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研究背景及目的:急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是成人最常见的急性白血病类型,是一种遗传异质性的克隆性造血干细胞恶性肿瘤。2015-2019年期间,AML的死亡率约为每年2.7/10万,五年相对生存率为29.5%。在这种低生存率的情况下,AML患者的治疗选择仍很有限,主要以阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)?联合蒽环类药物强化化疗为主。仍有10-40%的年轻患者对AML诱导治疗无效,而60岁以上患者的这一数字要高得多(40%-60%)。缓解后复发在AML治疗中也是很常见的情况,发生在40%-50%的年轻患者和绝大多数老年患者中。这一类复发难治(Relapsed or Refractory,RR)AML患者的预后通常很差,耐药则是其治愈的主要限制性因素。因此,想要进一步提高AML患者的存活率,则需不断探索治疗的耐药机制。越来越多的证据表明,转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-Pexidartinib使用方法β1)与多种实体肿瘤的化疗耐药有关,如肝细胞癌、结直肠癌和鳞癌等。因此我们推测,复发难治AML患者存在异常的TGF-β1表达,且与化疗耐药相关。研究方法:一、TGF-β1在AML患者中的表达水平以及其信号通路对AML细胞生物学特性和耐药的影响1.TGF-β1在AML患者中的表达水平:收集健康体检者、缺铁性贫血患者以及各疾病状态AML患者外周血及骨髓标本。研究对象分组包括AML组和对照组,其中AML组根据疾病状态不同,划分为初诊组、缓解组和复发难治组;对照组主要为缺铁贫患者(IroFluorescence Polarizationn Deficiency Anemia,IDA)和健康体检者。标本收集后通过密度梯度离心法提取出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),并提取RNA,再通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)的方法检测PBMC中TGF-β1的m RNA水平;其次,通过酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)法检测血浆及骨髓液中TGF-β1细胞因子水平,同时,利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测骨髓活检标本中TGF-β1表达水平。2.TGF-β1表达水平与AML患者临床参数、治疗反应率及预后的关系:AML初诊和复发难治患者血浆中TGF-β1水平与实验室检查结果、首次治疗后缓解状态进行相关性分析。同时在GEPIA2在线数据库中检测AML患者TGF-β1水平与预后的关系。3.TGF-β1及其信号通路在AML耐药细胞中的表达情况:使用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测AML阿霉素耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(HL60和K562)之间TGF-β1、TGF-β信号通路关键蛋白的表达情况;Elisa法检测细胞培养上清中TGF-β1细胞因子的水平。4.TGF-β1对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:在AML细胞(KG-1A,K562和HL60)培养基中加入一定浓度的TGF-β1后,分别通过CCK8法检测增殖、AnnexinⅤ-PI流式法检测凋亡、PI流式法检测周期、衰老相关β半乳糖苷酶(Senescence‐associated‐β‐Galactosidase,SA‐β‐Gal)染色检测衰老细胞比例、Transwell迁移/侵袭实验检测迁移及侵袭能力。5.阻断TGF-β信号通路对AML耐药细胞化疗敏感性的影响:在AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)培养基中加入2种TGF-β受体抑制剂,再用阿霉素(Doxorubicin,DOX)诱导凋亡,48h后用AnnexinⅤ流式法检测凋亡细胞比例。同时,使用WB法检测促凋亡蛋白BAX和Caspase3蛋白的表达水平。二、TGF-β1-SMAD4-SOX4信号轴在AML细胞化疗耐药中的机制研究1.AML患者PBMC中SOX4的表达水平以及与TGF-β1水平的相关性分析:该部分研究的对象及标本处理的方法同TGF-β1,并分析AML患者PBMC中SOX4和TGF-β1表达水平的相关性,同时分析与患者血浆中TGF-β1细胞因子水平的相关性。