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研究背景:胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常见的富有侵袭性的胰腺恶性肿瘤,占胰腺癌病例的90%以上,俗称“癌中之王”,死亡率极高,其5年生存率仅11%左右。PDAC的主要治疗手段包括手术切除、辅助化疗(adjuvant chemotherapy,ACT)和免疫治疗。但是,大部分PDAC患者对此类治疗的总体响应率仍然很低。因此,深入探究PDACResponse biomarkers的肿瘤生物学机制,开发潜在的有效诊断和治疗方案仍是根治PDAC的重要任务。蛋白质的异常糖基化涉及PDAC的多种病理和病理生理变化,包括但不限于赋予肿瘤抵抗细胞死亡的能力。糖基化是一种广泛存在的蛋白翻译后修饰方式(posttranslational modification,PTM),在稳定蛋白质结构、引导蛋白质正确定位、辅助分子伴侣二聚化等方面发挥重要作用。最新的研究表明,蛋白质的异常糖基化可病理性重塑肿瘤分子生物学进程,增强肿瘤细胞对死亡信号的抵抗。铁死亡是一种新型的非调节性细胞死亡形式,其特征是铁离子依赖的膜脂质过氧化物毒性堆积导致细胞膜破裂,是治疗恶性肿瘤的新的有效手段。在铁死亡的抗氧化系统中,谷氨酸/胱氨酸逆向转运体system Xc-的研究最为广泛,其由重链亚基4F2hc(也称为CD98hc,由SLC3A2基因编码)和轻链亚基xCT(由SLC7A11基因编码)组装而成,负责介导胞内半胱氨酸合成和抗氧化系统的建立。目前围绕xCT的研究较为广泛,但忽视了 4F2hc是xCT细胞膜定位和功能发挥的重要前提条件之一。糖基化和铁死亡是肿瘤代谢异常的重要生物学现象,可为癌症治疗提供新的干预措施。然而,目前尚不明确糖基化和铁死亡二者之间的相互关系,以及是否靶向糖基化途径可增强PDAC对铁死亡的敏感。研究方法:1.利用N-和O-糖基化蛋白质组学,揭示PDAC细胞铁死亡过程中糖基化修饰的改变和具体修饰类型,明确PDAC细胞铁死亡中糖蛋白和糖肽的差异表达变化,鉴定与铁死亡调节相关的重要糖蛋白。2.采用N-糖苷酶(PNGase F)(一种重组糖苷酶主要用于移出多肽链上天冬酰胺连接的寡糖)或使用蛋白N-糖基化抑制剂衣霉素(tunicamycin,TM),明确目标糖蛋白的主要修饰类型。3.利用RNA-seq技术,探究PDAC细胞铁死亡中糖基化转移酶的表达变化,明确与铁死亡调节相关的糖基化转移酶,鉴定潜在的与目标糖蛋白修饰相关的差异表达糖基化转移酶。4.利用291例PDAC患者的组织样本及对应的临床病理及预后信息,探究糖蛋白4F2hc和糖基化转移酶B3GNT3在PDAC组织中的表达及临床预后意义。5.采用慢病毒介导的基因稳定敲降技术,探究4F2hc在PDAC细胞铁死亡中的具体作用,明确4F2hc的N-糖基化修饰对PDAC细胞铁死亡的影响。6.采用慢病毒包装的CRISPR-cas9介导的基因敲除技术,探究B3GNT3在PDAC细胞铁死亡中的具体作用,明确B3GNT3的糖基化转移酶活性对PDAC细胞铁死亡的影响。7.采用氨基酸位点突变、片段截短、分子动力学模拟、DynaMut、PredyFlexy、免疫荧光、流式分析、放线菌酮追踪等方法,探究N-糖基化修饰和B3GNT3的糖基转移酶活性对4F2hc蛋白稳定性的影响,探究抑制4F2hc的N-糖基化对其分子伴侣xCT的细胞膜定位、表达及功能发挥的影响。8.通过建立裸鼠PDAC皮下及原位移植瘤模型,探究4F2hc和B3GNT3对PDAC体内增殖活性的影响,联合铁死亡诱导剂IKE或蛋白N-糖基化抑制剂衣霉素探究对SLC3A2敲降介导的PDAC体内抑制效果。研究结果:1.N-糖基化修饰在PDAC铁死亡中应激性上调,差异糖蛋白4F2hc的天冬酰胺(N)-糖基化修饰参与PDAC细胞铁死亡。2.N-糖基化修饰是内源性4F2hc蛋白的主要转录后翻译修饰方式,糖基化S63845抑制剂转移酶B3GNT3是4F2hc的重要结合蛋白,参与4F2hc的N-糖基化修饰。3.4F2hc和B3GNT3在PDAC细胞和临床肿瘤组织中高表达,4F2hc和B3GNT3的高表达与PDAC患者的进展和较差的临床预后正相关。4.机制上,基因敲降SLC3A2或阻断4F2hc的N-糖基化可导致system Xc-活性受损(表现为脂质过氧化物的增加),促进PDAC细胞对铁死亡敏感。在shSLC3A2 PANC-1和MIAPaCa-2细胞中,重组野生型的4F2hc增强PDAC细胞对铁死亡抗性。而重组4F2hc的N-糖基化位点突变体N365Q和4NQ不能逆转RSL3诱导的细胞活力下降,反而增强shSLC3A2 PTaurine抑制剂ANC-1和MIAPaCa-2细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感。5.基因敲低或敲除B3GNT3促进PDAC细胞对铁死亡的敏感。重组B3GNT3糖基化转移酶酶活性过表达质粒122-311OE部分恢复RSL3导致的B3GNT3KO PANC-1和MIAPaCa-2的细胞活力下降,而重组B3GNT3糖基化转移酶缺失片段122-311del则无法逆转。6.敲除B3GNT3加速4F2hc的蛋白衰减,降低4F2hc的细胞膜定位及4F2hc与xCT的相互作用;无论是突变4F2hc的N-糖基化修饰位点,还是使用衣霉素去除4F2hc的N-糖原结构,皆明显降低4F2hc蛋白的吉布斯自由能(ΔΔG),导致4F2hc蛋白稳定性下降,细胞膜定位减少,削弱4F2hc与xCT的相互作用。7.蛋白N-糖基化抑制剂TM显著增强铁死亡诱导剂IKE和RSL3诱导的PDAC细胞脂质过氧化和铁死亡的发生。8.在体内研究中,敲除B3GNT3显著抑制PANC-1细胞的皮下和原位移植瘤生长。