Author: admin

目的 探讨低强度脊髓电刺激（SCS）对实验房颤犬左侧星状神经节（LSG）功能的影响。方法 20只健康成年比格selleck CCRG 81045犬在左心耳处行快速心房起搏（RAP）以诱导急性重构，建立房颤模型，随机分为两组：实验组10只，以引起肌肉震颤的最低电压强度为刺激阈值对T1-2节段脊髓神经予以高频电刺激，使用90%的阈值强度进行SCselleck BerzosertibS并Positive toxicology持续6 h；对照组10只在T1-2附近体表皮肤同样予以低强度刺激6 h。分别在基础状态、6 h末测定递增电压刺激LSG引起的心率变化。横坐标和纵坐标分别以电压刺激强度与最大心率（HR）变化（HR降低的最大百分比）绘出LSG的心率-电压反应曲线。结果 对照组LSG的心率-电压反应曲线没有明显变化；实验组LSG的心率-电压反应曲线逐渐迟钝，而且相同电压引起的心率降低的百分比明显逐渐降低。结论 低强度脊髓电刺激可以抑制实验房颤犬LSG的功能。

鸡肉是世界上最重要的肉类产品,因为它们具有较高的营养价值,是最为廉价的蛋白质获取来源,并在国民经济中发挥着重要作用。因此改善并提高家鸡的生长性能与产肉能力成为了现今研究的热点。近年来,逐渐成熟的分子育种技术为改善家鸡的产肉性能带来了新的契机。本研究通过构建云南大围山微型鸡和科宝肉鸡正反交F_2代资源群体,对F_2代资源群体的胸肌性状相关表型指标进行测定,并对资源群进行全基因组重测序。结合胸肌相关指标进行GWAS分析,挖掘并鉴定与胸肌性状相关的重要候选SNPs和基因。此外,还在体外水平进行了候选基因功能验证,从遗传学角度深入解析家鸡的胸肌性状。本研究的结果如下:本实验采用胸肌性状极端差异群体,科宝肉鸡和大围山微型鸡为父母代成功构建了478只正反交F_2资源群体,并依据杂交方向区分为K21(246只)与K22(232只)群体;获得了F_2代资源群体11项与胸肌性状相关的性状指标,性状遗传力分布于0.01～0.62之间,体重、胸肌重、胸宽、龙骨长以及全净膛重的属于高遗传力性状,而胸肌肌纤维密度、单根肌纤维直径与横截面积则属于低遗传力性状;胸肌重量与其他所有性状均呈显著相关(p<0.05),且与体重、龙骨长、胸宽、胸肌率以及全净膛重相呈高度正相关,与胸深、胸骨重呈中度正相关,与胸肌单根肌纤维的直径和横截面积呈低度正相关,而与肌纤维密度呈负相关;对比K21与K22群体,11项胸肌发育相关性状指标,仅有胸深性状差异显著(p<0.01),且K22群体(87.25 mm)大于K21群体(84.32mm)。随后,利用全基因组重测序技术(10 X)对478只F_2代群体以及40只父母本进行基因分型。F_2代资源群总共获得5.6 TB数据,每个个体平均11.72 GB,共检测到4828637个SNP位点,父母本总共获得0.6 TB数据,每个个体平均15 GB,共检测到17164853个SNP位点;参照父母本基因型数据对F_2代资源群基因型进行定向,经数据质控后共获得12378481个SNP;针对不同性状,分别设定P-value=8.08×10~(-8)与P-value=8.08×10~(-10)为显著medical coverageSNP阈值进行GWAS,共获得213个与胸肌发育相关性状显著相关的SNP,分布于家鸡1号、3号、4号、14号、15号以及Z染色体中,并依据SNP在基因组中的分布获得45个候选基因;经GO注释与KEGG通路分析后,仅有7个基因成功得到注释,包括UFM1、FNDC3A、ALOX5AP、PPP1CB、CALM2、LDB2以及TBX3。这些基因涉及了肌球蛋白结合、钙离子结合、磷酸蛋白磷酸酶激活等涉及蛋白合成与结合的生物功能;所有候选基因均在F_2代资源群胸肌组织内表达,且CALM2表达水平最高,而LDB2表达水平较低;依据候选SNP将F_2代资源群区分为不同基因型群体,SNP(g.G176412883 C)将F_2代资源群区分为3个群体(GG,GC,CC),GG型为原始基因型,该基因型个体胸肌重量显SAHA小鼠著小于其他两个基因型(p<0.01),且对应的候选基因ALXO5AP在该基因型个体中的表达水平显著低于CC+GC型个体(p<0.0001)。最后,对ALOX5AP开展功能验证,发现ALOX5AP在成肌细胞中富集,且实时荧光定量PCR结果表明,ALXO5AP的m RNA表达水平是混合细胞的1.6倍且差异显著(p<0.001);在成肌细胞中过表达ALOX5AP,以构建ALOX5AP过表达细胞系,其中ALOX5AP的m RNA水平是对照细胞系的157%,蛋白水平则为180BMN 673%,且差异显著(p<0.001);同样的方式,构建ALOX5AP沉默细胞系,其中ALOX5AP的m RNA水平是对照细胞系的24%,蛋白水平则为12%,且差异显著(p<0.001)。