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平菇黄斑病品种抗性分化及抗病基因研究

平菇(Pleurotus ostreatus)是世界范围内广泛栽培的食用菌之一。平菇细菌性黄斑病是生产过程中常见的一种病害,严重影响产量和品质,常造成重大的经济损失。托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)是引起平菇黄斑病的主要病原菌,平菇品种对托拉斯假单胞杆菌的抗性差异较大,本课题在评价平菇品种黄斑病抗性的基础上,选择两个抗性差异品种,研究平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制,及品种间抗性差异的原因,主要结果如下:1.将托拉斯假单胞杆菌接种32个平菇品种,于接种后24 h统计病情指数,发现华平36、平8129、特抗650、平早秋615抗病性最好,而黑美89、夏灰1号、华平801品种抗性最差。2.选择抗性差异最大的两个品种(华平801和华平36),将其子实体接种托拉斯假单胞杆菌后,于接种12 h、24 h和72 h后观察症状。发现敏感品种华平801接种12 h后菌盖便出现轻微黄化,24 h表现为大面积黄褐色斑,72 h子实体严重萎缩,呈现水渍状,菌盖全部黄化;而华平36品种在接种病原细菌12 h和24 h后均无症状,接种72 h后菌盖出现少数不扩展的黄色斑点。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜,观察将各时间点患病和健康子实体样本的超微结构。发现两品种菌丝形态和细胞形态差异很大,感病品种接种表面分布大量细菌,菌丝基本全部被细菌包埋,出现断裂和孔洞,而抗病品种细菌分布非常少;感病品种细胞严重变形,产生大量囊泡,细胞内容物外泄,线粒体也发生变形,而抗病品种没有这些细胞变化或轻度发生。3.对各时间点患病及健康样本进行了酶活性测定,结果发现接种托拉斯假单胞杆菌后平菇子实体酪氨酸酶活性、超氧化物歧化酶活性、细胞内丙二醛含量产生变化。抗病品种的酪氨酸酶活性和细胞内丙二醛含量显著低于敏感品种,超氧化物歧化酶活性显著高于敏感品种,表明感病品种酪氨酸酶被激活,细胞受损伤程度大,清除活性氧能力弱。4.对两个品种各时间点患病及健康样本进行了转录组测序,Gene OntCX-5461配制ology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析结果说明,对于敏感品种华平801,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在氧化磷酸化、线粒体跨膜转运、活性氧、奥斯丁醇代谢等生物过程;接种24 h后的差异表达基因主要富集在甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、羧酸代谢、氧化还原酶活性等过程;72 h的差异表达基因主要富集在单氧酶活性、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢过程;而抗性品种华平36,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在芳基醇脱氢酶活性、青霉素和头孢菌素生物合成等生物过程;接种24 h后的差异表达基因未富集到显著的生物过程;72 h的差异表达基因主要富集在甲苯降解、甲酸代谢等途径。时间序列分析结果表明,华平801品种不同表达模式的基因聚类到8个模块,华平36品种不同表达模式的基因聚类到6个模块。5.结合共表达网络分析结果,基于基因功能注释,构建了平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的模型:平菇细胞感受到病原细菌侵染的信号后,通过信号转导途径转导至胞内,编码谷胱甘肽S-转移酶、苯丙氨酸和组氨酸解氨酶、MFS转运蛋白等解毒酶基因被激活,同时细胞色素p450也参与将有毒物质转化或排至细胞外;过氧化物酶基因被激活Cobimetinib以抵抗活性氧的损伤,同时细胞核内进行DNA修复以抵御病原菌的伤害,细胞色素c参与细胞凋亡以维持内环境稳定;膜结构被破坏导致酚类物质被释放,脂肪酸含量升高使细胞膜流动性增大,酪氨酸酶基因被激活,催化酚类物质产生黑色素,造成黄斑症状。6.基于比较转录组信息,分析了平菇品种抗性差异的原因。对照敏感品种,抗病品种中编码真菌毒性、溶菌酶等基因大量上调表达,使细菌不能定殖、增殖;抗病品种细胞受损伤程度小,而感病品种细胞膜受破坏程度大,细胞内容物外泄严重,线粒体受损伤大,细胞不能正常生长;抗病品种酪氨酸酶基因未显著上调表达,酪氨酸酶活性低,无法氧化酚类物质造成黄斑症状;抗病品种SOD酶在接种细菌后一直处于较高水平,可以有效清除活性氧损伤,而感病品种后期SOD酶活性很低。7.于转录组测序结果中挑选出30个候选基因,这些基因在抗性和感病品种间显著差异性表达,并且在其他物种中与抗病性相关,其中包括编码乙醇脱氢酶、溶菌酶、丝氨酸/苏氨酸激酶的基因。测定了这些候选基因在各平菇品种患病子实体中的表达量,与各个品种的病情指数做相关性分析发现,乙醇脱氢酶基因(gene＿6990)、鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)的相对表达量与病情指数间呈显著正相关性;细菌α-l-鼠李糖苷酶发夹结构域基因(gene＿4782)、溶菌酶基因(gene＿6008)、乙醇脱氢酶基因(gene＿5811)相对表达量与病情指数呈显著负相关性。在华平36和华平801品种中克隆了具有相关性的候选基因,发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)和鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)在两品种间有大量单核苷酸多态性和插入/缺失位点,后续可用于筛选快速鉴定平菇品种抗性的分子标记。本课题对平菇群体进行了抗病性鉴定,筛选出了黄斑病抗性平菇品种,挖掘了部分抗病相关基因,对平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制及平菇品种抗性差异的原因进行了研究,有助于深入研究食用菌细菌性黄斑病的发生机制,为平菇的抗性育种和食用菌细菌性黄斑surrogate medical decision maker病的高效防治提供了参考依据。

