDAC1,Mfn2 mRNA表达显著降低(P <0.01);线粒体凋亡相关分子Bcl-2 mRNA和蛋白表达有所提高(P <0.05,P <0.01),Bax mRNA和蛋白表达显著降低(P <0.05,P <0.01),心肌细胞凋亡率明显下降(P <0.01)。结论芪苈强心胶囊能够改善心肌梗死大鼠心脏形态结构,其作用机制与调节线粒体Ca~(2+)转运复合体IP3R2/GRP75/VDAC1基因表达,进而抑制细胞凋亡有关。

Gefitinib molecular weightγ-氨基丁酸(GABA)是一类非蛋白质氨基酸,作为主要的抑制性神经递质在中枢神经系统中广泛分布,并具有丰富的生理功能,如可以参与摄食、代谢、内分泌、免疫等多种生理活动的调节作用。作为一种功能性饲料添加剂,目前的研究主要集中在畜禽动物,有关水产动物尤其是虾蟹类甲壳动物则鲜有报道。对底栖生活习性的蟹类而言,水体底层是其一生大部分时间的生活活动区域。底层复杂的生态和生物环境使得动物体更容易遭受病原菌和低氧的威胁。因此,采用营养调整策略提高蟹类的免疫力和低氧耐受能力显得尤为重要。本研究以中华绒螯蟹(幼蟹)为研究对象,综合应用多种研究方法和技术手JNJ-42756493溶解度段,首先从调节摄食、消化、免疫和抗菌等方面,探究了GABA对幼蟹生长和免疫的影响,然后评估了GABA对幼蟹低氧耐受能力的调节作用,并在此基础上分别探究了低氧诱导的神经兴奋性毒性效应和毒性机制,以及GABA在低氧响应中的可能神经保护作用分子机制。主要结果及结论如下:1.幼蟹饲料GABA的适宜添加量及对生长和免疫的调节作用本研究旨在探究GABA在中华绒螯蟹幼蟹摄食、消化、生长性能和免疫反应的调节作用。试验配制了6组不同GABA添加水平的饲料,每组分别为0 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg、320 mg/kg和640 mg/kg,并在喂养幼蟹8周后进行24 h的脂多糖(LPS)攻毒试验。结果显示:饲料适量添加GABA可显著提高幼蟹的蜕壳频率(MF)、增重率(WG)、摄食率(FI)以及消化和吸收相关酶的活性。此外,在脑神经节、胸神经节和肠道组织中,促食性神经信号相关基因的表达显著上调,厌食性神经信号相关基因表达则显著下调。同时,在脑神经节和胸神经节中,参与味觉调节和奖赏调节的主要基因表达水平显著上调,而与惩罚调节有关的基因的表达水平则显著下调。结果表明GABA可能作为一种促食性神经信号,或与其它食欲相关神经信号协同作用,通过参与调节饱腹感回路和奖赏回路来促进摄食。基于SGR和WG对添加GABA水平的双斜率折线回归分析表明,饲料中适宜的GABA添加水平为84-89 mg/kg,该添加量可以有效地改善幼蟹的生长性能、摄食量和消化吸收能力。研究还显示饲料添加适量GABA可以显著增加幼蟹血清中血蓝蛋白含量、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性,并显著降低了谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性。同时,饲料添加适量GABA可以显著增加幼蟹血清中超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽含量,并显著上调肝胰腺中抗氧化相关基因和免疫相关基因的转录水平。相比于PBS处理,LPS攻毒组中抗脂多糖因子、有关炎症信号通路和促凋亡的m RNA水平显著升高,而抗凋亡相关的m RNA水平则明显下调。然而,饲料添加适量GABA有效地减轻了LPS诱导的免疫过度反应和细胞凋亡。上述结果表明GABA可以作为一种免疫调节剂,提高幼蟹的非特异性免疫和抗氧化能力,并有效缓解免疫介导的免疫过度反应。综上所述,在饲料中添加适量的GABA对幼蟹的生长性能和免疫调节有明显的促进作用。2.急性低氧应激下GABA对幼蟹的代谢调节和神经保护作用鉴于GABA在生长和免疫调节中的积极作用,本研究进一步探究了急性低氧应激下GABA对幼蟹呼吸和能量代谢的影响,初步评估了急性低氧造成的神经损伤和GABA对神经的保护作用。养殖试验为期8周,随后进行24 h的急性低氧应激处理(DO:1.0±0.1 mg/L)。