在成肌细胞中改变ALOX5AP的表达水平会导致成肌细胞的增殖能力变化,其中ALOX5AP过表达细胞系细胞的增殖活力在接种24 h后,显著高于对照细胞系(p<0.001),且与细胞增殖能力相关的基因,IGF1、Myo D以及Myo G的m RNA表达水平都较对照细胞系呈显著上升(p<0.05);ALOX5AP沉默细胞系的细胞增殖活力在接种48 h后显著低于对照细胞系(p<0.05),且与细胞增殖分化能力相关的基因,PAX7、Myo G以及Myo D的m RNA表达水平均较对照细胞系呈显著下调(p<0.05);当检测ALOX5AP差异表达细胞系的周期变化时,发现在ALOX5AP过表达细胞系中,分布于G0/G1与S期的细胞数量显著减少(p<0.05),G2期细胞数量显著上升(p<0.001),表明细胞增殖活力上升,且与细胞周期相关的基因,CDKN1A与CDK1的表达水平均较对照细胞系显著上调(p<0.05);在ALOX5AP沉默细胞系中,分布于S期的细胞数量显著增多(p<0.05),G2期的细胞数量显著下降(p<0.001),而G0/G1期的细胞数量则无显著差异(p>0.05),表明成肌细胞DNA合成能力受损,而与细胞周期相关的基因,CCNA2的表达水平均较对照细胞系显著上调(p<0.05),CDK1与CDK2则显著下调(p<0.05)。综上,本研究成功构建了科宝肉鸡及大围山微型鸡F_2代资源群体,利用全基因组重测序技术对F_2代群体进行了基因分型,并结合胸肌性状相关指标进行了全基因组关联分析,鉴定了家鸡胸肌发育显著相关的SNP与潜在候选基因,针对候选基因ALOX5AP验证了其对成肌细胞增殖活力及周期的影响,表明ALOX5AP通过影响成肌细胞的生物过程而影响F_2代资源群胸肌性状,初步揭示了F_2代资源胸肌性状的遗传规律,为今后探索家鸡胸肌性状的潜在遗传机制做出贡献。

目的探讨硫化氢(H_2S)对胃癌多药耐药性(MDR)的影响。方法采用逐步递增顺铂浓度法建立胃癌多药耐药细胞株MGC803/MDR,显微镜观察细胞形态,CCK8法检测细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC_(50)值,亚甲基蓝分光光度计法检测H_2S含量,Western blot检测胱硫醚-β-合成酶(CBS)表达。结果MGC803/MDR细胞在显微镜下排列松散,胞体较小,细胞形态呈梭形或不规则形。MGC803/MDR细胞connected medical technology对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC_(50)值显著高于MGC803细胞(P<0.01);MGC803/MDR细胞H_2S、CBS表达显著高于MGC803细胞(P<0.01);采用氨基氧乙酸(AOAA)作用24 h后,MGC803/MDR细胞H_2S生成显著减少(P<0.01),对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC_(50)值显著降低(P<0.01)。采用NaSH作用24 h后,MGC803细胞对顺铂、阿霉素、Enasidenib生产商5-氟尿嘧啶的ICBIBW2992_(50)值显著升高(P<0.01)。结论气体信号分子H_2S参与了胃癌多药耐药性的形成。

细胞免疫(Cellular immunity)是适应性免疫应答的重要成员,由T细胞主导,广泛参与机体的生理病理过程。一方面,细胞免疫是机体重要的防御机制,可清除胞内病原体感染、对抗肿瘤的发生和发展。上调细胞免疫是许多抗肿瘤、抗病毒和抗菌疫苗接种的首要目的。另一方面,细胞免疫的过度响应是异基因移植排斥、IV型超敏反应、自身免疫疾病和炎症性疾病等病理状况的主要诱因,在这些情况下,下调细胞免疫是治疗的根本目的。然而,目前调控细胞免疫的手段有限、效率不高,对细胞免疫的认识不够充分,这极大限制了对细胞免疫响应不当引起的疾病的防治,亟待新靶点、新视角的出现。抗原的自身特性和递送载体的类型是影响细胞免疫的重要因素。因此,本研究第一部分考察了抗原形式和递送载体在细胞免疫调控中的潜能。首先,构建了阳离子纳米乳(Cationic nanoemulsion,CNE)作为多表位肿瘤抗原蛋白和抗原m RNA的载体,考察了同一递送载体、不同抗原形式诱导机体抗肿瘤细胞免疫的能力。对比分析结果显示,这两种形式的抗原诱导树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表型成熟和抗原呈递的情况不同,抗原蛋白诱导主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)II类呈递和体液免疫的能力更佳;而抗原m RNA诱导MHC I类呈递和CD8~+T细胞免疫的能力更强。