2.TGF-β1对AML细胞中SOX4表达水平的影响:在AML非耐药细胞(KG-1A和K562)培养基中加入一定浓度的TGF-β1后,使用q PCR法和WB法检测AML细胞株中SOX4表达水平;同时利用2种TGF-β受体抑制剂阻断AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)中TGF-β信号通路,检测SOX4表达水平。3.AML耐药细胞中SOX4表达水平:使用q PCR法和WB法检测AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(HL60和K562)中SOX4表达水平差异。4.SOX4对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:使用小干扰RNA(Small Interfering RNA,si RNA)获悉更多干扰AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和非耐药细胞(KG-1A和K562)中SOX4表达,再用阿霉素诱导细胞凋亡,48h后用流式法进行凋亡检测。同时,分别通过CCK8法和AnnexinⅤ-PI流式法检测干扰SOX4表达之后的AML耐药细胞和非耐药细胞的增殖与基础凋亡。5.TGF-β1通过SOX4诱导AML细胞发生耐药:在AML非耐药细胞(KG-1A和K562)培养基中加入TGF-β1后,用si RNA干扰SOX4表达,并用阿霉素作用48h,通过AnnexinⅤ-PI流式法检测凋亡细胞比例。6.SOX4转录因子预测及SMAD4在AML中表达水平:使用JASPAR在线数据库预测SOX4启动子区域可能结合的转录因子;AML患者PBMC中SMAD4水平检测对象及方法同SOX4,并与SOX4水平进行相关性分析。7.TGF-β1通过促进SMAD4核內移调控SOX4的表达:在KG-1A细胞中加入TGF-β1后,用si RNA干扰SMAD4表达,再通过免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)法检测TGF-β1作用下SMAD4细胞核内移的情况;同时使用q PCR法和WB法检测AML细胞中SOX4表达水平。研究结果:一、TGF-β1在AML患者中的表达水平以及其信号通路对AML细胞生物学特性和耐药的影响1.TGF-β1在AML患者中的表达水平:AML复发难治组患者PBMC中TGF-β1 m RNA水平显著高于初诊组及缓解组,但较健康对照低,且具有统计学差异。复发难治组患者血浆中TGF-β1水平显著升高,与初诊组及缓解组均具有统计学差异;骨髓液中,复发难治组TGF-β1水平较初诊组显著升高。在骨髓活检标本中,AML复发难治组患者TGF-β1阳性表达较初诊组明显增加。同一患者血浆和骨髓中TGF-β1水平无显著差异,但存在正相关性,且同一患者PBMC中TGF-β1 m RNA水平和血浆TGF-β1蛋白水平呈正相关。2.TGF-β1表达水平与AML患者临床参数、治疗反应率及预后的关系:初诊组中,血浆TGF-β1水平与血小板计数呈正相关;骨髓液中TGF-β1水平与年龄和血小板呈正相关,而与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈负相关。复发难治组中,血浆TGF-β1水平与血小板计数呈负相关,与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈正相关;而骨髓液中TGF-β1水平与血小板计数呈负相关,而与外周血中原始细胞百分比和骨髓中原始细胞百分比呈正相关,但无统计学差异。3.TGF-β1及其信号通路相关蛋白在AML耐药细胞中的表达水平:AML耐药细胞中TGF-β1水平较非耐药细胞相比显著升高,同时发现,下游SMAD2和SMAD3磷酸化水平亦显著升高。耐药细胞培养上清中TGF-β1水平均亦较非耐药细胞显著升高,阻断TGF-β信号通路后下游SMAD2磷酸化水平明显下调。4.TGF-β1对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:TGF-β1对AML细胞的增殖、凋亡及周期影响不完全一致,但经过TGF-β1预处理的AML细胞(KG-1A和K562)再经历DOX杀伤后凋亡细胞比例明显减少,同时发现TGF-β1可促进KG-1A、K562衰老和迁移/侵袭能力。5.阻断TGF-β通路对AML耐药细胞化疗敏感性的影响:TGF-β受体抑制剂联合化疗药物(DOX和Ara-C)后对AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)的抑制率较单用化疗药物明显上升,凋亡细胞比例也显著升高。二、TGF-β1-SMAD4-SOX4信号轴在AML细胞化疗耐药中的机制研究1.AML患者PBMC中SOX4的表达水平以及与TGF-β1水平的相关性分析:AML复发难治患者中SOX4表达显著高于初诊组、缓解组以及健康对照组,且与PBMC中TGF-β1水平和血浆中TGF-β1蛋白水平显著正相关。