血小板膜仿生纳米载体的制备和表征及其体外跨胎盘屏障转运效率研究

利用血小板膜(PM)包覆聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒(PLGA NPs),制备成血小板膜仿生纳米粒(P-PLGA NPs)作为药物载体，评价载体的体外跨胎盘屏障转运效率。分别通过超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备P-PLGA NPs。利用粒径仪、透射电镜、能谱仪、SDS-PAGE和Elisa对P-PLGA NPs的理化特性表征，确定最优的制备方法。MTT法考察纳米载体对人绒毛膜癌细胞(BeWo b30)的毒性；流式细胞术探究BeWo b30摄取纳米载体的途径；利用Transwell构建体外胎盘屏障模型，考察纳米载体体外跨胎盘屏障效率。结果显示，PLGA NPs粒径为(174.1±23.4)nm,电势为(-32.3±5.6)mV,PM电势为(-24.5±1.8)mV;超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备的P-PLGA NPs粒径分别为(269.1±32.9)、(425.0±36.6)、(823.4±73.1)nm,电势分别为(-24.1±3.8)、(-26.4±2.3)、(-23.5±2.9)mV,均显著高于PLGA NPs(P<0.05),接近PM电势；表面膜蛋白条带完整且均有特异性蛋白标志物P-选择素存在，初步证明血小板膜成功包覆在PLGA NPs表面。纳米载体在10～1 00molecular and immunological techniques0Emricasan半抑制浓度μg/mL浓度范围内，细胞存活率为90.5%～105.0%,和对照组相比差异无统计学意义，表明载体对细胞无明显毒性；与对照组相比，PLGA NPs组制霉素(NY)摄取抑制率为53%,P-PLGA NPs组阿米洛利(AMR)摄取抑制率为45%,初步证实摄取途径分别为小窝蛋白介导的内吞途径和巨胞饮途径。在胎盘屏障模型中，上室给药浓度为5和20μg/mL时，PLGA NPs转运效率分别高出P-PLGA NPs 1.6%和24.3%;上室给药浓度为100μg/mL时，P-PLGA NPs转运效率高出PLGA NPs 13.8%。研究表明，超声复合法制备的GSK1120212P-PLGA NPs粒径较小，分散均匀；增加纳米载体浓度，P-PLGA NPs跨胎盘屏障转运效率增高。

芳香族有机气溶胶形成机制与细胞毒性研究

芳香化合物是二次有机气溶胶(Secondary Organic AerosoPCI-32765说明书ls,SOA)中一类重要的前体物,由生物质燃烧、化石燃料蒸发、燃烧释放等方式排放到大气中,通过光氧化作用形成气溶胶,对大气环境及人体健康造成有害影响。Chemical and biological properties甲苯及多氯联苯是芳香化合物的主要成分,然而其气溶胶形成机制与细胞毒性机制尚不完全清楚。对此,本研究将分子动力学(Molecular Dynamics,MD)方法和密度泛函理论(Density Functional Theory,DFT)相结合,通过分析其动力学和热力学性质来阐明甲苯SOA成核的分子化学机制。此外,本文以毒性较高的多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls,PCBs)为例系统研究SOA的细胞毒性机制。对此,本研究提出了一个分层多尺度框架,通过整合实验技术、密度泛函理论和由自适应增强的一维和二维自由能采样驱动的微秒级分子动力学模拟研究PCBs的细胞易位特性,进而阐明细胞毒性。研究结果表明,分子等级协同效应使得SOA形成特殊的核壳纳米粒子结构;H_2SO_4–H_2O团簇为核结构,光氧化过程中产生的丙酮酸充当“桥梁”,促进苯甲醛和苯甲酸在H_2SO_4–H_2O团簇表面稳定聚集。此外,化学组分和环境温度对甲苯SOA氢键的概率分布和寿命具有关键影响,缺少丙酮酸的模拟系统的氢键数量和氢键存在概率比其他模拟系统低,同时也改变了甲苯SOA从气体到纳米颗粒转化的能垒。分子间相互作用表明,静电相互作用selleck NVP-TNKS656较范德华相互作用是导致形成稳定甲苯SOA纳米颗粒的主要驱动力。研究结果揭示了大气气溶胶的分子化学性质,揭示分子分级协同效应是大气气溶胶形成过程的关键因素。此外,源自差异性非共价结合的权衡效应在动力学和热力学决定PCBs的易位路径。具体地,补偿良好的非共价键合(结合亲和力差异<14.5 kcal/mol)导致PCBs经历“翻转(Ⅰ→Ⅲ)插入-摄取”的五步跨生物膜运输途径,而严重差异化的非共价键合加剧了PCBs在生物膜表面上的竞争性活性结合,导致PCBs纳米粒子仅仅聚集在细胞膜表面。此外,本研究还利用Zeta电位及细胞毒性实验分别表征了PCBs纳米粒子的溶液分散性及细胞毒性,细胞毒性与PCBs跨膜输运能垒正相关,实验结果与模拟结果在动力学及热力学方面吻合。本文基于实验技术、密度泛函理论和分子动力学模拟方法系统研究了芳香族化合物二次有机气溶胶形成机制,继而研究了其相关细胞毒性机制,对大气污染与防治提供理论指导。