随后,以CNE、阳离子脂质体(Lipo)和脂质纳米粒(Lipid nanoparticle,LNP)为递送载体,以编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突蛋白受体结合域(Receptor binding dSCH727965浓度omain,RBD)的m RNA为抗原,研究了同一抗原形式、不同递送载体诱导机体抗病毒细胞免疫的能力。对比分析发现,LNP诱导体液免疫的能力更强,而CNE和Lipo诱导细胞免疫更有优势。上述结果提示,不同药物分子类型引起的免疫后果不同,合理选择并适当优化药物递送系统(Drug delivery system,DDS)可以改变药物的作用效果,从而为细胞免疫调控提供平台。考虑到机体细胞免疫的参与成员众多、调节网络错综复杂,药物的非靶点特异性分布不仅导致药物分子对细胞免疫的调节效力不足,甚至存在引发脱靶毒性的风险,严重限制其在细胞免疫调控中的应用。相比于组织靶向和细胞靶向,亚细GNE-140细胞培养胞结构靶向更加精细。近年来,分子细胞生物学的发展增加了人们对亚细胞区室结构及其功能的理解,而制剂学和纳米技术的进步为实现药物分子的精准递送和可控释放提供了可能。真核生物内质网(Endoplasmic reticulum,ER)参与并支持多种免疫细胞的多项生理活动,深刻影响机体细胞免疫响应的类型、强度、持续时间和后果,是调控细胞免疫的一个重要靶点。利用靶向DDS促进药物分子的ER选择性积累和干预或许可以通过不同作用细胞和不同作用机制来实现高效的细胞免疫调控,以满足不同治疗需求。基于此,本研究接下来分别构建了两种ER靶向性的药物递送系统,并分别探究了其在上调细胞免疫和下调细胞免疫中的应用和作用机制:一、ER靶向抗原递送上调细胞免疫用于增强抗肿瘤疫苗效果的研究。DCs对外源性抗原的交叉呈递是活化初始CD8~+T细胞,起始特异性细胞免疫的关键环节;也是优化蛋白疫苗接种效果,提高宿主抗感染、抗肿瘤免疫应答的重要手段。ER相关降解(ER-associated degradation,ERAD)系统和多种ER分子伴侣参与并调节DCs对外源性抗原的交叉呈递。因此,增加抗原对ER的可及性或许可以提高DCs的交叉呈递效率,从而上调细胞免疫应答。据此,制备了内部负载肿瘤模式抗原鸡卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)、表面受ER靶向性多肽Pardaxin修饰的阳离子脂质体(OVA@lipo T)。利用该脂质体的阳离子制剂特性促进抗原的负载和细胞的内在化,通过载体的ER靶向性指导抗原的胞内转运和ER选择性积累,并借助ERAD促进抗原的内源性加工和呈递。体内外结果均Molecular Diagnostics显示,该ER靶向抗原递送策略下,DCs交叉呈递的效率显著提高,抗原表位特异性CD8~+T细胞免疫应答被积极调动,可增强抗肿瘤免疫治疗效果。二、ER靶向小分子药物递送下调细胞免疫用于缓解异基因皮肤移植排斥的研究。移植是终末器官衰竭患者的唯一生存选择。在自体移植难以实现的情况下,同种异体移植成为了替代选择,且临床移植多属此类型。然而,异基因移植物容易受到器官受者的免疫系统,尤其是细胞免疫的攻击,导致移植排斥甚至移植失败。越来越多证据显示,细胞免疫介导的异基因移植排斥通常伴随受者淋巴细胞ER应激反应,即,未折叠蛋白响应(Unfolded protein response,UPR)的过度激活,后者由ER驻留跨膜蛋白启动,提示ER靶向干预淋巴细胞的UPR或许可以高效抑制细胞免疫,缓解异基因移植排斥。相应地,制备了负载UPR通路小分子抑制剂(UPR inhibitor,UPRi)、经Pardaxin表面修饰的ER靶向脂质体(UPRi@lipo T)。结果显示,UPRi@lipo T可以被淋巴细胞摄取,靶向定位至细胞ER并实现高效的靶点特异性抑制;UPR参与CD8~+T细胞活化诱导的相转变过程,调控细胞的扩增规模、效应功能与记忆分化;利用UPRi@lipo T靶向抑制淋巴细胞UPR通路的关键信号转导子——肌醇需求激酶/核酸内切酶1(Inositol-requiring kinase/endonuclease 1,IRE1α),可显著限制CD8~+T细胞免疫,诱导系统性细胞免疫抑制,在小鼠同种异体躯干全厚皮肤移植模型中缓和排斥反应、延长移植组织的存活时间,可进一步联用免疫抑制剂FK506以发挥协同细胞免疫抑制作用。综上所述,本研究揭示了ER靶向递送系统在重塑机体细胞免疫方面的巨大潜能,可以通过针对不同靶细胞、采用不同干预机制来实现细胞免疫的上调或下调,以满足不同的应用需求。