结果显示急性低氧应激显著上调了低氧诱导因子1α(HIF 1α)的表达水平,耗氧率和无氧呼吸代谢相关酶活性显著升高,有氧呼吸代谢相关酶活性显著降低。饲料中添加GABA显著改变了急性低氧应激下幼蟹的呼吸代谢模式,有氧呼吸相关酶活性显著升高,无氧呼吸相关酶活性显著下降,并且HIF 1α的表达水平和耗氧率均显著下降。此外,急性低氧应激显著升高了血糖和乳酸(LD,血清和肝胰腺中)的含量及甲壳动物高血糖激素基因(CHH)的表达水平,肝糖原和中华绒螯蟹胰岛素样肽基因(Es＿ILP)及肌肉磷酸精氨酸(PA)水平均显著下降,而饲料添加GABA显著逆转了这种变化趋势。急性低氧应激还显著增加了神经组织中游离谷氨酸(Glu)和GABA的含量,N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)相关受体基因和凋亡相关基因的表达水平均显著上调,而饲料添加GABA可以有效地预防急性低氧诱导的神经损伤。此外,饲料添加GABA可以显著改善急性低氧应激下幼蟹体内的氧化还原状态。以上结果表明,急性低氧会导致中华绒螯蟹幼蟹的有氧代谢抑制和氧化应激,并且会诱导神经组织损伤,而添加GABA可以通过调节代谢模式、提高抗氧化能力和发挥神经保护作用,从而提高幼蟹对低氧环境的耐受能力。3.急性低氧诱导幼蟹的神经兴奋性毒性及其可能机制前期研究发现急性低氧可以诱导神经组织凋亡基因的显著上调,表明急性低氧可能会对神经系统造成毒性损伤。为了进一步明确急性低氧对幼蟹神经系统造成的毒性效应,本研究探讨了急性低氧应激(DO:1.0±0.1mg/L)24 h对中华绒螯蟹幼蟹神经兴奋性毒性的诱导作用及可能的毒性机制。结果显示,与对照组相比,低氧组血糖和血清LD含量显著升高,CHH和HIF-1α的表达水平显著上调。RNA-Seq结果显示急性低氧应激对碳水化合物代谢的影响比脂质和蛋白质代谢的影响更为显著。同时,急性低氧导致神经细胞的凋亡率显著增加,凋亡相关基因的表达也呈现了类似的趋势。RNA-Seq结果提示急性低氧应激可能通过调节多种凋亡相关途径诱导神经元凋亡。此外,低氧组胸神经节神经组织中游离Glu和GABA含量显著高于对照组,并且NMDA相关受体的基因表达水平显著上调。钙依赖性降解酶和内源性抗氧化相关蛋白或酶的基因表达也呈现了类似的趋势。与此同时,与对照组相比,低氧组中高亲和力神经元谷氨酸转运体(n Glt)基因的表达水平显著上调,囊泡谷氨酸转运体(v Glt)基因的表达显著下调。注射NMDA-R拮抗剂(MK-801和Ro25-6981)的结果证实,NMDA-R是Glu诱导神经神经毒性的桥梁和核心。综上,急性低氧应激造成的能量代谢抑制和氧化还原失衡影响了谷氨酸转运体对Glu的重摄取过程,进而导致NMDA型通道过度开放并激活系列降解酶,最终诱发了幼蟹的神经兴奋性毒性和神经元毒性损伤。4.综合生理和多组学分析探究GABA在幼蟹低氧响应中的神经保护作用以上研究显示急性低氧可以诱导神经兴奋性毒性损伤,而GABA呈现出了明显的保护效应。为了揭示急性低氧应激下GABA对中华绒螯蟹的神经保护途径和可能代谢调控机制,开展了为期8周的养殖试验,随后进行24 h的急genetic manipulation性低氧应激处理(DO:1.0±0.1 mg/L),并对幼蟹胸神经节进行了凋亡分析和转录组学与代谢组学的联合分析。结果表明,与低氧组相比,GABA预处理显著降低了幼蟹脑神经节和胸神经节细胞的凋亡率。组学分析结果显示,差异基因和差异代谢物共同注释到了11条KEGG通路,其中共同富集的KEGG通路中仅有鞘脂信号通路和花生四烯酸代谢通路显著性富集。在鞘脂信号通路中,GABA处理显著增加了胸神经节中长链神经酰胺的含量,其通过激活下游信号来抑制低氧诱导的细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。在花生四烯酸代谢途径中,GABA可以通过调节花生四烯酸的物质代谢以增加神经保护活性物质的含量,减少有害代谢物的含量,从而参与炎症调节和神经保护。本研究初步揭示了GABA对低氧应激下幼蟹的神经保护途径和可能机制,并为水产动物低氧耐受研究新靶点的发掘提供了借鉴。