2.TGF-β1对AML细胞SOX4表达水平的影响:在AML细胞(KG-1A和K562)中,随着加入TGF-β1细胞因子浓度的升高,SOX4 m RNA和蛋白水平均逐渐提升。而使用TGF-β受体抑制剂阻断AML耐药细胞(HL60/ADR及K562/ADR)中的TGF-β信号通路,同样发现SOX4蛋白水平下调。3.AML耐药细胞中SOX4表达水平:在AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)中,SOX4表达水平较AML非耐药细胞(HL60、K562)显著升高。4.SOX4对AML细胞耐药及其他生物学特性的影响:干扰SOX4表达可增加AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)和AML非耐药细胞(KG-1A和K562)的化疗敏感性。同时可抑制AML耐药细胞的增殖和促进其凋亡;而对AML非耐药细胞的增殖无显著影响,基础凋亡率轻度升高。5.TGF-β1通过SOX4诱导AML细胞耐药:TGF-β1可以促进AML细胞(KG-1A、K562)抵抗DOX诱导的凋亡作用,而干扰SOX4水平后这种抗凋亡作用减弱。同样在化疗药物作用的条件下,干扰SOX4表达后AML耐药细胞(HL60/ADR和K562/ADR)的凋亡比例显著增加。6.SOX4转录因子预测及SMAD4在AML中表达水平:经在线网站预测,TGF-β信号通路中SMAD4可以与SOX4启动子区域结合。SMAD4在AML复发难治组水平较初诊组升高,较健康对照组减低,与缓解组无显著差异。且初诊组SMAD4表达水平与SOX4水平显著正相关。7.TGF-β1通过SMAD4核內移调控SOX4的表达:在AML细胞中,TGF-β1可以引起SMAD4核转移,而在SMAD4被si RNA干扰后,这种核转移现象明显下调,且SOX4在m RNA和蛋白水平的表达也均出现了不同程度的下调。研究结论:1.复发难治AML患者和AML耐药细胞中TGF-β1表达水平显著升高,提示TGF-β1与AML耐药相关。2.TGF-β1可促进AML细胞发生耐药,而TGF-β受体抑制剂可提高耐药细胞的化疗敏感性。3.TGF-β1可能通过TGF-β1-SMAD4-SOX4轴促进AML细胞耐药。

目的 探讨小分子化合物ZY-444对前列腺癌细胞增殖、凋亡和迁移的作用及其可能分子机制。方法 用DMSO(对照组)和不同浓度ZY-444 1.25、2.5、5μmol/L处理前列腺癌细胞株DU145Antibiotic-siderophore complex,采用内盐法检测DU145细胞增殖，克隆形成实验观察DU145细胞克隆形成，流式细胞术检测DU145细胞凋亡，细胞划痕和Transwell侵袭实验分别检测DU145细胞迁移和侵袭，Western blot法检测Caspase-3、Bcl-2、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Snail、c-myc和细胞周期蛋MK-2206体内白D1(cyclin D1)蛋白表达。结果 与对照组相比，ZY-444呈浓度依赖性地抑制DU145细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成，促进细胞凋亡，下调Bcl-2蛋白表达，上调Caspase-3蛋白表达(P<0.05)。与对照组相比，ZY-444 5μm点击此处ol/L可下调N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、c-myc和cyclin D1蛋白表达，上调E-cadherin和GSK-3β蛋白表达(P<0.05)。结论 ZY-444可抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡，逆转细胞上皮间质转化，并通过Wnt信号通路发挥抗肿瘤作用。

研究背景心脑血管疾病临床表现复杂,死亡率高,疾病负担重。心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后引发卒中、认知功能障碍、抑郁等脑部并发症,大大加重了临床死亡率及治疗难度,其治疗成为一个亟待解决的难题,但是目前对于MI后引起脑部疾病的中间介质及机制尚不清楚。已有研究表明,MI引起炎症反应、氧化应激、自噬等多个病理环节的激活,导致脑部神经炎症反应的发生,且伴随心肌缺血时间的延长,脑部出现持续的神经炎症反应,不仅会引发神经毒性,造成神经元损伤,促进神经退行性疾病的发生,还会使交感神经兴奋性增强,导致恶性心律失常的发生。因此,揭示MI后出现神经炎症反应的病理机制,将为心脑共病的防治提供有效途径。神经炎症反应参与多种神经系统疾病的发病机制,由中枢神经系统内主要的免疫细胞—小胶质细胞驱动。