目的 探讨芪苈强心胶囊联合左西孟旦治疗老年心力衰竭的效果及对心肌纤维化、炎性因子更多的影响。方法 选取2018年10月至2021年10月我院收治的80例老年心力衰竭患者作为研究对象，以随机数字表法将其分为对照组和观察组，各40例。对照组采用左西孟旦治疗，观察组采用芪苈强心胶囊联合左西孟旦治疗。比较两组的治疗效果。结果 观察组的治疗总有效率高于对照组（P<0.05）。治疗后，观察组的N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)水平低于对照组（P<0.05）。治疗后，观察Pathologic complete remission组的层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）水平低于对照组（P<0.05）。治疗后，观察组的C反应蛋白（CRP）购买Pevonedistat、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平低于对照组（P<0.05）。结论 芪苈强心胶囊联合左西孟旦治疗老年心力衰竭有助于提高临床效果，减轻患者心肌损伤，改善心肌纤维化，促进炎性因子水平下调。

背景：在使用骨支架修复骨缺损时，注意骨免疫反应的调节对骨再生具有重要意义。目的：综述骨免疫反应对骨修复的影响和具有调节骨免疫功能的骨组织工程支架的设计和其在骨修复中的应用。方法：从ScienceDirect、Pub Med、WebofScience与中国知网数据库中检索1973-2023年发表的相关文献。英文检索词：“Osteoimmunology,Macrophages,Bone repair materials,Bone scaffold,Bone defects,Bone regeneration”；中文检索词：“骨免疫，巨噬细胞，骨修复材料，骨支架，骨缺损，骨再生”，对筛选出该领域最新研究进展的80篇文献进行归纳分析。结果与结论：(1)文章详细梳理了骨免疫的起源和发展进程中的重要时间点，并阐述了巨噬细胞作为骨免疫调控体系中重要成员，可分为M1(促炎)和M2(抗炎)两类表型，并在骨再生的不同时期发挥ICI 46474细胞培养着关键作用。在炎症期，M1型巨噬细胞一方面能激活Combinatorial immunotherapy破骨细胞，启动组织修复进程，同时参与骨内微血管网的重建，另一方面炎症后期的骨组织再生过程中，持续高表达M1型巨噬细胞会阻碍新骨形成；而在修复期，M2型巨噬细胞一方面可分泌成骨细胞因子，刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化和矿化，进而促进骨形成，另一方面，长期激活的M2型巨噬细胞会增加促纤维化分子的分泌，导致瘢痕组织的过度形成，从而延迟愈合过程。因此调控巨噬细胞在适宜的阶段进行表型转换，构建有益于成骨的免疫微环境对骨再生意义巨大。(2)在设计具备骨免疫调控特性的骨支架过程中，可通过改变支架粗糙度、孔隙结构、刚度、亲水性、表面电荷、表面官能团等理化性质影响非特异性蛋白质和细胞黏附，从而影响骨支架与免疫系统的相互作用。而将羟基磷灰石，生物活性玻璃、金属离子、细胞外基质、药物、细胞因子和外泌体等生物活性物质进行表面功能涂层设计，则可在植入机体之后通过释放生物活性物质，主动调控免疫微环境，影响巨噬细胞极化和巨噬细胞与骨骼细胞之间的串扰，促进巨噬细胞更多的M2极化，构建出有利于骨再生的骨免疫微环境。(3)基于骨组织工程支架的研发，除了关注干细胞成骨分化的直接调控因素外，还应注重对干细胞分化的免疫微环境的管理，通过调控适宜的骨免疫微环境，诱导更多的干细胞成骨分化，增强支架的成骨效能，并凝练出“骨免疫调节特性”的理念，深入阐明了骨免疫微环境的多向调节作用并介绍了现有改变支架理化性能和表面功能涂层策略赋予支架骨免疫调控潜能的策略，为指导新一代具有骨免疫调控特性的骨组织工程支CL13900体内架的研发提供新思路。但是骨免疫微环境是一个动态平衡状态，现有研究的调控策略多数未顾虑到调控的动态匹配性，因此针对具有高效且靶向调控免疫微环境的智能骨免疫调控支架的研发，是未来学者研究的重点关注方向。

目的:本文以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)重要毒力、致病基因PE/PPE家族基因编码蛋白成员PE22为切入点,研究PE22蛋白在MTB感染过程中发挥的作用及免疫学功能,为进一步分析MTB的致病机制提供实验依据及理论基础。方法:1.PE22蛋白的生物信息学分析及原核表达:通过Expasy Prot Param、Prot Scale、TMHMM Server v.2.0、Signal P 5.0pathologic outcomes Server、Net Phos-3.1、Cell-PLoc 2.0、SOPMA、SWISS MODEL、ABCpred、IEDB Analysis Resource、SYFPEITHI、Net MHC II pan4.0 Server、Net CTL-1.2等软件对PE22蛋白进行生物信息学分析,原核表达PE22蛋白并对其进行Western blot鉴定。