铜纳米团簇基抗菌剂的设计及其广谱抗菌应用研究

细菌是人类众多疾病的病原体,而抗菌技术开发对于人类健康和环境具有重要意义。如今,抗生素是人类解决细菌感染问题的有效手段。然而,抗生素虽然可以解决大部分细菌感染的问题,但随之而来的是可能更加严重的细菌耐药性危机。因此,开发新型、无耐药性抗菌剂已经迫在眉睫。金属纳米团簇(Metal nanoclusters,MNCs)是尺寸小于3 nm的超小金属纳米颗粒。MNCs相比传统纳米材料具有尺寸优势,可更容易地穿过细菌的外部屏障(细胞壁和细胞膜)进historical biodiversity data入细菌内部,从而实现高效抗菌。加之,MNCs表面丰富的活性位点有利于催化细菌内部的生化反应,进一步提高了其抗菌活性。目前,金/银纳米团簇(Au/Ag NCs)的精确合成及结构调控已经趋于成熟,并成功应用于广谱抗菌。但Au、Ag元素的丰度都较低,使其商业化应用受到限制。Cu元素(与Au、Ag同为IB族)在地壳中储量较高,相对Au、Ag具有更广阔的产业化前景。然而,由于铜离子难以还原,铜纳米团簇(Cu NCs)的合成及其广谱抗菌研究一直处于滞后状态。综上,本论文旨在解决耐药菌感染的问题,设计了半胱氨酸保护Cu NCs(Cys-Cu(Ⅰ)NCs)、AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA)和AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs)等铜基纳米材料,研究了其在广谱抗菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的伤口治疗的性能。具体工作如下:(1)首先,本文采用pH调节的配体还原法制备了低成本的Cys-Cu(Ⅰ)NCs,并成功应用于耐药菌感染的治疗。抗菌测试显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs具有优异的广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌MRSA均具有高效的杀菌率。另外,由于Cys的配位作用,Cys-Cu(Ⅰ)NCs相对于Cu SO_4表现出了超低的细胞毒性,反映了其良好的生物相容性。在此基础上,本章进一步对其杀菌机制进行了研究,结果发现Cys-Cu(Ⅰ)NCs能够通过类酶催化产生活性氧物种(ROS)和释放铜离子的双重机制,破坏细菌的细胞壁和细胞膜,扰乱细菌内部的代谢活动,最终杀灭细菌。在上述工作的基础上,本文进一步制备了Cys-Cu(Ⅰ)NCs均匀分散的卡波姆透明凝胶(Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel),并探索了其作为伤口敷料对MRSA(代表性耐药菌)感染的小鼠伤口愈合的作用。结果显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel可以有效根除MRSA,表现出促进耐药菌感染伤口愈合的优异特性,为纳米材料治疗耐药菌感染的研究提供了范例。(2)上述研究发现,Cu NCs虽然具有优异的广谱抗菌活性,但由于其释放接触型杀菌机制,该系列抗菌剂缺乏抗菌的长效性,这也是大部分铜基纳米抗菌剂面临的难题。聚集诱导发光(AIE)机制的Au NCs(AIE-Au NCs)通过光催化的方式持续产生杀灭细菌的ROS,解决了MNCs抗菌持久性不足的问题。然而,Au基体系的高昂成本限制了其商业化应用。因此,本课题理性设计了AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA),解决了铜基纳米材料面临的抗菌短效性的问题。具体讲,本研究使用对巯基苯甲酸(p-MBINCB28060分子式A)合成了原子精确的链状Cu(Ⅰ)络合物。结果发现,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物在碱性的水相环境处于分散的状态,其不能发射荧光。然而,通过降低溶液pH和引入乙醇溶剂,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物出现聚集。并且随着溶剂中乙醇体积分数的提高,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的聚集度升高,进而出现了AIE现象。然而,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的AIE特性依赖于乙醇溶剂的引入,这限制了其在光动力广谱抗菌的应用。为了摆脱对溶剂的依赖,本研究创新性地利用聚乙二醇(PEG)等高分子的空间限域作用,成功制备了水相环境中稳定且AIE机制发光的PCuA。制备的PCuA不仅表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,也展现了良好的生物相容性。抗菌机理研究显示,AIE机制的PCuA具有良好的可见光吸收,微秒级的光生载流子寿命和合理的能级结构,使得其能够在可见光驱动下产生ROS,提高了抗JQ1浓度菌的活性和长效性。该工作为AIE机制发光聚集体的制备以及光动力广谱抗菌研究提供了范例。(3)上述研究表明,AIE机制发光的PCuA具有光动力增强的广谱抗菌活性,缓解了铜基纳米抗菌剂长效性不足的问题。然而,高分子限域策略虽然实现了Cu(Ⅰ)络合物聚集体(AIE机制发光)在水相环境中的稳定存在,但PCuA尺寸过大且难以修饰,这限制了其抗菌性能的进一步的提升。前文已述,MNCs基抗菌剂具有超小尺寸和丰富且可调的表面化学的本征优势。因此,将AIE发光机制引入Cu NCs,不仅能够避免高分子限域策略的缺陷,也可以降低MNCs的抗菌成本和提高MNCs的抗菌长效性。基于此,本章首先制备了原子精确的Cu(Ⅰ)-GSH络合物。通过降低pH和引入不良溶剂(DMF和乙醇)诱导Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集后,本研究发现了Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE活性。本章以Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE研究为基础,在高温(80°C)条件下成功制备了AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs),并实现了简单的pH驱动的Cu(0)核表面Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集度的调控,进而调制了AIE-Cu NCs的荧光颜色。得益于AIE发光机制,AIE-Cu NCs能够在可见光驱动下产生更多的ROS,表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,另外,AIE-Cu NCs也具有良好的生物相容性。在此基础上,本研究进一步制备了含有AIE-Cu NCs的卡波姆透明凝胶(AIE-Cu NCs-gel)。动物实验表明,AIE-Cu NCs-gel表现出了光动力促进MRSA感染的伤口愈合的优异性能。该工作为抗菌剂的设计和MNCs的合成提供了研究范例。