基因敲减SLC3A2或联合铁死亡诱导剂IKE或TM显著抑制原位PDAC的生长。研究结论:1.N-糖基化修饰参与PDAC铁死亡进程。2.糖基化转移酶B3GNT3介导的4F2hc的N-糖基化修饰影响PDAC细胞对铁死亡的敏感性。3.靶向干预B3GNT3-4F2hc-N-糖基化修饰途径,可导致4F2hc蛋白稳定性下降,细胞膜定位减少,破坏4F2hc与xCT的相互作用,促进PDAC细胞对铁死亡敏感。4.4F2hc和B3GNT3在PDAC中高表达预示患者临床预后较差,靶向抑制二者的表达可有效降低PDAC在体外和体内的细胞生物学活性。研究意义1.有望从糖基化修饰的新角度,揭示铁死亡在肿瘤研究中的新机制。2.整合N-/O-糖基化蛋白质组学和转录组学,有望解析肿瘤细胞铁死亡过程中糖基化修饰图谱的变化。3.通过筛选并鉴定铁死亡调节通路中的差异糖蛋白和糖基化修饰位点,为铁死亡的响应提供潜在的生物标志物,为基于铁死亡策略治疗恶性肿瘤提供新的干预靶点。4.为临床前研究联合糖基化抑制剂和铁死亡诱导剂对恶性肿瘤的治疗提供实验基础。5.基于本课题新发现的B3GNT3-4F2hc-N-糖基化修饰轴在PDAC铁死亡中的调节作用,为拓展和开发新的肿瘤干预靶点和治疗策略提供重要研究思路。

2-甲基-4-氯苯氧乙酸(2-methyl-4-chloro-phenoxyacet IC acid,MCPA),简称2-甲-4-氯,是一种广泛使用的激素型内吸性苯氧羧酸类除草剂,其在土壤中残留时间较长,通常对后茬作物、地表水存在严重污染,同时对人体也有一定毒害作用。目前应用于食品中2-甲-4-氯残留量的分析检测方法均基于色谱技术,该方法检测周期长、设备要求高、操作繁琐。本研究以增长连接臂的化学修饰途径合成了2-甲-4-氯半抗原衍生物,并通过碳化二亚胺法对其偶联载体蛋白制备得到2-甲-4-氯全抗原;在此基础上,基于杂交瘤技术制备针对2-甲-4-氯的单克隆抗体,并将其作为关键元件开展了2-甲-4-氯的免疫层析试纸条的研究,取得的主要研究结果如下:(1)本研究基于不同的途径,合成三种具有不同连接臂结构的2-甲-4-氯半抗原衍生物M1、M2、M3,采用四极杆飞行时间质谱仪其进行表征,结果显示半抗原M1、M3的分子量分别为283.9946、226.98Entinostat NMR11,与设计的半抗原衍生物的分子量基本一致,同时采用傅里叶红外吸收光谱测定半抗原M2,其红外吸收特征波长为1750-1735 CM~(-1)和3300-2500 CM~(-1),证明成功引入C=O键和O-H键。在此基础上采用EDC/NHS方法制备了三种基于2-甲-4-氯的全抗原,采用全波长紫外分光光度仪对其进行表征,三种全抗原均在280 nm处具有较强的吸收峰且保留了其半抗原衍生物的特定吸收峰,表明全抗原合确认细节成构建成功,为后期单克抗体制备及其免疫分析方法的建立提供了基础。(2)在单克隆抗体制备研究中,M1-BSA作为免疫原,经杂交瘤技术最终获得10株抗2-甲-4-氯单克隆抗体,分别命名为:5B9、5B11、5D3、5G9、10E1、5F8、10C7、5D8、5D11、10F8。经抗体亚型鉴定,5F8、10C7、5D8和5D11株抗体的亚型为Ig G2b,5B9、5B11、5D3、5G9、10E1和10F8株抗体的亚型为Ig G1,10株抗体的轻链类型均为Ig?。对10E1和10F8抗体杂交瘤细胞株进行抗体基因序列测定,获取了抗体的氨基酸列及组成结构信息。M2-OVA作为检测抗原,基于抗体10E1、5B11、5D3、10F8的2-甲-4-氯抗原(标品浓度100 ng/m L)抑制率分别为85%、84%、82%、81%。建立基于所获10株单克隆抗体的2-甲-4-氯竞争抑制标准曲线,结果显示,其IC_(50)值的范围在19.9～97.24 ng/m L,其中10E1、5F8抗体体现出的灵敏度最高,其IC_(50)值均为19.9 ng/m L,线性检测范围为3.9～125 ng/m L。经交叉反应率测定,10株抗体对2-甲-4-氯及其同系物2,4-D,2,4-D丁酸均体现理想阻断效果,其中10E1、5B11、5G9、5B9、5D8基于2,4-D的交叉反应率大于100%,5B9对2,4-D丁酸的交叉反应率为263.51%,5G9对2,4-D的交叉反应率也达到268.11%,表明所获抗体是针对2-甲-4-氯结构类似物的一种广谱性抗体。(3)在胶体金免疫层析试纸条的研究中,基于柠檬酸三钠还原法制备得胶体金颗粒,经紫外吸收光谱进行表征,结果显示吸收峰在518 nm处,符合胶体金目标粒径的特征吸收峰。在此基础上通过金硫键使其与抗体实现偶联,经偶联条件优化,0.1 M K_2CODMARDs (biologic)_3的最佳体积为3μL、抗体最佳投入量为6μg。经胶体金免疫层析试纸条的检测条件优化,T线包被浓度为2.5 mg/m L、探针添加量为2μL。结果显示,本研究建立的胶体金免疫层析试纸条能实现对大麦中2-甲-4-氯的检测,最低检出限(v LOD)值为78 ng/m L,消线值为313 ng/m L。基于该检测体系测得大麦添加样品中2-甲-4-氯的加标回收范围为82.2～101.1%,为后期食品中2-甲-4-氯的快速检测提供了前期工作基础。