2.PE22蛋白对耻垢分枝杆菌表型的影响:以纯化的PE22蛋白免疫BALB/c小鼠后获取的血清为一抗,Western blot验证电击转化法构建的能异源表达PE22蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS);观察构建成功的重组菌株MS-vec、MS-PE22的菌落形态及E-616452抑制剂生物膜的形成,并测定其生长曲线,初步分析重组MS的生物学特性;运用滴板法与菌落计数法(CFU)分析MS-vec及MS-PE22在孔雀绿、低p H、饥饿、H_2O_2、溶菌酶、Na NO_2、SDS等不同生存压力下的耐受性。3.PE22蛋白对巨噬细胞ANA-1功能的影响:重组菌株MS-vec及MS-PE22侵染ANA-1细胞后,抗酸染色观察重组菌侵染情况,CCK8法检测重组菌侵染ANA-1后细胞的增殖活力,Griess法检测细胞培养上清的NO含量与其涉及的信号通路,ANNEXIN V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,q RT-PCR法检测细胞i NOS、TNF-α、IL-6、IL-12p40、IL-10、IL-1β的RNA表达水平与TNF-α、IL-1β分泌所涉及的信号通路,CFU法检测重组菌株在胞内的生存能力。结果:1.PE22蛋白的生物信息学分析及原核表达:生物信息学分析显示PE22蛋白的相对分子质量为10373.77,理论等电点为6.82,由98个氨基酸组成,为结构稳www.selleck.cn/products/Decitabine定的疏水性蛋白,无跨膜区与信号肽,定位于细胞壁,含9个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋构成。抗原表位预测分析显示PE22蛋白含10个线性B细胞优势抗原表位、3个构象B细胞优势抗原表位、6个Th细胞优势抗原表位与7个限制性CTL细胞优势抗原表位;菌落PCR阳性鉴定及Western blot鉴定结果显示成功构建重组质粒p ET-32a-PE22,经IPTG诱导含重组质粒p ET-32a-PE22的BL-21菌株,获得以包涵体形式表达的PE22蛋白。2.PE22蛋白对MS表型的影响:成功构建异源表达PE22蛋白的重组菌株MS-PE22,通过比较MS-vec、MS-PE22的生长及菌落形态发现,表达PE22蛋白对重组菌株的生长速率、菌落形态及生物膜形成无明显影响(P>0.05),比较MS-vec、MS-PE22在孔雀绿、低p H、饥饿、H_2O_2、溶菌酶、Na NO_2、SDS等不同生存压力下的耐受性发现,表达PE22蛋白可增强MS对H_2O_2的耐受性(P<0.05),但不改变其在孔雀绿、低p H、饥饿、溶菌酶、Na NO_2、SDS等压力条件下的耐受性(P>0.05)。3.PE22蛋白对巨噬细胞ANA-1功能的影响:抗酸染色法观察重组菌侵染细胞表明,重组菌株MS-vec及MS-PE22成功侵染ANA-1细胞,CCK8法检测不同侵染比的重组菌株侵染ANA-1后细胞的增殖活力表明,MOI为10:1时不损伤细胞的活性。与MS-vec感染组相比,MS-PE22感染的ANA-1细胞凋亡率明显降低(P<0.05),NO(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)、IL-1β(P<0.05)及IL-12p40(P<0.05)分泌量明显增加,i NOS表达量明显增加(P<0.05),且NO、TNF-α与IL-1β分泌量可被NF-κB通路抑制剂明显抑制。比较MS-vec、MS-PE22的胞内存活率发现,MS-PE22的细胞内存活能力高于MS-vec。结论:1.PE22蛋白主要以包涵体形式表达,包含多个潜在的T、B细胞抗原表位,具有一定的免疫原性。2.PE22蛋白的异源表达可改变MS表型,增强菌株胞内生存能力,并通过促进ANA-1细胞分泌NO、TNF-α、IL-12p40、IL-1β、i NOS等免疫分子,调控巨噬细胞的免疫应答反应。