铜纳米团簇基抗菌剂的设计及其广谱抗菌应用研究

自闭症大鼠模型建立与吴茱萸碱衍生物治疗阿尔茨海默病研究

背景:自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一种复杂的、具有高度遗传异质性的神经发育障碍疾病。遗传因素与环境因素的刺激等多种因素均是引起ASD发病的危险因素。四次跨膜蛋白7(Tetraspanin7,TSPAN7)是一种由位于X染色体上的Tspan7基因所编码的细胞表面糖蛋白,在脑组织中高度表达。在生理状态下,TSPAN7参与突触传递、神经元形态发生、树突状细胞(dendritic cell,DCs)和破骨细胞形态发生。研究发现,Tspan7的拷贝数变异与人类ASD的发生和发展密切相关。然而,TSPAN7在ASD的突触和突触完整性层面的潜在机制仍不清楚。为探究TSPAN7在自闭症中的作用,我们利用CRISPR/Cas9技术构建一个Tspan7基因敲除大鼠品系,以期建立Tspan7基因敲除的ASD大鼠模型,并利用该模型探究TSPAN7在自闭症中的作用机制。方法:(1)利用生物信息学分析、PCR、蛋白质印迹(Western blot,WB)和免疫荧光检测TSPAN7序列特征和表达谱。(2)通过CRISPR/Cas9技术构建Tspan7基因敲除大鼠品系(Tspan7-/-),并利用PCR和WB对其进行基因型鉴定和蛋白表达鉴定。(3)通过旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验对野生型(Wild Type,WT)大鼠和Tspan7-/-大鼠在刻板行为、快感缺失、社交活动、学习记忆等四方面自闭症的行为表型进行分析。(4)应用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)、苏木素伊红染色(haematoxylin-eosin staining,HEPARP抑制剂)和 Nissl 染色分析Tspan7-/-大鼠整体脑结构和神经元数量的改变。(5)通过qRT-PCR和Golgi-Cox染色观察Tspan7-/-大鼠大脑ASD相关基因的表达和神经元分支和树突棘数量的改变。采用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测Tspan7-/-大鼠大脑神经元突触完整性。(6)采用WB和IF分析TSPAN7缺失引起的下游信号通路的表达变化。结果:(1)在生理条件下,TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,在大鼠脑组织中表达最高。同时,TSPAN7蛋白在出生时表达较低,从0.5月龄开始至4月龄TSPAN7的表达明显增加。TSPAN7的亚细胞定位主要是在神经元细胞膜上高度表达。在病理条件下,TSPAN7在ASD、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者的脑组织中呈现低表达趋势,表明TSPAN7在神经系统疾病的发展进程中起关键作用。(2)成功构建Tspan7基因敲除大鼠,旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验结果显示Tspan7-/-大鼠表现出刻板行为增多、快感降低、社交减少以及学习记忆损伤等ASD的典型行为学表型。(3)影像学结果显示:Tspan7-/-大鼠在整体水平表现出海马和大脑皮层体积减小的大脑结构的改变。(4)组织形态学显示,Tspan7-/-大鼠大脑海马区神经元数目减少并且排列松散。Tspan7-/-大鼠海马和大脑皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少。(5)TSPAN7缺失导致大鼠大脑海马和皮层PSD95和SYN等突触相关蛋白表达和PSD95免疫标记的突触后膜和SYN免疫标记的突触前膜重叠点明显减少。(6)TSPAN7缺失抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路的激活,进而下调PSD95、SYN和GluR1/2等突触相关蛋白的表达。(7)在Tspan7-/-大鼠原代神经元中,原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC(Proto-Oncogene Tyrosine-Protein Kinase Src,SRC)的重新激活能够恢复 PSD95、SYN 和GluR1/2等突触相关蛋白的表达和突触完整性。结论:TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,并且在神经系统疾病的发展中起关键作用。我们成功构建Tspan7-/-大鼠,该大鼠出现刻板行为增多、快感降低及社交减少等行为学改变,再现人类ASBcl-2抑制剂D行为学表型;Tspan7-/-大鼠海马和皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少,与人类ASD的脑组织病理学改变具有相似性;Tspan7-/-大鼠可作为人类ASD的动物模型。利用模型发现TSPAN7缺失通过抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路激活,引起突触相关蛋白降低和突触完整性损失,是导致ASD的重要发病机制。背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。遗传因素和环境因素等多方面危险因素,造成治疗和药物研发的困难,目前有限的几种药物存在多种不良反应。因此,AD药物研发是迫切需要的。随着对中药成分的深入了解,研究发现吴茱萸碱(evodiamine,Evo)可以改善AD模型小鼠的学习认知功能障碍。然而,Evo具有较高的细胞毒性和较差的生物活性,将Evo直接用于临床AD的治疗是不可行的。因此,本课human cancer biopsies题通过杂环取代和酰胺引入,设计和合成一系列的Evo衍生物,并从中筛选出具有较低细胞毒性和较高生物活性的化合物4c,并探究其治疗AD的作用机制。方法:(1)使用1,2-二甲氧基苯替代吴茱萸碱的吲哚环,通过杂环取代,合成吴茱萸碱衍生物,并通过核磁共振、高分辨质谱对其结构进行鉴定分析。(2)使用吴茱萸碱衍生物干预SH-SY5Y和HepaG2细胞系,利用CCK-8、Calcein-AM/PI染色和xCELLigence实时细胞分析等方法检测其细胞毒性、抗H2O2和AβOs活性。(3)将筛选出的化合物4c进行体内实验,将化合物4c腹腔注射至3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠体内,并利用Y迷宫和Morris水迷宫检测化合物4c对两种AD模型小鼠学习记忆损伤的治疗作用。(4)通过免疫荧光、免疫组化、免疫印迹等方法评价化合物4c对3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠脑内Tau过度磷酸化、淀粉样物质的聚集和神经胶质细胞增生水平的影响。(5)利用转录组测序分析化合物4c对3×Tg模型小鼠后海马组织的mRNA表达的影响,并对其差异基因进行KEGG和PPI网络分析。(6)通过qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光对差异基因进行验证,并分析化合物4c治疗AD潜在的作用机制。结果:(1)以吴茱萸碱为原型,通过杂环取代,共合成21种吴茱萸碱衍生物。其中,化合物4c具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2活性。(2)与吴茱萸碱相比,化合物4c表现出更高的LD50、抗H2O2和AβOs能力。(3)在Y迷宫实验中,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg和APP/PS1模型小鼠的自发交替正确率明显增加;Morris水迷宫实验结果显示,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg模型小鼠潜伏期探索隐藏平台的时间明显缩短,小鼠平台穿越次数、目标象限持续时间明显增加。提示,化合物4c明显改善AD模型小鼠的工作记忆和空间学习记忆。(4)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内Ser202/Thr205(AT8),Thr231(T231)和Thr181(T181)等磷酸化位点的Tau磷酸化水平下降。(5)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮层的Aβ单体、寡聚体和淀粉样物质的聚集明显较少。(6)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮质中Aβ斑块周围的小胶质细胞和星形细胞的聚集明显减少。(7)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内胰岛素信号、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)等AD相关信号通路相关mRN A表达明显下降。(8)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内PI3K和AKT的磷酸化水平显著增加,下游GSK3β蛋白的磷酸化水平显著下降,研究结果提示,化合物4c可改善AD模型小鼠脑组织内PI3K/AKT/GSK3β信号通路的损伤。(9)细胞实验结果显示,化合物4c改善Aβ引起的SH-SY5Y细胞内PI3K/AKT/GSK3β/Tau 功能紊乱。结论:本课题通过杂环取代和酰胺引入,设计并合成一系列吴茱萸碱衍生物,从中筛选出化合物4c,经研究发现化合物4c在体外具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2和AβOs活性,在体内研究证实化合物4c明显改善AD模型小鼠行为学损伤、减少AD模型小鼠脑组织内β淀粉样物质的聚集、Tau的过度磷酸化以及胶质细胞的增生。同时,与吴茱萸碱相比,化合物4c的LD50提高2倍,体内治疗的有效剂量降低约500倍,化合物4c是一种改进成功的治疗AD的先导化合物。此外,为探究化合物4c的作用机制,通过RNA-seq和通路富集分析发现,化合物4c能够影响AD相关基因、AMPK和胰岛素信号通路相关基因的表达。通过体内和体外实验证实化合物4c可以改善PI3K/AKT/GSK3β/Tau的功能障碍。