目的 基于颈部淋巴结的超声特征，构建并对比不同机器学习模型诊断淋巴瘤的性能。方法 纳入颈部淋巴结肿大患者714例，按7∶3将患者随机分为建模队列和验证队列。结合临床数据(年龄、性别和肿瘤史)和淋巴结的超声特征，构建K近邻算法(KNN)、支持向量机(SVM)、决策树(DT)、反向传播算法神经网络(BP)及随机森林(RF)模型。通过计算受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)、准确度、精准度、召回率、F1-score及Brier-score等指标比较模型诊断效能。结果 KNN模型和RF模型的AUC在训练集中比较高，分别为0.853 1和0.867 4;在验证集中下降为0.698 1和0.662 9。在验证集中，DT模型和SVM模型的AUC(分别为0.758 6和0.747 6)与精准度(分别为0.913 0和0.869 6)均比其他GSK1120212细胞培养3个模型高。同时，也相应高于训练集中的指标。DT模型最终纳PLX3397采购入了网格状回electrodialytic remediation声、淋巴门、血供模式、年龄和淋巴结短轴径5个变量。结论 网格状回声是淋巴瘤最重要的超声特征。与其他4种模型相比，DT模型诊断能力高，且具有更好的泛化能力和可解释性，可以在临床诊断颈部淋巴瘤中发挥重要作用。

目的:基于免疫原性细胞死亡相关基因为宫颈癌患者构建预后模型。方法:以肿瘤基因组图谱(Tumor Genome Atlas,TCGA)宫颈癌患者样本数据为基础,采用LASSO和COX回归方法获得免疫原性细胞死亡预后基因(IPGs),构建IPGs评分体系,将患者分为高、低风险两组,以GEO数据集为验证组。通过Kaplan-Meier分析、ROC分析、单因素和多因素变量Cox回归分析探讨风险评分对预后的作用。此外,我们将风险评分与肿瘤微环境中的免疫特征相关联,包括肿瘤微环境、肿瘤浸润免疫细胞、免疫治疗。并对高低风险组进行肿瘤突变负荷及化疗药物敏感性的差异分析。通过Cox回归筛选出IPGs中风险比(Hazard Ratio,HR)最高的关键基因PDIA3,随后通过蛋白质印迹法、免疫荧光法、组织微阵列验证其在宫颈癌中的表达及其对患者预后的影响。结果:免疫原性死亡预后模型显示出良好的预测能力。Cox回归筛选出4种与预后相关IPGs(PDIA3、CASP8、IL1和LY96)构建预后模型,在TCGA队列中高表达与CESC患者不良预后呈正相关,能作为宫颈癌的独立预测指标(HR=1.058,P<0.01),并在GEO得到进一步的验证。我们通过结合临床特征和IPGs特征构建了一个临床列线图,预测宫颈癌患者的生存可能性。校准曲线证实了列线图预测与实际之间的良好一致性。高风险组肿瘤微环境评分和免疫细胞浸润程度均低于低风险组,富集发现多为免疫信号通路。在TIDE,MDSC和CAF评分中高风险组低于低风险组,说明高风险组可能抑制了机体的免疫效应,IPGs高表达患者的免疫效果更差,并且常用化疗药物在高风险组患者中敏感性均较低。根据aortic arch pathologies蛋白质印迹与免疫荧光发现关键基因PDIA3在宫颈癌组织中高表达,组织微阵列差异分析表明PDIA3与患者预后不ZD1839作用良相关。结论:本研究基于4个IPGs探讨宫颈癌预后与免疫原性死亡的关系。通过探讨其生物行为特征和临床因素,结果表明IPGs风险评分可作为宫颈癌患者预后和免疫疗效的生物标志物,并为早期肿瘤筛查提供策略基础。其中AG-221体外关键基因PDIA3也具有重要的预后价值。因此我们可以通过靶向治疗,影响免疫原性死亡在肿瘤免疫调节方面的强大作用,这将为宫颈癌患者的治疗提供新思路。

研究目的:肾结石的发病率逐年增长,目前已经成为全世界最多发的泌尿系疾病之一。肾结石导致慢性肾脏病、全因死亡等风险增加给全球卫生系统造成了沉重负担。草酸钙结石是肾结石的主要成分,结石在形成过程中会造成复杂的肾脏损伤,但对其内在细胞和分子机制的研究尚不明确,临床实践中也尚无有效的靶向预防和治疗药物。单细胞转录组测序技术具有高分辨率、高通量的优势,可以系统地检测组织中单个细胞的基因表达情况。该技术在结晶肾病领域的应用将有助于研究者深入了解疾病变化细胞图谱,并为针对性地为临床干预提供有价值的线索。研究方法:建立乙醛酸盐诱导结晶肾损伤小鼠模型,使用单细胞转录组测序技术,于给药第0、1、4、7天获取肾脏单细胞转录组数据,总计获得了约4万个高质量的肾脏细胞的基因表达谱数据。将单细胞基因表达矩阵导入Seurat包后,我们进行了质控、标准化、降维、聚类分群并进行了生物学注释。利用在线数据库我们检索获得了相同模型的肾脏转录组数据,使用反卷积算法探索结晶损伤后肾脏免疫细胞的浸润变化,和本研究的单细胞测序分析结果互相验证。使用Cell Chat分析软件,我们探索了结晶肾损伤发生发展过程中不同细胞类型间的相互通讯作用。根据分析结果,我们着眼于具有潜在修复功能的巨噬细胞和增殖、损伤肾小管上皮细胞间的细胞通讯变化,利用外源性补充或中和抗体清除的办法,设计了体内、体外实验对特定细胞通讯在结晶肾损伤进展中的作用进行验证。利用已经发表的肾脏单核吞噬细胞的单细胞转录组测序数据,我们对肾损伤后巨噬细胞的表型和功能变化进行了验SCH727965化学结构证。通过SCENIC转录因子富集分析软件,我们探索了诱导巨噬细胞表型转化的转录调控机制。利用在线数据集的表达验证以及设计体外实验,我们对该调控机制进行了初步验证。结果:我们在单细胞转录组数据中鉴定出了15个不同的肾脏细胞类型。其中发现随着结晶肾损伤的进展,处于损伤状态的肾小管上皮细胞比例不断升高,同时具有增殖特性的肾小管上皮细胞比例也不断升高。通过拟时序分析,我们发现了损伤的肾小管上皮细胞向增殖肾小管上皮细胞的状态变化。同时在髓系细胞亚群中,我们发现一群特异性表达经典M2型巨噬细胞标志物Mrc1的巨噬细胞比例随疾病进展不断升高。同时该群细胞特异性地高表达细胞生长因子Igf1。在细胞通讯分析中我们发现由该群巨噬细胞主导了向增殖和损伤肾小管上皮细胞的IGF信号,该信号随着疾病进展也不断增强,很有可能是参与损伤后机体自我修复的重要Enasidenib纯度机制之一。通过体内外实验,我们验证了IGF1的补充确实可以通过促进肾小管上皮细胞增殖从而减轻结晶肾损伤,而使用IGF1中和抗体对其进行清除,将减少结晶肾损伤后增殖的肾小管上皮细胞数量,并导致结晶肾损伤的进一步恶化。