目的 探究钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂降低心力衰竭患者心房颤动的作用及其影响因素。方法 选取2018年5月到2021年5月安徽省妇幼保健院收治的200例心力衰竭患者为研究对象，根据病历记录上患者SGLT-2抑制剂的服用情况，将患者分为服用SGLT-2抑制剂组（n=100），未服用SGLT-2抑制剂组（n=100）。由医护人员收集患者的GSI-IX分子式相关资料，包括一般资料、体检报告及血清学检查情况。对比两组患者的心房颤动的发生率；并将服用SGLT-2抑制剂的患者是否发生心房颤动分为发生组（n=13）和未发生组（n=87），采用Logistic回归模型分析服用了SGLT-2抑制剂发生心房颤动的影响因素。Biomaterials based scaffolds结果 服用SGLT-2抑制剂的AF发生率明显低于未服用SGLT-2抑制剂组，差异有统计学意义（t=4.678,P<0.05）。单因素分析结果显示，左心房内径、NT-proBNP水平是发生心房颤动的影响因素（OR=1.043,1.069,P<0.05）；多因素Logistic分析结果显示，左心房内径变化量小、NT-proBNP水平高是服用SGLT-2抑制剂患者发生心房颤动的独立危险因素。结论 服用SGLT-2抑制剂患者发生心房颤动与左心房内径、NT-proBNP水平有关，心力衰竭患者通GDC-0973溶解度过服用SGLT-2抑制剂可有效降低心房颤动发生率。

20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)是蜜蜂变态发育的重要激素,20E的脉冲式分泌推动了发育阶段的进展。20E与蜕皮激素受体(Ecdysone receptor,ECR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)组成的异源二聚体结合形成20E/ECR/USP复合物,该复合物与蜕皮激素反应元件(Ecdysone response elements,ECREs)结合,激活其下游转录因子,启动变态过程。除了20E外,胰岛素(Insulin)是调控昆虫变态发育的另一重要激素。有研究发现20E通过上调胰岛素信号途径的负调控因子FoxO的转录活性并诱导其入核以拮抗胰岛素信号,从而促进昆虫蜕皮和变态并抑制生长。已有研究表明蜜蜂体内20E滴度的周期性变化调控蜜蜂的不同发育阶段和组织形态,核受体ECR和转录因子FoxO参与non-oxidative ethanol biotransformation调控昆虫变态发育。然而,关于20E如何调控意大利蜜蜂幼虫变态化蛹的研究相对较少,其中ECR和FoxO在20E调控工蜂幼虫变态化蛹中的作用机制也尚不清楚。本研究以意大利蜜蜂幼虫为研究对象,通过使蜜蜂幼虫采食添加外源20E的日粮,观察工蜂幼虫采食量、化蛹表型及化蛹时间等,并采用组织形态学、分子生物学和代谢组学等技术,探究20E对工蜂幼虫生长发育、化蛹进程、血淋巴代谢和脂肪体重塑的影响;利用RNA干扰技术,对6日龄(6 d)工蜂幼虫进行ECR和FoxO敲除,采用组织形态学、免疫化学和脂质组学等技术,探究ECR和FoxO敲低对工蜂幼虫化蛹进程、20E信号、血淋巴糖代谢及脂肪体重塑的影响,以期阐明核受体ECR和转录因子FoxO在20E调控工蜂幼虫化蛹中的作用机制,其研究结果如下:1.20-羟基蜕皮酮对工蜂幼虫化蛹及血淋巴糖代谢的影响从意大利蜜蜂蜂群中移取960只1 d工蜂幼虫置于提前放好基础日粮的24孔细胞培养板中,随机分为2组(5个重复/组,96只/重复),一组为对照组,另一组为试验组。将20E溶于无水乙醇,以制备50 mg/m L的20E储备液。用林格氏液将20E稀释至10mg/m L作为20E工作液。对照组饲喂在基础日粮中添加相同剂量无水乙醇的日粮,试验组在基础日粮中添加浓度最终为0.1 mg/m L 20E,饲喂至对照组幼虫达到化蛹体重(160～180 mg),继续STM2457分子量置于培养箱中直到羽化出房,观察并记录各组幼虫的化蛹率和羽化率并采集幼虫样本进行相关指标测定。结果显示:1)饲喂外源20E后,幼虫采食量、化蛹时间、新蜂体重和体长均显著减少(P<0.05),表明20E抑制幼虫采食、缩短幼虫化蛹时间并导致幼虫体型变小。2)饲喂外源20E显著增加幼虫20E滴度以及20E信号关键基因,包括ECR、USP、HR3、E75和Br-c的表达水平(P<0.05)。3)添加外源20E促进幼虫脂肪体细胞解离,显著降低了幼虫脂肪体甘油三酯(Triglyceride,TG)的水平、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coa carboxylase,ACC)活性(P<0.05),而显著增加了脂肪酶(Lipase)的活性,表明20E促进幼虫脂肪体脂解。4)饲喂外源20E后6 d幼虫脂肪体溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP活性以及ATG5蛋白水平均显著增加(P<0.05),表明20E促进幼虫脂肪体自噬。5)通过血淋巴代谢组学数据分析,筛选出205个差异代谢物,其中D-葡萄糖、UDP-半乳糖和D-(+)-蔗糖的含量均显著上调。