功能化阳离子聚合物介导磷酸腺苷化蛋白质高效胞内递送研究

近年来,基于蛋白质等生物大分子的研究得到了快速的发展。蛋白质药物具有特异性强、生物活性高等特点,在疾病治疗中发挥出巨大的作用。然而,目前临床使用的蛋白质药物都是针对细胞外靶点开发的,无法直接参与细胞内进行的生化反应。因此,作用于胞内靶点的蛋白质药物具有非常广阔的应用前景。针对天然蛋白难以渗透细胞膜进入胞内发挥作用的问题,研究人员开发了一系列无机纳米颗粒、脂质体、聚合物载体等蛋白质胞内递送系统。其中聚合物载体具有合成简易、易于修饰等特点,成为最具优势的蛋白质胞内递送载体之一。利用载体胞内高效递送蛋白质,关键在于解决载体胞内递送蛋白质面临的挑战:蛋白质与载体稳定结合、蛋白质与载体复合物的高效内吞、溶酶体逃逸以及蛋白质的胞内高效释放等。本论文针对上述关键问题开发了三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)修饰的蛋白质前药,分别设计了胍基和胸苷基团修饰的阳离子聚合物,利用蛋白质前药和载体之间的多重作用力解决了蛋白质与阳离子聚合物无法稳定结合的问题;同时由于蛋白质前药的pH响应性,蛋白质在内涵体酸性环境中无痕释放,从而实现蛋白质的高效胞内递送。第一章介绍了蛋白质药物的概况和应用、蛋白质胞内递送的意义、阳离子聚合物载体递送蛋白质的挑战、蛋白质负电化策略和功能化阳离子聚合物用于蛋白质的胞内递送。第二章发展了一种绿色、快速且安全的蛋白质前药修饰策略,实现蛋白质负电化,并利用胍基修饰的α-螺旋阳离子聚多肽LPP实现蛋白质前药的高效胞内递送及胞内蛋白质无痕释放。一方面,基于生物正交化学的方法,首先利用2-乙酰基苯硼酸(2-acetylphenylboronicacid,ABA)与蛋白质上赖氨酸残基反应形成具有pH响应的“席夫碱”结构,然后ATP通过与ABA形成硼酸酯修饰到蛋白质表面,制成磷酸腺苷化蛋白A-protein。另一方面,通过点击化学反应将胍基修饰到α-螺旋结构的聚多肽主链上得到LPP。通过负电化的蛋白质与阳离子载体的静电作用,蛋白质表面的磷酸基团与载体上胍基间的氢键和盐桥作用,蛋白质前药与载体结合形成稳定的纳米复合物(nanocomplexes,NCs),从而实现了蛋白质高效胞内递送。在细胞内内涵体/溶酶体的酸性环境中,“席夫碱”Microscopy immunoelectron断裂,NCs发生解离,释放蛋白质并恢复活性。该蛋白质递送平台介导了多种不同分子量(12.4-430kDa)和等电点(4.5-10.3)的蛋白质的胞内递送,包括酶、毒素蛋白和抗体等。同时,该策略也高效地将成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated 9,CRISPR-Cas9)核糖核酸蛋白(ribonucleoproteins,RNPs)递送至 293T-EGFP 及 HeLa 细胞中,实现了对增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein,EGFP)和 polo 样激酶 l(polo-like kselleck激酶抑制剂inase 1,PLK1)的基因敲除。第三章发展了一种胸苷化的阳离子聚合物载体PEI-AZT,其可通过碱基配对增强与第一章中发展的磷酸腺苷化蛋白质A-protein的稳定结合,实现蛋白质的高效胞内递送及胞内蛋白质无痕释放。通过点击化学反应将叠氮胸苷(azidothymidine,AZT)修饰到阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)上,制成胸苷化的阳离子聚合物PEI-AZT。PEI-AZT与A-protein间通过静电作用和碱基配对间的氢键作用可形成稳定的NCs。其可实现牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、核糖核酸Rapamycin分子量酶 A(ribonuclease A,RNase A)、细胞色素 C(cytochrome C,Cyt C)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)等不同分子量和等电点的蛋白质的高效胞内递送,并成功递送了 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)这类高分子量的蛋白质。在细胞内涵体/溶酶体的酸性环境中,蛋白质前药中的“席夫碱”断裂,NCs解离,释放包载的蛋白质并顺利恢复其活性。该策略能够将蛋白质递送到正常细胞系(NIH-3T3、H9C2)和肿瘤细胞系(HeLa、A549)中,是一种稳定且普适的蛋白质胞内递送平台。第四章对本文中胞内蛋白递送体系进行了总结,并对后续拟开展的工作做出展望。