该效应通过激活肾小管上皮细胞内Akt/RB信号通路得以实现。SCENIC转录因子富集分析鉴定了在Mrc1~+Igf1~+巨噬细胞特异性富集的转录因子Mafb。利用转录因子在线数据库JASPAR和敲除Mafb的在线数据集,我们验证了Mafb对Igf1的转录调控作用。结合细胞通讯分析结果以及体外诱导巨噬细胞表型转变的实验结果,我们推测损伤的肾小管上皮细胞释放GDF15信号诱导了Mrc1~+Igf1~+巨噬细胞表型的形成。在线数据集和体外实验验证了GDF15对Mafb、Mrc1、Igf1的表达调控关系。结论:通过单细胞转录组测序并结合已发表数据的联合分析,我们全面解析了结晶肾损伤发生发展过程中的细胞和分子变化图谱。发现结晶肾损伤后募集在肾脏的髓系细胞具有高度的异质性和可塑性,鉴定并验证了来自Mrc1+巨噬细胞的IGF1信号对损伤后肾脏修复的重要作用。同时我们burn infection发现损伤的肾小管上皮细胞释放大量的GDF15通过影响巨噬细胞转录因子Mafb的表达水平,传导了诱导巨噬细胞向Mrc1~+Igf1~+巨噬细胞转化的信号。研究结果为未来干预、治疗结晶肾损伤及其他类型的肾损伤疾病提供了有价值的研究靶点。

目的:回顾性研究多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)患者的中医证型分布规律,探讨骨髓瘤常见的高危预后因素(肌酐升高、髓外病变、ISSⅢ期、高危细胞遗传学异常)与中医证型之间的相关性,并基于统计获得的与MM高危预后因素相关性较强的证型因素结果,应用网络药理学相关数据库及方法进一步探讨血液病科治疗MM肾精亏虚、邪毒痹阻经络基本病机的补肾活血通络方治疗MM潜在作用机制。方法:1.回顾性分析血液科MM患者的临床资料,根据纳排标准最终纳入121例患者,对纳入的患者进行中医辨证分型。2.分析MM患者的性别、年龄等一般临床特点以及常见的高危预后因素(肌酐、髓外病变、ISS分期Ⅲ期、高危细胞遗传学异常)与中医证型之间的相关性。3.通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、中草药分子机理分析的中药综合数据库(TCMID)获取补off-label medications肾活血通络方所含中药的药物活性成分及靶点;通过TTD数据selleckchem MLN4924库、GeneCards数据库及OMIM数据库获取MM疾病靶点;借助Cytoscape3.7.2构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图;通过Venny2.1.0平台对中药药物靶点与疾病靶点取交集并绘制韦恩图;将得到的常见基因靶点应用STRING11.0平台建立蛋白互作(PPI)网路;使用CytoNCA对PPI网络进行拓扑分析,筛选补肾活血通络方治疗多发性骨髓瘤的核心靶点;利用R语言将核心靶点进行潜在基因本体生物学过程(GO)的通路富集分析并用GOplot软件包对富集结果进行可视化,使用metascape网站对京都基因与基因组百科全书(KEGG)的通路进行富集分析,利用微生信在线网络平台对KEGG富集通路进行可视化,解析补肾活血通络方治疗MM涉及的潜在通路及生物学进程。结果:1.MM患者中医证型分布基本特征:121例初诊的MM患者中,气血亏虚证28人(23.1%);肝肾阴虚证11人(9.1%);脾肾阳虚证30人(24.8%);痰瘀痹阻证52人(43.0%);男性64人(52.9%),女性57人(47.1%);人群年龄分布以60岁以上人群最多,为92人(76.03%),发病中位年龄67岁。2.经Kruskal-Wallis H秩和检验,肌酐水平与中医证型分布有相关性(H=45.510,P<0.001),脾肾阳虚证患者肌酐水平显著高于其他证型患者(P<0.001)。3.经Fisher精确检验,髓外病变与中医证型无相关性(χ2=5.866,P>0.05)。4.经Kruskal-Wallis H秩和检验,ISS分期与中医证型有相关性(H=18.460,P<0.001)进一步两两比较,肝肾阴虚证与气血亏虚证、肝肾阴虚证与脾肾阳虚证、痰瘀痹阻证与脾肾阳虚证间ISS分期存在统计学差异(P<0.05),其他证型间无统计学差异(P>0.05)。ISS Ⅲ期患者中脾肾阳虚证占比最高,显著高于肝肾阴虚证和痰瘀痹阻证患者。经Frequencies统计,ISS Ⅲ期中医证型分布由多到少依次是,脾肾阳虚证>痰瘀痹阻证>气血亏虚证>肝肾阴虚证,分别占39.3%、30.3%、28.6%、1.8%。5.经Fisher精确检验,高危细胞遗传学异常与中医证型无相关性(χ2TGF-beta/Smad抑制剂=5.273,P>0.05)。经Frequencies统计,lq扩增发生最多的证型是痰瘀痹阻证,其次是脾肾阳虚证,分别占34.8%、30.4%;IgH易位发生最多的证型是痰瘀痹阻证,其次是脾肾阳虚证,分别占38.9%、27.8%;del(17p)/TP53突变发生最多的证型是痰瘀痹阻和气血亏虚证,各占33.3%;“双打击”发生最多的证型是气血亏虚证,其次是痰瘀痹阻证和脾肾阳虚证,分别占33.3%、29.6%、29.6%;“三打击”发生率最高的证型是痰瘀痹阻证,占50%。6.经Frequencies统计,同时具备4项高危因素的患者,只有1例,其证型为脾肾阳虚证;同时具备3项高危因素的患者,其证型分布频次由高至低依次为:脾肾阳虚证>痰瘀痹阻证>气血两虚证>肝肾阴虚证,分别占比46.1%、30.7%、23.2%、0%;同时具备2项高危因素的患者,其证型分布频次由高至低依次:脾肾阳虚证>痰瘀痹阻证>气血两虚证>肝肾阴虚证,分别占比42.9%、35.7%、17.9%、3.5%。