KEGG途径富集分析结果显示,这些差异代谢物主要富集在糖酵解/糖异生和半乳糖代谢。6)饲喂外源20E显著增加了幼虫血淋巴中蔗糖、葡萄糖和半乳糖水平(P<0.05),而脂肪体的糖原水平和糖原颗粒的数量却显著降低(P<0.05)。Gs、Hk和Pk的m RNA水平在20E处理后都显著降低(P<0.05),而Pepck、Gp和Pgm的m RNA水平显著升高(P<0.05),表明20E提高幼虫血淋巴葡萄糖水平并调节糖代谢。7)20E处理后6 d和7 d幼虫脂肪体中FoxO蛋白水平和核定位显著增加(P<0.05),而FoxO和Akt的磷酸化水平显著降低(P<0.05),表明20E诱导FoxO转录活性拮抗胰岛素信号。以上结果表明,工蜂幼虫日粮中添加外源20E抑制幼虫采AM-2282半抑制浓度食,缩短幼虫化蛹时间,提高幼虫血淋巴20E滴度和ECR等20E信号途径关键基因的表达,诱导脂肪体自噬和脂解以促进脂肪体重塑,上调FoxO转录活性拮抗胰岛素信号,提高血淋巴葡萄糖水平并影响幼虫体内糖代谢,最终促进工蜂幼虫至蛹的变态并导致蜜蜂体型变小。2.核受体ECR响应20-羟基蜕皮酮促进工蜂幼虫化蛹的分子机制试验选取一批6 d工蜂幼虫,平均分为两组,一组(试验组)注射ds ECR,每只注射10μg,另一组(对照组)注射ds GFP,每只注射10μg。在注射ds RNA 24 h后取样并测定相关指标。另外对RNA干扰后的化蛹表型及化蛹时间进行统计分析。试验结果显示:1)ECR敲低显著增加了工蜂幼虫的化蛹时间(P<0.05),显著降低了幼虫血淋巴20E滴度(P<0.05)。2)与ds GFP+20E组相比,ds ECR+20E组幼虫ECR、USP、HR3、E75、E93和Br-c的表达水平均显著降低(P<0.05)。3)ECR敲低后幼虫血淋巴中葡萄糖水平显著下降,而脂肪体糖原的水平却显著增加(P<0.05)。ECR敲低也显著降低了Pepck、Pgm和Gp的表达水平(P<0.05),而显著增加了Hk、Gs和Pk的表达水平(P<0.05)。4)与注射ds GFP相比,注射ds ECR 24 h后,幼虫体内PI3k、Akt、In R和Ins的m RNA水平显著增加,而FoxO和PTEN的表达水平显著降低(P<0.05)。5)与ds GFP+20E处理的幼虫相比,ds ECR+20E处理的幼虫Caspase-3信号、Caspase-3活性和TUNEL染色均显著降低(P<0.05)。以上结果表明,ECR转录调节与20E生物合成和20E触发的转录级联关键基因的表达来调控工蜂幼虫化蛹进程。ECR上调FoxO和PTEN的表达水平抑制胰岛素信号,提高幼虫血淋巴葡萄糖水平。ECR介导20E上调凋亡基因表达,诱导脂肪体细胞凋亡,从而加速工蜂幼虫化蛹过程中脂肪体重塑。3.FoxO在20-羟基蜕皮酮促进工蜂幼虫化蛹中的功能解析选取一批6 d工蜂幼虫,平均分为两组,一组(对照组)注射ds GFP,每只注射10μg。另一组(试验组)注射ds FoxO,每只注射10μg。在注射ds RNA 24 h后取样以进行后续相关指标的测定。另外对RNA干扰后的幼虫化蛹表型及化蛹时间进行统计分析。试验结果显示:1)FoxO敲低的幼虫出现延迟化蛹的现象,其体内20E滴度和20E信号途径关键基因的转录水平,包括ECR、E74、E75、E93和Br-c,均显著降低(P<0.05)。2)注射ds FoxO的幼虫脂肪体中脂滴的大小和数量、TG的含量、FAS和ACC活性均显著增加,而Lipase活性显著降低(P<0.05)。3)注射3-MA后幼虫溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP的活性以及LC3-II的表达均显著降低(P<0.05)。4)注射3-MA的幼虫脂肪体中脂滴的大小和数量以及TG含量均显著增加(P<0.05),而lipase-1,lipase-2和akhr表达水平均显著降低(P<0.05)。5)FoxO敲低的幼虫脂肪体溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP活性以及ATG5蛋白水平均显著降低(P<0.05)。以上结果表明,FoxO通过调控20E生物合成和20E信号途径关键基因的表达参与20E诱导的变态化蛹过程。FoxO诱导脂肪体自噬和脂解,从而促进工蜂幼虫变态化蛹过程中的脂肪体重塑。综上所述,20E在工蜂幼虫至蛹的转变过程中发挥重要作用;添加外源20E抑制工蜂幼虫采食,缩短幼虫化蛹时间,影响幼虫血淋巴代谢平衡,从而加速工蜂幼虫至蛹的变态过程并导致蜜蜂体型变小;20E通过ECR上调FoxO转录活性拮抗胰岛素信号,提高幼虫血淋巴葡萄糖水平并促进脂肪体重塑,最终促进工蜂幼虫至蛹的变态。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居我国女性恶性肿瘤之首,严重威胁着广大女性的身心健康。