荧光共价有机框架的设计合成及在成像和治疗中的应用研究

荧光共价有机框架(COFs)是一种结晶有机多孔材料,由于其具有多孔性、大比表面积、光学性质可调和良好的生物相容性,在生物检测、成像和疾病治疗等领域获得了极大关注。尽管如此,相比于其他材料,COFs在生物和医学领域的应用还处在起步阶段。限制COFs在生物医学领域的广泛应用主要是由于其疏水性、在水中易聚集、形貌不均一,存在荧光的聚集诱导猝灭等。因此,合成和开发具有生物相容性良好、分散性好、发光效率高、具有特定生物功能的荧光COFs材料,并探索其在生物领域的进一步应用,对推动新材料在生物及纳米医学领域的应用具有重要意义。本论文主要聚焦于新型荧光COFs的设计合成、生物功能化以及构建多功能平台实现生物成像及诊疗。主要内容如下:第一章绪论主要介绍了共价有机框架材料的简介、设计、反应类型、合成方法等。重点介绍了荧光COFs的合成以及在生物分析、成像和治疗方面的应用。最后,介绍了本论文的工作意义和内容。第二章亚胺连接荧光共价有机框架的合理设计、合成及pH传感和生物成像研究活细胞中的pH值与癌症和类风湿性关节炎等许多疾病的相关。在本章中,设计和开发了一系列新型亚胺连接的荧光共价有机框架(COFs),用于肿瘤细胞和斑马鱼的pH传感。我们筛选了四种单体,通过席夫碱缩合反应合成了四种具有不同p Ka的COFs(COF_1-COF_4)。所制备的COFs表现出不同的pH依赖性荧光响应。其中,COF_2具有优异的质子化和去质子化的能力、高结晶度、优异的荧光性能和适合生物传感的p Ka。为了提高COF_2的生物相容性和细胞内吞效率,在多聚赖氨酸(PDL)存在下,通过超声辅助剥离,得到纳米尺度的PDL修饰COF_2(PDL@COF_2)作为新型荧光探针。研究发现,该探针具有可逆的质子化和去质子化特性,在pH 5.0到8.0的范围内具有优异的线性响应。基于荧光PDL@COF_2的高稳定性和良好的生物相容性,该探针成功应用于肿瘤细胞和斑马鱼的pH成像。第三章红细胞膜伪装荧光共价有机框架用于生物成像及协同治疗三阴性乳腺癌的研究为了进一步拓展COFs材料在活体内的应用,我们对已合成的亚胺连接荧光COFs进行合理设计,构建了一个具有良好生物相容性的多功能荧光纳米平台,用于肿瘤细胞和荷瘤小鼠的成像及联合诊疗研究。在本章中,我们设计了红细胞膜伪装的荧光COFs,同时利用COFs的大比表面及纳米孔道,负载NO供体(羟基脲,Hu)、葡萄糖氧化酶(GOx)和胞嘧啶磷酸鸟嘌呤寡核苷酸(CPG)(简写为COF@HGC),用于三阴性乳腺癌(TNBC)的饥饿/NO/免疫协同治疗。由于COFs材料有序的孔结构和大的表面积,HGC很容易通过静电吸附、疏水作用等方点击此处式负载到COFs上。同时,叶酸修饰的红细胞膜(FEM)可以提高COFs的靶向效率和血液循环时间。当纳米诊疗剂COF@HGC@FEM被内吞到肿瘤细胞中,FEM上的血红蛋白(Hb)和COFs上的GOx可以触发级联反应,在底物葡萄糖和Hu存在时,可以同时产生NO和消耗葡萄糖,从而杀死肿瘤细胞。此外,CPG可以将肿瘤相关巨噬细胞从促肿瘤表型重新编程为抗肿瘤表型,并增强免疫治疗。另一方面,由于COFs具有优良的荧光性质,因此可用于生物成像的示踪剂。该“三合一”策略构建的仿生纳米平台,可以通过消耗葡萄糖的饥饿治疗、NO气体治疗以及CPG免疫治疗的协同,对TNBC小鼠模型中的肿瘤生长进行有效抑制,在纳米生物医学领selleck域具有潜在的应用前景。第四章基于荧光共价有机框架的ATP刺激响应雌二醇可控释放平台的构建及在心肌缺血/再灌注损伤中的治疗研究生物标志物刺激响应平台的构建,对于智能化的生物传感体系发展和诊疗一体化目标的实现具有非常重要的作用。在本章中,我们开发了一种ATP刺激响应性的四面体DNA(tDNA)门控的荧光COFs纳米平台,利用该平台负载了模型药物分子雌二醇(E2)以及可控药物释放,治疗小鼠心肌的缺血再灌注(I/Rinfection in hematology)损伤。在纳米平台中,具有聚集诱导发射(AIE)性能的COFs首先用单链DNA修饰。其次,具有ATP适体序列修饰的tDNA纳米结构通过与结合在COFs表面上的单链DNA杂交形成门控,以防止COFs上负载的E2泄漏。