胰腺癌是PLX3397抑制剂一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，患者预后差。由于胰腺癌侵袭性强，并且早期缺乏典型症状，大多数胰腺癌患者被确诊时通常已是晚期甚至伴有转移。因此，胰腺癌的早期诊断对于改善预后至关重要。目AIT Allergy immunotherapy前，通常对高风险人群进行胰腺癌的早期筛查。充分了解胰腺癌的危险因素和发病机制，有助于帮助我们判定高危人群，从而实现胰腺癌的早期诊断和及时治疗。近年来，不同临床影像技术的检出率和超声内镜引导下细针穿刺活检术（endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA）诊断的准确率均有所提高，成为诊断胰腺癌的购买3-Methyladenine金标准。但是，目前尚无用于胰腺癌的临床诊断的高灵敏度和高特异性的生物标志物。糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)是唯一被美国食品药品监督管理局批准的血清生物标志物，但是，由于其特异性有限，不推荐用于胰腺癌的早期筛查。最近，许多研究致力于发现新的可用于胰腺癌诊断的血清标志物，并探究其与CA19-9联合用于诊断胰腺癌。此外，通过液体活检技术检测患者尿液、血液和唾液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、microRNAs(miRNAs)和外泌体，在胰腺癌诊断中的应用也日益受到关注。人工智能、计算机辅助诊断系统、代谢组学技术、离子迁移谱（ion mobility spectrometry,IMS）相关技术、新型纳米材料等新技术也在胰腺癌的早期诊断中得以研究，并展现出广阔的应用前景。本文旨在阐述目前胰腺癌早期筛查和诊断方法的最新进展，包括影像学、病理检查、血清学检查、液体活检以及其他潜在的诊断策略。

目的:肺癌是一种发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌病理类型的绝大多数,靶向治疗是肺癌治疗的一种重要方式。Skp2过表达存在于多种肿瘤类型之中,Skp2蛋白能介导其经典底物p27蛋白的泛素化降解过程,使细胞从G1期进入S期,推动细胞周期进程,促进癌细胞增殖,Skp2已经作为新型癌症治疗药物开发的一个作用靶点。肺癌在中医中可归属于“痰饮”范畴,痰既是肺癌的病因,也是其病理产物。中药化橘红(Citrus grandis‘Tomentosa’,CGT)味辛苦,性温,归肺经,具有理气化痰之功,临床已用于治疗多种呼吸道疾病,但其提取物直接抗肺癌药效、作用机制和其有效活性成分未见文献报道。因此,本课题对化橘红抗NSCLC活性及调控Skp2/p27信号轴抑制NSCLC增殖的作用机制进行研究,并初步探究其抗NSCLC作用的有效活性成分,以期探索化橘红抗NSCLC药物开发前景,为研发高效低毒的NSCLC治疗策略提供理论依据,也为中医药以“化痰”法治疗肺癌的理论提供基础研究支撑。方法:1、通过回流和超声提取分别制备化橘红水提取物(CGTA)和化橘红乙醇提取物(CGTE)。通过溶剂萃取法对CGTE进行萃取,分别制备化橘红石油醚萃取物(CGTPE)、化橘红乙酸乙酯萃取物(CGTEA)和化橘红正丁醇萃取物(CGTNB)。采用MTT法比较两种提取物和三种萃取物对NSCLC细胞生存活力的影响,筛选化橘红各种提取物和萃取物抗NSCLC活性。2、通过MTT、平板克隆和细胞周期实验检测CGTE和CGTPE对NSCLC细胞增殖的影响。3、通过蛋白质免疫印迹实验检测CGTE对Cyclin D1、p27和p21蛋白的影响。4、通过蛋白质免疫印迹、CHX和MG-132实验检测CGTE和CGTPE对Skp2/p27信号轴的影响。5、通过细胞热位移测定(CETSA)、免疫共沉淀(co-IP)和体内泛素化实验检测CGTE和CGTPE对Skp2-SCF E3泛素连接酶活性的影响。6、构建Skp2过表达稳定细胞系,验证CGTE和CGTPE通过Skp2/p27信号轴发挥抗NSCLC效果的作用机制。