以阿霉素为代表的蒽环类药物是乳腺癌治疗的一线药物,虽然对于乳腺癌的治疗有一定的效果,但是因为其耐药性,仍会出现肿瘤的复发、转移,这也是导致化疗失败的重要原因。中期因子(Midkine,MK)是一种肝素结合生长因子,在妊娠中期高度表达。MK具有多种生物学功能,促进血管的生成、神经元的生长、炎症修复等。作为分泌型生长因子,在多种实体瘤的血清中高度表达,并参与肿瘤的发生与生长,与肿瘤的预后显著相关,这些表明MK可能是治疗癌症的候选分子靶标。此外研究发现,在肿瘤中高表达的MK能够增强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性,这提示MK与肿瘤耐药有关。因此,本研究探讨MK对人乳腺癌细胞阿霉素敏感性的影响,为乳腺癌阿霉素耐药患者的临床治疗提供新的思路。本实验通过合成MK基因并构建表达载体,筛选出阳性重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导MK蛋白表达,并对表达条件进行优化,按照最佳条件进行培养,用镍柱对融合蛋白SUMO-MK进行纯化,经SUMO蛋白酶酶切后再次使用镍柱纯化获得无标签的MK蛋白并作用于细胞来确定其活性,通过外源性蛋白MK刺激阿霉素作用的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞以及沉默MK后对阿霉素作用的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的影响。具体的研究内容如下:(1)根据大肠杆菌密码子使用偏好性对MK基因序列优化,构建p ET30a-MK质粒,对p ET28a-SUMO和p ET30a-MK进行Nde I和Bam HI双酶切,通过T4连接酶连接,构建原核表达载体p ET28a-SUMO-MK,分别转化DH5α和BL21(DE3Belumosudil半抑制浓度)感受态细胞中,通过PCR,酶切和测序鉴定,大小和序列正确,诱导表达的融合蛋白在29KDa处存在条带与预期相符,且蛋白为可溶性表达。(2)利用Box-Behnken实验设计原理以温度、诱导剂浓度、诱导时间、溶氧量为考察因素,融合蛋白SUMO-MK的含量占总蛋白含量的百分比值为响应值,对诱导条件进行优化,根据实际操作融合蛋白SUMO-MK在装液量为30%,OD_(600)值为0.6-0.8时,终浓度为0.4m M的IPTG在36℃的条件下诱导5h。(3)用镍柱在不同浓度的咪唑对融合蛋白SUMO-MK进行洗脱,在250m M浓度的咪唑条件下可将融合蛋白洗脱下来。经SUMO蛋白酶酶切后,再次经镍柱纯化,收集流穿,经Western blot验证,所得到的流穿即为MK蛋白溶液。通过细胞增殖和划痕实验验证了MK蛋白的生物学活性。(4)梯度浓度的阿霉素作用的MCF-7、MDA-MB-231细胞中加入自制纯化的MK蛋白,MTT实验结果显示,MK刺激的给药组较单给药组存活率提高(P<0.05,P<0.05),且IC_(50)值也增加;在阿霉素作用MCF-7、MDA-MB-231细胞的同时加入梯度浓度MK,流Farmed sea bass式结果表明,不同浓度的MK刺激后,凋亡率随MK浓度升高而降低(P<0.001,P<0.001),MK蛋白抑制细胞凋亡具有浓度依赖性。(5)利用MK干扰质粒,将sh-NC、sh-MK-1、sh-MK-2转染MCF-7、MDA-MB-231细胞,在转染24h后,通过q RT-PCR法和Western blot法结果表明sh-MK-2的干扰效率最好。MTT结果表明获悉更多,沉默MK的表达后,MCF-7、MDA-MB-231细胞的存活率明显比单给药组降低(P<0.05,P<0.05),IC_(50)值降低;流式结果表明,沉默MK的表达后,在阿霉素的作用后MCF-7、MDA-MB-231细胞的凋亡率增加(P<0.001,P<0.001);Western blot法检测凋亡蛋白Cleaved PARP的表达,结果表明,在沉默MK表达的MCF-7、MDA-MB-231细胞,加入阿霉素作用后Cleaved PARP的表达量明显增加(P<0.01,P<0.01)。综上所述,本研究成功构建重组表达质粒p ET28a-SUMO-MK,通过对其表达条件的优化,提高了融合蛋白的表达量,经纯化后获得成熟的MK蛋白。通过探讨MK对乳腺癌阿霉素敏感性的相关实验表明,MK能够提高乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的存活率,在细胞内沉默MK的表达促进阿霉素作用乳腺癌细胞的凋亡,增加乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性,为后续研究乳腺癌耐药机制及乳腺癌的临床治疗奠定基础。