一方面,小胶质细胞参与中枢神经系统发育,包括调节神经突触形成、修剪突触、吞噬和清除因程序性细胞死亡的神经元,帮助维持脑内环境稳定;另一方面,脑部出现损伤时,小胶质细胞发生表型变化,迅速增殖,促进神经炎症反应发生。但是,过度激活的小胶质细胞则会造成持续的神经炎症反应,促进神经退行性疾病等神经系统疾病的发生。因此,小胶质细胞常作为神经系统疾病的主要研究对象,而离子化钙结合适配器分子1(Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1,IBA-1)作为小胶质细胞标记物,被广泛用来研究脑部神经炎症反应。对心脑之间的关系,中医认为,“神明之体藏于脑,神明之用发于心”,元神在脑,识神在心,心脑息息相关。脑之神明伤,累及于心,心之神明伤,累及于脑。在治疗上,中医强调“脑心同治”。脑心通方(胶囊)是“脑心同治”的代表方剂,临床广泛用于缺血性心脑血管疾病Anti-biotic prophylaxis的治疗,疗效可靠。因此,可用于心脑共病的研究。为探究MI后出现神经炎症反应的病理过程及机制,本研究拟利用IBA-1标记MI大鼠脑部的小胶质细胞,检测神经炎症反应的变化,筛选MI后脑部出现神经炎症反应的时间点;利用蛋白质组学技术探究MI后神经炎症反应相关的蛋白网络,并以脑心通方(胶囊)为探针,通过解析方剂作用的效应分子,揭示MI后神经炎症反应的关键蛋白,同时帮助阐释脑心通方(胶囊)“脑心同治”的药效作用机制。研究内容1.对MI后出现神经炎症反应的时间点进行研究。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎模型,对MI后1、3、5、7d四个时间点的大鼠心脏组织进行病理染色,对脑组织进行小胶质细胞的免疫荧光标记,评价神经炎症反应,确认MI后脑部最早出现神经炎症反应的时间点。2.基于蛋白质组学技术的MI后心脏组织和大脑皮层组织的差异蛋白分析。根据前期结果,选择MI后1、3、7d三个时间点,利用DIA蛋白质组学技术分析MI后心脏组织和大脑皮层组织的蛋白表达量变化,通过生物信息学分析,寻找差异表达蛋白,初步筛选与MI后神经炎症反应发生相关的差异蛋白。3.通过脑心通方(胶囊)对MI后神经炎症反应的药效学评价和机制探究揭示MI后出现神经炎症反应的关键蛋白及脑心通方(胶囊)的关键作用分子。以人体等效剂量为脑心通方(胶囊)中剂量,以1/2和2倍的人体等效剂量为低剂量和高剂量,对SD大鼠预给药7 d后进行MI模型构建,分别于术后1d和7 d取材。通过心脏梗死面积、组织病理染色和IBA-1标记脑部小胶质细胞进行脑心通方(胶囊)的药效学评价;选择最佳给药剂量,并基于DIA蛋白质组学技术探究脑心通方(胶囊)的药效作用分子,结合第二章的蛋白网络结果进行核心蛋白的筛选和验证。研究结果1.MI后脑部出现神经炎症反应心脏组织HE染色和Masson染色结果表明,MI后1 d,左心室组织出现炎性细胞浸润,MI后3d心肌组织开始出现蓝染胶原纤维,且随着缺血时间延长,纤维化面积逐渐增大,心肌损伤加重,表明由心肌梗死逐渐发展为心肌纤维化。脑组织病理染色结果表明,大脑并未出现显著的细胞损伤;免疫荧光染色结果表明,MI后1d,IBA-1的表达在皮层出现显著性升高,MI后3d表现为增加的趋势,并在MI后5 d、7 d维持高表达状态,表明小胶质细胞激AZD9291作用活,脑部出现神经炎症反应。2.MI后出现神经炎症反应的差异蛋白网络构建MI后1、3、7d的心脏组织蛋白质组学结果表明,随着缺血时间改变,差异蛋白的表达量发生变化,其功能涉及炎症反应、氧化应激、心肌纤维化等多个病理过程;大脑皮层组织有少量蛋白表达量被上调,且在不同时间点发生动态变化,蛋白功能涉及补体凝血级联反应、线粒体转运、细胞粘附等生物学过程。心脑之间的差异蛋白存在互作关系,表明心脑之间存在潜在的关键蛋白。通过与脑部疾病进行关联,筛选与神经炎症相关的差异蛋白,得到17个差异蛋白:蛋白补体C3(C3-beta-c,C3)、补体成分 4-结合蛋白(C4b-binding protein alpha chain,C4BPA)、补体因子(Complement factor properdin,CFP)、线粒体核糖体蛋白S14(Mitochondrialribosomalprotein S14,MRPS14)、钙网蛋白(Calreticulin,CALR)、整合素 β(Integrin beta,ITGB3)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN1)、蛋白聚糖(Versican,VCAN)、巨噬细胞帽盖蛋白(Macrophage-cappingprotein,CAPG)、整合素α3 变体 A(Integrin alpha 3 variant A,ITGA3)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK11)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、39S 核糖体蛋白 L22(39S ribosomal protein L22,MRPL22)、Ras 相关蛋白 Rab-28(Ras-related protein Rab-28,RAB28)、酪氨酸蛋白激酶受体(Tyrosine-protein kinase receptor,RPTKs)、三磷酸腺苷结合盒转运体 G4(ATP binding cassette transporter G4,ABCG4)、超长链脂肪酸蛋白 5(Elongation Of Very Long Chain Fatty Acids Protein 5,ELOVL5)。