综上,具备高危因素最多的证型是脾肾阳虚证,该证型在同时发生4项、3项和2项高危因素的MM患者中分布最多;其次是痰瘀痹阻证,该证型在同时发生4项和3项高危因素MM患者中的分布仅次于脾肾阳虚证。7.网络药理学研究方面,获取补肾活血通络方活性成分342种,共获得315个靶点。MM共获得3341个靶点;获取306个药物疾病交集靶点,根据CytoNCA插件计算出的DC、BC、EC、CC值的数据,筛选出42个核心靶点,涉及 TP53、VEGFA、AKTl、PIK3CA、HSP90AA1、IL1B 等,KEGG 通路分析显示补肾活性通络方主要通过参与PI3K-Akt、JAK-STAT、TGF-β、IL-17等多条信号通路治疗MM。结论:该研究表明MM预后高危因素中肌酐、ISS分期与中医证型间存在相关性,髓外病变、高危细胞遗传学异常与中医证型间不存在相关性。同时具备MM预后高危因素最多的中医证型是脾肾阳虚证,其次是痰瘀痹阻证。通过应用网络药理学的方法研究发现治疗MM的补肾活血通络方通过调控TP53、VEGFA、AKT1、PIK3CA、HSP90AA1、IL1B 等靶点,作用于 PI3K-Akt、JAK-STAT、TGF-β、IL-17 等多条信号通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节、肿瘤免疫微环境调节介导炎症反应。本研究采用网络药理学方法研究了补肾活血通络方的潜在靶点与关键通路,但因时间限制等因素未对患者进行临床实验验证和靶点、通路的验证,以期下一步开展对补肾活血通络方的临床RCT研究,对MM患者进行临床验证、疗效评估,以及研究补肾活血通络方治疗MM患者前后的相关关键靶点、通路和基因的差异表达情况,深入的研究补肾活血通络方治疗MM的作用机制,提高疾病疗效,延长MM患者生存,改善生活质量。

目的探讨南通市开展“中国千县万镇卒中识别行动”前后区域脑卒中医疗服务流程的改进情况。方法采用多中心、前瞻性、干预性自身前后对照研究,分析“中国千县万镇卒中识别行动”开展前即2020年和开展后即2021年、2022年三年间南通市15家医院急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)住院患者发病4.5h、6h、24h内到院率,发病4.5h、14d内静脉溶栓率,发病6h、24h、14d内机械取栓率的变化。结果1.卒中识别行动前后15家医院AIS患者到院率的比较:与2020年相比,2021年发病4.5h(22.4%vs 16.8%,p<0.001)、6h(34.9%vs 27.0%,p<0.001)、24h(56.5%vs 47.2%,p<0.001)内的到院率显著提高;与2020年相比,2022年发病4.5h(23.4%vs 16.8%,p<0.001)、6h(29.2%vs 27.0%,p<0.001)、24h(66.5%vs 47.2%,p<0.001)内的到院率显著提高;而2022年发病4.5h(23.4%vs 22.4%,p<0.001)、24h(66.5%vs 56.5%,p<0.001)内的到院率较2021年显著提高。2.卒中识别行动前后15家医院AIS患者静脉溶栓率的比较:与2020年相比,2MRTX849体内021年发病4.5h(53.1%vs 46.0%,p<0.001)、14d(11.9%vs 7.7%,p<0.001)内的静脉溶栓率显著提高;与2020年相比,2022年发病4.5h(53.5%vs46.0%,p<0.001)、14 d(12.5%vs 7.7%,p<0.001)内的静脉溶栓率显著提高;而2022年发病4.5 h(53.5%vs 53.1%,p<0.001)、14 d内(12.5%vs 11.9%,p<0.001)的静脉溶栓率较2021年显著提高。3.卒中识别行动前后15家医院AIS患者机械取栓率的比较:与2020年相比,2021年发病6h(6.8%vs 3.5%,p<0.001)、24h(4.7%vs 2.0%,p<0.001)、14 d(2.6%vs 0.9%,p<0.001)内的机械取栓率显著提高;与2020年相比,2022年发病6h(7.4%vs 3.5%,p<0.001)、24h(4.6%vs 2.0%,p<0.001)、14d(3.1%vs 0.9%,p<0.001)内的机械取栓率显著提高;而2022年发病6h(7.4%vs 6.8%,p<0.001)、14d(3.1%vs 2.6%,p<0.001)内的机械取栓率较2021年显著提高。结论南通市开展千县万镇卒中识别行动有效改善了区域卒中患者救治流程,提高了AIS患者到院率、静脉溶栓率和机械取栓率,提升了区域卒中医疗服务能力。目的探讨AIS患者行静脉溶栓及血管内治疗的短期预后及影响因素,为临床寻找可控危险因素及预后判断提供理论依据。方法纳入2022年在南通市15家医院接受再灌注治疗并能完整提供资料的692例AIS患者为研究对象。收集基线资料,分别以三种标准来评估出院时的短期预后:1.根据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评分,出入院NIHSS评分差值≥4分为预后良好,差值<4分为预后不良;2.根据改良Rankin量表(Modified Rankin Scale,m RS)评分,m RS≤2分为预后良好,m RS>2分为预后不良;3.以无出血转化(hemorrhagic transformation,HT)定义为预后良好,有HT定义为预后不良。分别通过组间单因素及多因素logistic回归分析得出影响预后的相关指标,并绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)来确定对临床预后具有预测能力的指标。结果1.