由于COFs材料被生物大分子tDNA纳米结构修饰,所获得的纳米载体具有高负载能力和强细胞渗透能力。心肌细胞中丰富的内源性ATP可以通过ATP适体复合物的形成来解锁门控tDNA,从而实现E2的可控释放。在心肌I/R损伤细胞和小鼠模型中,我们观察到E2-tDNA/COFs可以通过持续释放E2,有效降低心肌细胞的凋亡,促进心脏功能的恢复。E2对心肌细胞的保护作用可以通过NO的上调来解释。该纳米平台具有优异的光学性能和良好的生物兼容性,可以实现细胞成像和疾病的治疗。我们构建的基于荧光COFs的刺激响应tDNA门控系统,为智能药物递送和疾病治疗提供了一个方便和通用的方法。

水稻OsPGIP1抑制纹枯病菌RsPG1活性提高寄主抗性的分子机制

纹枯病是水稻三大病害之一,在世界各产稻均有发生。水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)腐生性强,其主要通过分泌胞壁降解酶和毒素破坏寄主细胞结构,从而杀死寄主细胞并获得自身生长发育所需要的养分,帮助其在寄主体内扩展。前人研究表明,水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白OsPGIP1(Polygalacturonase-inhibiting protein 1)可抑制纹枯病菌多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,RsPGs)活性,过表达OsPGIP1可显著提高水稻对纹枯病的抗性,但有关该基因与RsPGs互作提高水稻抗纹枯病的分子机制还未有研究。为明确该基因在水稻抗纹枯病中的作用,通过真核表达、瞬时表达、定点突变、酵母双杂和缺失突变等技术,初步研究了 OsPGIP1与RsPG1互作及提高寄主抗性的分子机制,结果如下:将RsPG1基因构建至真核表达载体pPIC9K并转化毕赤酵母selleck HPLC(Pichia pastoris)GS115,经甲醇诱导后,第5天其发酵上清酶活性达388.79 U/mL。提取并纯化蛋白,大小约40kDa,与预测分子量大小一致。表达产物在50℃、pH4.0的条件下酶活性最高,甲醇、甲醛、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等有机溶剂对RsPG1酶活性无显著SCH772984 IC50影响,短时间紫外照射对RsPG1酶活性亦无显著影响。同样构建OsPGIP1基因至真核表达载体,尽管能获得阳性转化子,但均未能分离出其表达产物,发酵上清、菌体破碎上清、菌体破碎沉淀亦均无对RsPG1活性的抑制作用。将OsPGIP1和RsPG1基因分别构建至瞬时表达载体pMD1-35S-GFP,并转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。将含有目的基因的农CNS-active medications杆菌液注射至烟草叶片,注射带有RsPG1基因的瞬时表达载体的烟草可产生水渍状病斑,而共注射RsPG1和OsPGIP1基因瞬时表达载体的烟草无水渍状病斑,表明OsPGIP1基因在烟草中的瞬时表达产物对RsPG1的活性有抑制作用。为明确OsPGIP1与RsPG1的互作位点,通过同源建模与表面自由能分析,筛选出现频率在0.5以上的6个位点进行点突变,分别命名为D60A、Q77A、R175A、R204A、R227A和D269A。酵母双杂显示,野生型OsPGIP1及6个突变体均能与RsPG1互作,说明这些位点的单个突变不影响OsPGIP1与RsPG1的互作。将这6个突变体构建至瞬时表达载体,与带有RsPG1的瞬时表达载体共注射烟草叶片,同样能抑制RsPG1形成的水渍状病斑,说明这些位点与OsPGIP抑制RsPG1的活性无关。PGIP为细胞壁结合蛋白,为明确与OsPGIP1向胞外运输的关键区域,对其LRR区进行渐进式的片段缺失,发现载短LRR区的OsPGIP1Δ9～OsPGIP1Δ1-9对OsPGIP1向胞质外运输无影响。信号肽外泌试验表明,OsPGIP1的信号肽具有很强的外泌功能。这可能就是失去LRR区,但保留了 N端、C端和信号肽区域,OsPGIP1突变体能够运输到胞外的原因。