7、构建C57BL/6小鼠LLC皮下同种移植瘤模型和BALB/c裸鼠A549皮下异种移植瘤模型,利用苏木素和伊红(H&E)染色、免疫组化(IHC)和蛋白质免疫印迹实验评价CGTE和CGTPE体内抑制NSCLC生长的效果并验证其作用机制。8、采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对CGTE进行化学成分定性分析。并通过MTT和蛋白质免疫印迹实验对CGTE有效成分抗NSCLC活性进行初步探索。结果:首先,我们对化橘红提取物抗NSCLC效果和作用机制进行了研究。通过对制备的CGTA和CGTE进行抗NSCLC活性筛选,发现CGTE较CGTA具有更强的体外抗NSCLC活性,所以本课题选用CGTE对化橘红抗NSCLC药效、作用机制及有效成分进行研究。MTT实验结果表明CGTE以剂量依赖性的方式抑制多种NSCLC细胞的增殖。我们选用相对较低浓度的CGTE(100、200和300μg/m L),继续检测CGTE对NSCLC细胞增殖的影响。通过平板克隆实验发现,CGTE可显著抑制NSCLC细胞的低密度增殖能力,细胞周期实验也进一步证明了CGTE显著诱导NSCLC细胞G0/G1期周期阻滞,表明CGTE可通过诱导G0/G1期阻滞抑制NSCLC细胞增殖。接着,我们通过蛋白质免疫印迹实验检测CGTE对Cyclin D1、p27和p21蛋白表达的影响,结果表明CGTE对G1期特异性周期蛋白Cyclin D1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21蛋白水平无影响,而能够显著升高p27蛋白表达水平。p27能够严格调控细胞从G1期到S期的转换进程,p27蛋白降解的主要机制是Skp2依赖的泛素蛋白水解途径。鉴于Skp2与其经典底物p27蛋白表达和细胞周期G1期阻滞密切相关,我们通过蛋质免疫印迹实验检测CGTE对这两种蛋白表达的影响,结果发现,CGTE在NSCLC细胞中可以显著升高p27蛋白表达,同时下调Skp2蛋白表达。CHX实验进一步证明,CGTE在NSCLC细胞中增加了p27蛋白的半衰期,同时缩短了Skp2蛋白的半衰期,破坏了Skp2蛋白的稳定性。提示CGTE可能通过抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性促进p27蛋白累积,诱导NSCLC细胞G0/G1期阻滞,从而达到抑制NSCLC细胞增殖的效果。我们接着验证CGTE是否通过Skp2/p27信号轴抑制NSCLC细胞增殖。CETSA结果显示,CGTE提高了Skp2蛋白的热稳定性,表明CGTE有效活性成分具有结合Skp2蛋白的潜能。co-IP实验结果显示,CGTE抑制了Skp2与骨架蛋白Skp1的结合作用,从而破坏Skp2-SCF复合物的完整性;CHX实验表明CGTE显著缩减Skp2蛋白半衰期,而蛋白酶体抑制剂MG-132此网站可以抑制CGTE对Skp2蛋白的促降解效应,证明CGTE通过干扰Skp2-SCF复合物完整性促进Skp2蛋白降解。体内泛素化实验结果表明,CGTE抑制了p27蛋白体内泛素化水平。以上实验结果验证了CGTE能抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性,使得p27泛素化水平降低,促进了p27蛋白累积。在NSCLC细胞中通过慢病毒感染过表达Skp2可以显著减弱CGTE对Skp2/p27信号轴以及NSCLC细胞增殖的抑制作用,进一步验证了CGTE通过Skp2/p27信号轴抑制NSCLC细胞增殖。此外,我们通过构建C57BL/6小鼠LLC皮下同种移植瘤模型和BALB/c裸鼠A549皮下异种移植瘤模型,证实了CGTE(1 g/kg和2 g/kg)给药具有体内抗NSCLC生长的效果。CGTE能够下调肺癌组织中Skp2蛋白表达,同时升高p27蛋白表达,并能下调肺癌组织中细胞增殖相关核抗原Ki67的表达水平,从而验证了CGTE在体内通过Skp2/p27信号轴抑制肺癌增殖的作用机制。CGTE各剂量均未对C57BL/6小鼠和BALB/c裸鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和尿酸(UA)的含量造成显著影响,也未造成明显的组织病理损伤,但CGTE高剂量(2g/kg)给药会导致C57BL/6小鼠体重出现较明显下降。