按照出入院NIHSS评分差值评估出院时的短期预后时,单因素分析结果表明:出入院NIHSS评分差值≥4分组和差值<4分组在年龄、高血压病、糖尿病、房颤史、TOAST分型方面差异具有统计学意义(p<0.05),将上述因素纳入多因素logistic回归分析,结果表明:年龄越大(OR=1.019,95%CI 1.004-1.035)、有高血压病史(OR=1.428,95%CI 1.034–1.971)、有房颤史(OR=1.882,95%CI 1.282–2.762)的患者发生出入院NIHSS评分差值<4分结局的风险显著提高。然而,在TOAST分型中,与大动脉粥样硬化型相比,小动脉闭塞型(OR:0.547,95%CI:0.370-0.807)和心源性栓塞型(OR:0.474,95%CI:0.304-0.738)发生出入院NIHSS评分差值<4分结局的风险显著降低。绘制ROC曲线,比较曲线下面积(Area under Gurvc,AUC),结果表明:在AIS患者再灌注治疗后出入院NIHSS评分差值<4分的预测能力方面,联合预测(AUC=0.620)优于年龄(AUC=0.585)、高血压病(AUC=0.561)、房颤史(AUC=0.558)。2.按照出院m RS评分AM-2282抑制剂评估出院时的短期预后时,单因素分析结果表明:出院m RS≤2分组和出院m RS>2分组在年龄、高血压病、糖尿病、房颤史方面差异有统计学意义(p<0.05),将上述因素纳入多因素logistic回归分析,结果表明:年龄越大(OR=1.023,95%CI 1.007-1.039)、有高血压病史(OR=1.974,95%CI1.426–2.733)、有糖尿病史(OR=1.983,95%CI 1.376–2.859)、有房颤史(OR=1.717,95%CI 1.213–2.432)的患者发生出院m RS>2分结局的风险显著提高。绘制ROC曲线,比较AUC,结果表明:在AIS患者再灌注治疗后出院m RS评分的预测能力方面,联合预测(AUC=0.673)优于高血压病(AUC=0.598)、年龄(AUC=0.592)、糖尿病(AUC=0.574)、房颤史(AUC=0.572),差异具有统计学意义。3.按照HT评估出院时的短期预后时,单因素分析结果表明:无HT和有HT在年龄、高血压病、糖尿病、房颤史、48h内启用了抗血小板治疗方面差异有统计学意义(p<0.05),将上述因素纳入多因素logistic回归分析,结果表明:年龄越大(OR=1.057,95%CI 1.020-1.095)、有高血压病史(OR=2.102,95%CI 1.014-4.355)、有糖尿病史(OR=3.329,95%CI 1.690-6.556)、有房颤史(OR=2.372,95%CI 1.189clinical pathological characteristics-4.730)、48h内启用了抗血小板治疗(OR=3.581,95%CI 1.795-7.143)的患者发生HT结局的风险显著提高。绘制ROC曲线,比较AUC,结果表明:在AIS患者再灌注治疗后HT的预测能力方面,联合预测(AUC=0.797)优于年龄(AUC=0.677)、糖尿病(AUC=0.650)、48h内启用了抗血小板治疗(AUC=0.630)、高血压病(AUC=0.605)、房颤史(AUC=0.604),差异具有统计学意义。结论在三种评估短期预后的标准下,年龄、高血压病、房颤史均是AIS患者再灌注治疗后短期不良预后的独立危险因素;以出院时m RS评分、HT评估短期预后时,糖尿病也是AIS患者再灌注治疗后短期不良预后的独立危险因素;以HT评估短期预后时,48h内启用了抗血小板治疗也是AIS患者再灌注治疗后短期不良预后的独立危险因素。且联合因素预测不良预后要优于单因素预测。

目的 评价心血管风险评分包括TIMI、GRACE、CRUSADE、C-ACS、ProACS、CHA_2DS_2-VASc、HAS-BLED、TIMI-AF对经冠状动脉介入(PCI)干预急性冠脉综合征(ACS)合并心房颤动(AF)患者院内、远期死亡的预测价值。方法 纳入北京地区12家三甲医院经PCI干预ACS伴AF患者共2429例，根据定义收集相关参数完成上述评分，随访观察住院死亡、长期全因死亡和心血管死亡，在该队列中比较多个评分系统对院内死亡和远期死亡的预测价值。结果 院内共观察到34例死亡，平均随访3.19±1.52年，随访期间共270例患者死亡，其中109例死于心血管事件。GRACE评分、C-ACS评分、ProACS评分和CRUSADE评分对院内死亡的预测能力相当(C值，0.813～0.Medical geography868)，优于其他评分。GRACE评分、ProACS评分、CRUSADE评分和TIMI-AF评分对远期全因死亡的预测能力相似(C值，0.659～0.698)，优于其他评分。GRACE评分、ProACS评分、CRUSADE评分、CHA_2DS_2-VASc评分和TIMI-AF评分对长期心血管死亡的预测能力相似(C值，0.699～0.736)，优于其他评分。结论 GRACE评分、ProACS评分和CRUSADE评分三个评分对经PCI干AZD2281预ACVE-822S合并AF患者院内死亡和远期全因死亡、心血管死亡具有相对较好且相似的预测能力。