DNA去甲基化酶ROS1在玉米籽粒发育过程中的作用

玉米是我国种植面积最大,总产量位居首位的重要粮饲作物。玉米籽粒的发育关乎玉米产量,而DNA去甲基化酶对植物生长发育具有重要调控作用,但是对玉米籽粒发育的影响至今还不清楚。印记表达是基因的等位基因基于亲本来源特异性表达的现象。人们推测,等位基因间的差异DNA甲基化是基因印记表达的原因之一,而DNA去甲基化酶介导DNA甲基化水平的变化,但其是否调控基因selleck合成印记表达尚不清楚。针对这些问题,本研究鉴定了玉米DNA去甲基化酶编码基因,获取了它们的突变体材料,并分析了突变体和野生型的DNA甲基化和基因表达水平,探究了DNA去甲基化酶在玉米籽粒基因表达调控(包括印记表达)和籽粒发育中的作用。主要研究结果如下:1、利用拟南芥DNA去甲基化酶蛋白序列与玉米注释基因进行比对,鉴定到四个玉米DNA去甲基化酶编码基因,分别命名为Zm ROS1a-1d。表达分析表明ZFulvestrant研究购买m ROS1a和Zm ROS1b分别在授粉后14天的胚和胚乳中高表达,是主要拷贝。2、获取了Zm ROS1a和Zm ROS1b的EMS诱变材料,并通过杂交手段获得双突材料(zmros1ab)。表型分析显示zmros1a、zmros1b单突变体与野生型在株型以及籽粒发育上没有明显差异,然而zmros1ab双突变体表现出株高和穗位高降低,开花期延迟,百粒重降低,结实率降低等表型。将zmros1a/+、zmros1b/+以及zmros1a/+;zmros1b/+分别自交,发现后代中纯合单突以及双突的占比符合预期,说明单突配子,双突配子均能通过父本或母本传递给后代,这两个基因的突变不影响配子活力。3、对zmros1ab及对应野生型授粉后14天的胚和胚乳进行DNA甲基化测序。比较野生型胚乳和胚DNA甲基化水平,发现胚乳DNA甲基化水平低于胚。与此相符,在胚乳中相对胚鉴定到了更多的DNA甲基化降低的区段。进一步发现,约40%的区段的DNstone material biodecayA甲基化仅在野生型胚乳中下降,在zmros1ab双突变体的胚乳中没有降低,说明Zm ROS1ab介导的DNA去甲基化调控这些区段(命名为“Zm ROS1absensitive DMRs”)在胚乳中的低甲基化的形成。对Zm ROS1ab-sensitive DMRs所靶向的基因进行表达分析,发现这些基因在zmros1ab双突中相对于野生型倾向于下调表达。结合基因组织表达模式进行分析,发现这些基因倾向于在胚乳中特异表达。与此相符,我们鉴定了所有在胚乳中特异表达的基因,发现这些基因在zmros1ab中相对于野生型展现出DNA甲基化升高,基因表达下调的趋势。这些结果表明Zm ROS1ab介导的DNA去甲基化调控胚乳基因表达。4、利用DAP-seq对调控玉米胚乳基因表达的重要转录因子Zm O2在野生型和zmros1ab双突中结合位点进行鉴定。结果显示,大部分(73%)在野生型中鉴定到的结合位点在zmros1ab双突中并没有被鉴定到。利用Diff Bind对野生型和zmros1ab中的差异结合位点进行鉴定,发现这些差异结合位点附近的DNA甲基化在zmros1ab双突中相对野生型展现出较高水平。利用PCR扩增的方式去除野生型和zmros1ab双突间的DNA甲基化差异,Zm O2在这些位点的差异结合消失。此外,这些差异结合位点关联到107个表达基因,其中16个在野生型和zmros1ab间表现出差异表达。这些结果说明Zm ROS1ab介导的DNA去甲基化可以通过影响转录因子与靶位点的结合强度来调控一些基因表达。5、为了研究Zm ROS1ab是否影响基因印记表达,我们使用野生型以及zmros1ab双突(B73背景)分别与Mo17进行正反交,对授粉后14天的胚乳鉴定印记基因并分析等位基因的表达以及DNA甲基化水平。结果显示zmros1ab作为母本时,一些胚乳特异表达MEGs(母源等位表达基因)由于母源等位基因的表达受到抑制不再印记表达,而一些组成型表达PEGs(父源等位表达基因)由于母源等位基因的表达开启不再印记表达。亲本等位基因DNA甲基化检测表明zmros1ab作为母本与Mo17杂交时,母源等位基因的DNA甲基化高于野生型作为母本与Mo17杂交。这些结果说明Zm ROS1ab介导的DNA去甲基化可以调控胚乳特异表达MEGs以及组成型表达PEGs母源等位基因附近DNA甲基化,影响印记基因的形成。