UPLC-MS/MS分析鉴定出CGTE中390种化合物,主要包括黄酮类、香豆素类、脂质、酚酸类、生物碱和萜类等化合物,CGTE化合物中匹配度和相对含量较高的化合物为柚皮苷、柚皮素、野漆树苷、芹菜素、新北美草苷、橙皮内酯、佛手酚、蛇床子素、葡萄内酯、黄柏酮和柠檬苦素等,鉴定结果为化橘红抗NSCLC有效成分研究奠定了基础。在确定Cnucleus mechanobiologyGTE抗NSCLC药效和作用机制的基础上,我们对CGTE中发挥抗NSCLC活性的有效成分进行了初步探索。根据UPLC-MS/MS鉴定结果和文献报道,我们挑选了柚皮苷、野漆树苷、芹菜素、柚皮素和柠檬苦素5种有效成分。通过细胞活性实验比较这5种有效成分抗NSCLC效果,实验结果显示,相比其他4种化合物,柠檬苦素可以较显著降低NSCLC细胞活性。通过蛋白质免疫印迹实验发现柠檬苦素(50、100和150μM)在NSCLC细胞中可以显著升高p27表达,并下调Skp2蛋白表达,提示柠檬苦素可能通过抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶活性促进p27蛋白的累积。表明柠檬苦素是CGTE抗NSCLC活性较高的一种有效成分。鉴于CGTE给药剂量较高,且较高剂量给药时会影响小鼠体重,提示CGTE直接用于药物开发具有局限性。因此,本课题基于CGTE的研究结果,对化橘红中抗NSCLC效果更好的有效部位进行了探索。通过对制备的CGTPE、CGTEA和CGTNB进行抗NSCLC活性筛选,发现CGTPE较其余两种萃取物具有更好的肺癌细胞杀伤效果,且与CGTE相比用药剂量更低,所以我们选用CGTPE(50、75和100μg/m L)继续探究化橘红的抗NSCLC药效和作用机制。通过体外细胞实验发现,CGCompound 3化学结构TPE与CGTE同样能通过作用Skp2/p27信号轴诱导NSCLC细胞G0/G1期阻滞,并抑制NSCLC细胞增殖。体内A549皮下荷瘤实验结果也表明CGTPE在较低剂量下(200 mg/kg、400mg/kg和800 mg/kg)给药具有显著体内抗NSCLC生长的效果。CGTPE体内同样能够下调肺癌组织中Skp2蛋白表达,同时升高p27蛋白表达,并能下调肺癌组织中Ki67的表达水平,CGTPE各剂量组给药后裸鼠体重都没有出现明显下降,且未表现出明显的器官毒性,相较CGTE所用剂量也更低。结论:CGTE和CGTPE能够抑制NSCLC细胞在体内外增殖,其作用机制与其调控Skp2/p27信号轴相关,证实了化橘红具有抗NSCLC效果。

目的:本研究以人参皂苷CK为研究对象,结合能量代谢分析仪、荧光染色、免疫荧光等药效评价体系,以线粒体E3泛素连接酶1(Mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1,Mul1)参与调控线粒体能量代谢、线粒体自噬和线粒体质量控制为切入点,选定人参皂苷CK中抗神经I/R的皂苷单体并明确其作用机制,为阐述人参皂苷CK对神经细胞OGD/R损伤的核心功效提供思路和可靠的实验依据。方法:1通过无糖无血清培养液及缺氧培养的方法,在高分化的大鼠肾上腺皮质细胞瘤PC12细胞中构建糖氧剥夺/复糖复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型。CCK-8法筛选人参RAD001价格总皂苷中对PC12神经细胞GOG/R损伤有保护作用的单体成分。采用ATP荧光定量试剂盒确定ATP含量,利用线粒体能量代谢仪评价线粒体基础氧消耗、最大耗氧量、呼吸潜力和ATP来源,Western Blot和试剂盒分别检测线粒体呼吸链复合物蛋白表达及酶活。明确人参皂苷CK改善OGD/R损伤诱导的线粒体功能障碍的机制。2通过Mito-tracker活细胞荧光探针观察PC12细胞经OGD/R处理及人参皂苷CK处理48h后形态变化。采用Western Blot对自噬关键蛋白进行分析;腺病毒转染m Cherry-e GFP-LC3B串联荧光探针免疫荧光染色对自噬溶酶体数量进行评价。应用转染小干扰RNA(si-RNA)的方法,在Mfn2沉默的PC12细胞中,通过Mito-tracker、免疫荧光、荧光探针等方法示踪线粒体。