目的 探讨PIWI蛋白相互作用RNA-47851(piR-47851)在胃腺癌中的表达、临床病理意义及其对增殖的影响。方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检查79例胃腺癌组织中piR-47851的表达情况，分析piR-47851的表达水平与临床特征和生存预后的关系。通过细胞增殖实验观察piR-47851对胃癌细胞增殖活性的影响。Tofacitinib价格应用信息学网站预测piR-47851的下游靶基因。建立MAPK1基因3′非翻译区(UTR)的野生型和突变型质粒，应用双荧光素酶报告系统验证piR-47851与MAPK1基因3′UTR结合从而抑制MAPK1蛋白合成。应用Rescue实验确认piR-47851对MAPK1直接调控作用，并探讨piR-47851/MAPK1对胃癌细胞增殖的影响。通过实验性裸鼠皮下荷瘤实验观察降低piR-47851表达对移植瘤体积和质量的影响；通过增殖指标Ki-67染色观察降低piR-47851表达对移植瘤细胞增殖活力的影响。结果 qRT-PCR实验结果提示，79例胃腺癌组织中piR-47851的表达水平显著高于癌旁正常胃组织(P<0.05)。piR-47851表达水平与肿瘤大小、分化程度和生存预后密切相关(P<0.05)。生物信息学提示piR-47851与MAPK1基因3′UTR有互补的结合位点。双荧光素酶报告基因实验得出在Mcancer – see oncologyAPK1野生型转染组中，piR-47851能显著抑制荧光酶活性，而在MAPK1突变组中无抑制作用。CCK-8增殖活性实验表明，过表达piR-47851后，胃癌细胞增殖活性升高；降低piR-47851后，细胞增殖活性下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。Rescue实验提示，在改变piR-47851和(或)MAPK1的表达后再通过qRT-PCR检测MAPK1的表达水平，MAPK1都能受到piR-47851的调控。在功能上过度表达MAPK1可以降低piR-47851对胃癌细胞的增殖促进作用，而减低MAPK1表达可进一步提升胃癌细胞的增殖活性。在裸鼠购买Regorafenib荷瘤实验中，降低piR-47851表达后肿瘤生长体积和质量显著减小(P<0.05)。增殖指数Ki-67染色表明减低piR-47851表达后增殖活性细胞数目显著低于对照组(P<0.05),验证了piR-47851能促进细胞增殖。结论 胃腺癌组织中piR-47851表达水平升高，与肿瘤大小和生存预后密切相关。piR-47851通过与MAPK1的3′UTR结合来下调MAPK1蛋白表达，从而促进胃癌的细胞增殖。

脑胶质瘤是中枢神经系统难治性肿瘤类型之一,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)的恶性程度最高,由于其侵袭性生长特性,GBM与正常脑组织基本没有明确的边界,容易导致手术切除selleck化学不彻底,术后复发及放化疗抵抗现象明显。因此,寻求新的医治策略是临床GBM治疗亟需解决的关键问题。近年来,随着科研人员对肿瘤表观遗传学的深入探索,大量研究证实环状RNA(circularRNA,circRNA)不仅在GBM组织/细胞恶性进展中存在显著的失调表达,还在调控肿瘤侵袭、自噬、化疗耐药以及上皮间充质转化等恶性生物学表型方面也发挥着重要作用。circRNA介导的表观遗传学调控一跃成为当下肿瘤学基础研究中炙手可热的探索方向,circRNA也成为GBM靶向治疗领域新兴的研究靶点,应用潜力巨大。总而言之,靶向这些天然存在的circRNA是一种非常有前途的脑肿瘤治疗方式,这对于改善GBM临床治疗现状具有重要意义。核酸类药物如小干扰RNA(Small interferingRNA,siRNA)作为生物医药领域的研究热点,已被广泛应用于探索基因功能以及恶性肿瘤的核酸药物治疗。siRNA作为RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的效应分子,对于具有特殊环形结构的circRNA,RNAi技术也被证实是特异性阻断基因表达的有效方法,其可以根据circRNA反向剪接位点序列或内含子区域序列来设计高度特异性的siRNA分子,以防止对亲本基因的敲低。尽管RNAi疗法在GBM基础研究上已取得突破性进展,但想要真正转化为临床安全用药仍面临诸多挑战(血液稳定性、血脑屏障穿透及原位病灶有效释放等)。因此,安全高效的体内递送仍然是制约RNAi疗法应用的最大障碍。基于此,采用纳米技术构建核酸药物递送系统将是解决这一问题的重要手段和途径。这些具有独特表征的纳米尺度载体不仅可以防止治疗性核酸分子被降解,使其从体循环中穿透血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)或细胞生物屏障,还可以通过载体的表面修饰与细胞膜上的受体发生结合来实现靶向运输,使核酸治疗分子精准作用于靶细胞。在GBM治疗方面展现出显著优势,为克服核酸类药物的循环时间短及无法靶向肿瘤细胞等缺点提供了新的解决方案。本研究以“circRNA介导的表观遗传学调控”以及“RNAi肿瘤疗法”这两个热门研究方向作为切入点,结合Angiopep-2修饰聚合物纳米胶束的稳定性、生物相容性、生物可降解性、低细胞毒性以及对BBB和GBM的靶向性等重要分子特性,提出“RNAi纳米核酸药物通过circRNA/ceRNA途径在GBM靶向治疗中发挥抑癌作用”的科学假设。研究目标:GBM作为常见的致命性恶性肿瘤,抑癌基因和癌基因的表达紊乱是导致GBM生物学特性改变的根本原因。基于课题组前期全转录组测序联合生信分析,进一步丰富了GBM表观遗传学调控的互作网络,为GBM靶向治疗提供了有效靶点,并筛选合成了核酸药物分子(治疗性siRNA)。此外,设计构建了一种经Angiopep-2修饰的嵌段共聚物胶束(PHB-PDMAEMA)作为核酸药物载体,在PHB-PDMAEMA中,PHB片段可以与多肽Angiopep-2通过脱羧反应相互结合,PDMAEMA片段可以依靠静电力作用吸附治疗性siRNA,形成多聚物/基因复合体(RNAi纳米药物)。