明确人参皂苷CK通过Mul1/Mfn2通路调控OGD/R损伤诱导的线粒体自噬。3采用Western Blot分别对细胞浆总蛋白和线粒体总蛋白中Mul1、p-Drp1(S637)、动力学相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)、融合蛋白1(Fission 1,Fis1)、视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy protein 1,OPA1)、线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)蛋白的表达进行评价。利用蛋白质免疫共沉淀的方法,明确Mul1与Mfn2蛋白质相互作用。通过引入抑制线粒体分裂的小分子抑制剂Mdivi-1评价上述关键蛋白的表达。通过Mito-SOX荧光探针研究线粒体内ROS的生成,进一步评价人参皂苷CK对OGD/R诱导的PC12神经细胞凋亡的作用。明确人参皂苷CK基于Mul1/Mfn2通路调节OGD/R损伤诱导的线粒体动力学失衡。结果:1人参总皂苷及皂苷单体人参皂苷Rb2、人参皂苷CK对OGD/R诱导的PC12神经细胞损伤有较明显的保护作用,提高OGD/R后PC12细胞活力。人参皂苷CK预防性处理48h可以显著恢复因OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型中ATP含量下降,且ATP主要来源于线粒体内;PC12细胞的基础氧消耗、最大耗氧量、呼吸潜力和ATP明显升高,且呈剂量依赖性。人参皂苷CK对PC12细胞线粒体功能的影响是通过调节其耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)发挥作用的。人参皂苷CK对线粒体复合物蛋白表达没有明显作用,但显著促进了复合物Ⅰ、Ⅲ的酶活,增强线粒体电子传递链的功能。2人参皂苷CK预处理后,OGD/R引起的线粒体过度分裂显著降低。自噬相关关键蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,正向调控蛋白p62cellular structural biology的表达有明显升高。人参皂苷CK预处理48h后,PC12细胞的Parkin-线粒体共定位荧光强度明显降低,沉默Mfn2后,上述现象被明显抑制。Mfn2沉默后,人参皂苷CK预处理显著减少OGD/R损伤引起的线粒体和溶酶体共定位的效果被抵消。3人参皂苷CK预处理后,评价了胞浆和线粒体蛋白中参与线粒体动力学相关蛋白Mul1、p-Drp1(S637)、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2的变化情况。其中,Mul1和Drp1表达显著降低;Mfn2表达显著升高。同时,在沉默Mfn2后,人参皂苷CK对OGD/R损伤引起的线粒体过度分裂的调控作用被明显抑制,提示线粒体分裂与Mfn2表达相关。人参皂苷CK预处理可以降低OGD/R损伤中Mul1介导的Mfn2的泛素化和降解;联合抑制剂Mdivi-1后降低了Mul1的表达的更多同时不影响Mfn2的表达,表明线粒体分裂是发生在Mul1通路之后的;人参皂苷CK通过Mul1/Mfn2通路降低线粒体内ROS的生成。结论:1人参皂苷CK通过增加PC12细胞内ATP生成、增强线粒体呼吸能力和电子传递链活性,改善OGD/R诱导的PC12细胞线粒体功能障碍;通过调节Mul1/Mfn2通路,影响线粒体动力学和线粒体自噬关键蛋白表达,减轻OGD/R诱导的PC12细胞损伤。2人参皂苷CK调节Mul1蛋白的表达,降低Mfn2泛素化和降解,以此增加Mfn2的表达,抑制OGD/R损伤诱导的线粒体过度分裂、线粒体自噬和线粒体凋亡。