该RNAi纳米药物可以与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1)膜受体结合介导靶向BBB和GBM,特异性降低细胞中致癌基因circ＿TNFRSF19的表达水平,进而通过其介导的竞争性内源RNA(competing endogenousRNA,ceRNA)调控机制在GBM恶性进展中发挥抑癌作用。综上,本研究首次尝试使用Angiopep-2修饰的PHB-PDMAEMA作为核酸药物载体,介导治疗性siRNA靶向逆转GBM细胞中内源性circ＿TNFRSF19的失调表达,从而抑制肿瘤恶性生物学行为。一方面实现以多聚物纳米胶束为核酸药物载体的稳定交互平台,深入挖掘纳米医学在临床疾病治疗中的实用价值;另一方面证实circRNA介导的表观遗传调控机制在肿瘤治疗中的新兴作用,进一步推动基于circRNA的RNAi疗法。为GBM靶向治疗提供新思路。研究方法:(1)基于5组临床术后GBM组织和外伤减压正常脑皮质组织开展全转录组测序研究,并针对基因测序结果进行高级生物信息学分析。构建circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络,选取互作网络中关键circRNA分子,利用RT-qPCR技术进行基因表达水平验证,最终获得目标circRNA。(2)基于RNAi技术以及RT-qPCR验证实现circRNA敲低。利用Ed U、Transwell及流式细胞Western Blotting术实验对目标circRNA进行细胞功能实验筛选。制备RNAi纳米药物,利用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射仪、透射电子显微镜和CCK-8技术测定RNAi纳米药物的稳定性、ROS响应能力、p H响应能力及细胞毒性。(3)构建BBB以及3D肿瘤球体外模型,利用流式细胞术、Transwell实验及激光扫描共聚焦显微镜对RNAi纳米药物的靶向性(细胞摄取、BBB穿透以及肿瘤组织渗透)进行检测。RT-qPCR、CCK-8、Transwell及流式细胞术检测实验进一步验证RNAi纳米药物的基因沉默和抗肿瘤效果。生物信息学分析预测并通过RT-qPCR和Western Blot验证circ＿TNFRSF19的下游靶基因。研究结果:(1)与非肿瘤对照组相比,来自GBM样本总共发现了5341个差异表达(DE)mRNA、259个DEmiRNA、3122个DElncRNA和2135个DEcircRNA。此外,整合构建了circRNA/lncRNA-mPR-171核磁iRNA-mRNA ceRNA调控网络,并以此为基础,筛选出5个表达上调的circRNA。通过RT-qPCR验证,确定3个兴趣分子作为后续实验研究的初步候选circRNA。(2)siRNA瞬转敲低U343细胞模型构建成功。目标circRNA(circ＿TNFRSF19)表达水平下调后,GBM细胞的恶性生物学行为受到显著抑制。此外,成功制备了PHB-PDMAEMA核酸药物递送载体,其可吸附siRNA形成稳定的多聚物/基因复合体。并且能在高H_2O_2或弱酸性(体外模拟肿瘤微环境)条件下发生降解,快速释放出siRNA分子。(3)Angiopep-2修饰的RNAi纳米药物可与LRP-1膜受体结合主动靶向BBB与GBM细胞,与非靶向修饰组相比,其细胞摄取、BBB穿透和肿瘤组织渗透能力最强。此外,它还被证实能够显著降低GBM细胞中circ＿TNFRSF19的表达水平及增殖、迁移和侵袭能力,并促进肿瘤细胞凋亡。主要机制是circ＿TNFRSF19作为ceRNA分子发挥miRNA分子海绵作用,通过调节GBM细胞中mi R-324-3p/Bcl-2轴来诱导细胞凋亡。研究结论:(1)本研究借助全转录组测序技术深入探究了GBM的发病机制,构建circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA互作网络图,进一步揭示了非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)介导的表观遗传调控与GBM恶性转化之间的潜在关联。这些发现不仅展示了GBM基因组的复杂性,同时也为寻找GBM基因治疗相关靶点提供了证据,靶向纠正肿瘤恶性形成过程中内源性circRNA的失调表达,将是克服GBM治疗瓶颈一种理你想的治疗策略,具有重要意义。(2)敲减circ＿TNFRSF19表达可以显著抑制GBM细胞的增殖、侵袭和迁移,同时促进其凋亡。PHB-PDMAEMA聚合物纳米载体可以稳定吸附siRNA形成聚合物/基因复合体。并且其具备ROS和p H双重响应能力,能在高H_2O_2或弱酸性(体外模拟肿瘤微环境)条件下发生解聚,快速释放出核酸分子,显著提高了siRNA生物利用度。并为后续深入探讨RNAi纳米药物在GBM靶向治疗中的抑癌作用及相关机制研究提供实验基础。(3)Angiopep-2修饰的RNAi纳米药物具备主动靶向功能,不仅能够穿越BBB还可以主动靶向GBM细胞,深层渗透至肿瘤组织内部。此外,其还具有良好的基因沉默和抗肿瘤效果,通过沉默circ＿TNFRSF19显著抑制GBM细胞增殖、迁移和侵袭恶性进展表型,并促进肿瘤细胞凋亡。其潜在机制是circ＿TNFRSF19发挥分子海绵功能通过mi R-324-3p/Bcl-2信号途径显著促进RNAi纳米药物诱导的细胞凋亡。总之,本研究首次尝试使用Angiopep-2修饰的PHB-PDMAEMA作为核酸药物载体,介导治疗性siRNA分子通过调控circ＿TNFRSF19/mi R-324-3p/Bcl-2信号轴,在GBM恶性进展中发挥抑癌作用。不仅为GBM的RNAi疗法提供了新的靶点及理论依据,也为GBM靶向治疗提供了一个良好的交互平台,展示出纳米医学在未来肿瘤治疗领域中的广阔前景。