目的：探讨防己茯苓汤对心肌纤维化小鼠巨噬细胞极化和氧化应激的影响。方法：通过皮下注射异丙肾上腺素（5 mg·kg~(-1)·d~(-1)）构建心肌纤维化小鼠模型。将50只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、防己茯苓汤低Spinal infection、高剂量组、酒石酸美托洛尔（Meto）组，每组10只。假手术组、模型给予相应体积生理盐水灌胃，防己茯苓汤低、高剂量组分别予以防己茯苓汤低、高剂量NSC 127716研究购买灌胃（3.315、13.26 g·kg~(-1)·d~(-1)）,Meto组予以酒石酸Meto灌胃（15 mg·kg~(-1)·d~(-1)）。2周后，观察小鼠心脏形态，计算平均细胞横截面积、心脏质量指数和心胫比，组织病理学方法观察心肌胶原沉积，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、转化生长因子-β1(TGF-β1)、炎症因子指标[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10]和氧化应激指标[丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）]的表达水平，免疫组织化学染色观察心肌组织CD86和CD206蛋白表达水平。结果：与模型组比较，防己茯苓汤低、高剂量组和Meto组小鼠心脏外观形态明显减小，平均心肌细胞横截面积、心脏质量指数和心胫比显著降低（P<0.01）；血清CK-MB、TGF-β1水平明显降低（P<0.05,P<0.01）；血清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01），抗炎细胞因子IL-1更多0明显升高（P<0.05）；炎症细胞浸润、心肌损伤、胶原沉积和纤维化程度明显减轻；巨噬细胞极化标志物CD86表达水平显著降低（P<0.01）,CD206表达水平显著升高（P<0.01）；氧化应激指标MDA表达水平显著升高（P<0.01）,SOD、GSH表达水平显著降低（P<0.01）。结论：防己茯苓汤可以改善异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化，其机制可能是通过调控巨噬细胞极化和氧化应激发挥作用。

目的:提供一种经济可靠的医学决策模型评估冠心病的风险程度,并基于躯体化症状自评量表(Somatic Self-rating Scale,SSS)探讨心内科因冠心病可能住院的女性患者不良情绪的严重程度,并评估该模型对65岁以下女性群体冠心病疾病二分类诊断模型的价值。协助临床医师做出更合理的诊疗决策,减少不必要的医疗资源消耗。方法:基于皖南医学院第一附属医院电子病历(Electronic medical record,EMR)系统,回顾性分析2020年1月1日至2021年12月31日行冠状动脉造影的患者。收集包括身高体重、吸烟史、检验、检查报告在内的多种医学数据。并对2021年4月至12月于我院初次行冠脉造影的18～65岁青年女性群体进行躯体化症状量表评测,记录其是否诊断冠心病并评估冠脉病变严重程度。使用机器学习(MacSARS-CoV-2 infectionhine Learning,ML)中决策树分类模型进行模型建立,评估纳入的危险因素对于疾病分类的价值及模型的性能。结果:通过对我院心血管内科2020、2021年3791名行冠脉造影的结果进行分析,最终将2814名患者的126个数据特征纳入模型建立,综合分析发现冠心病组与非冠心病组组间一般资料中性别,年龄,基础病患有糖尿病,实验室检查中白细胞计数,中性粒细胞计数,空腹血糖,高密度脂蛋白,检查结果中包括心电图ST-T段改变,超声心动Empagliflozin半抑制浓度图提示心脏收缩功能减退;残余胆固醇,动脉硬化指数在内的新诊断selleckchem RP56976标志物均存在明显差异且位于决策树的顶端,模型的准确率为0.7050,精确率为0.8119,召回率为0.7885,F1值为0.8。量表研究最终纳入133名患者,SSS评分在冠心病组和非冠心病组间具有显著差异(p<0.01)。将SSS评分纳入模型后,SSS评分位于决策树的顶端,重新建模后模型效能提升。结论:1.基于机器学习构建决策树预测模型可以帮助临床医生快速识别,量化风险,避免漏诊、减少不必要医疗资源的消耗。2.SSS评分对于冠心病诊断模型的建立具有重要价值,将不良情绪影响纳入医学决策系统,能够提高决策质量。