3.脑心通方(胶囊)药效学评价及机制探讨(1)药效结果表明,脑心通方(胶囊)中剂量(220mg/kg)可以显著减轻心肌损伤:显著缩小MI后大鼠的心脏梗死面积、减轻心脏组织病理损伤、减小心肌纤维化面积、降低心脏组织炎性细胞浸润;同时可以显著改善脑部皮层组织的小胶质细胞激活。(2)蛋白质组学分析结果表明,脑心通方(胶囊)可显著降低大脑皮层中ABCG4、ELOVL5、DNA 连接酶 3(DNA ligase3,Lig3)、自噬相关蛋白 2(Autophagy-related 2A,ATG2A)、氯化物通道蛋白 7(H(+)/Cl(-)exchange transporter7,CLCN7)的蛋白表达量。分子对接结果表明,ABCG4与脑心通方(胶囊)关键成分芍药苷、丹参酮IIA、阿魏酸均具有自发结合能力;WB实验结果表明,脑心通方(胶囊)给药组的ABCG4蛋白表达量被显著回调;进一步的CETSA的实验结果表明,随着温度升高,脑心通方(胶囊)给药组的ABCG4蛋白降解被延迟。综上,表明脑心通方(胶囊)可改善MI后心肌损伤,减轻脑部小胶质细胞的激活,降低神经炎症反应;脑心通方(胶囊)可显著改善相关蛋白的表达量,其中ABCG4可能是MI后神经炎症反应发生的关键蛋白。结论1.通过研究MI后脑部神经炎症反应,结果表明MI后1d,脑部出现了小胶质细胞的活化,且在7d内持续存在。2.利用蛋白质组学探究MI后神经炎症反应的差异蛋白。LY294002采购结果表明,MI后脑部神经炎症反应的出现伴随心脏和大脑皮层组织的多个蛋白的表达量变化,且心脑之间的差异蛋白存在相互作用关系,其功能涉及多个病理环节,通过筛选得到了 17个可能的差异蛋白。3.药效学评价结果表明,脑心通方(胶囊)对MI后的心肌损伤以及脑部小胶质细胞的活化具有较好的干预作用;蛋白质组学结果表明,脑心通方(胶囊)可显著调控ABCG4的表达量变化,结合前期研究表明,ABCG4可能是心肌梗死后出现神经炎症反应的关键蛋白。

目的本研究通过收集急性缺血性卒中(Acute Ischemic Stroke,AIS)患者入院时基本资料、第一次临床化验指标,卒中相关预后因素、评估其出院后3个月m RS评分,分析急性缺血性脑卒中患者近期预后的影响因素及与入院时中性粒细胞和淋巴细Viral infection胞比值的相关性,为临床医生提此网站供更多的参考依据,为治疗急性缺血性卒中患者及二级预防提供科学依据。方法严格按照纳入排除标准,于2018-2019年收集朝阳市中心医院1740例急性缺血性卒中患者进行问卷调查、体格检查和实验室检测。并对患者进行出院后3个月结局随访。采用二元Logistic单因素、多因素回归分析模型分析影响AIS患者不良预后的相关因素。结果1.本研究共纳入研究对象1500例,残障有133例,残障率8.9%,女性高于男性(11.4%vs7.4%),差异有统计学意义(P<0.05);急性缺血性患者出院3个月m RS评分为1.24±1.27,其中男1.22±1.21,女1.28±1.37;<50岁的AIS患者出院3个月m RS评分为0.95±1.08,其中男1.00±1.17,女0.68±0.65;50岁~59岁的AIS患者出院3个月m RS评分为1.09±1.14,其中男1.10±1.09,女1.05±1.28;60岁~69岁的AIS患者出院3个月m RS评分为1.29±1.27,其中男1.26±1.23,女1.34±1.33;70岁~79岁的AIS患者出院3月m RS评分为1.36±1.38,其中男1.30±1.24,女1.45±1.55;>80岁的AIS患者出院3个月m RS评分为1.48±1.38,其中男1.51±1.41,女1.43±1.35,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.NLR用四分位数法将患者分为4组,Q1组:NLR≤1.63的有281例,残障有19例,残障率为6.8%,男性3.8%,女性10.7%,差异有统计学意义(P<0.05);Q2组:1.64≤NLR≤2.30的有373例,残障有29例,残障率为7.8%,男8.6%,女7.1%,差异无统计学意义(P>0.05);Q3组:2.31≤NLR≤3.31的有374例,残障有26例,残障率为7.0%,男4.2,女13.3,差异有统计学意义(P<0.05);Q4组:NLR≥3.32的有369例,残障有53例,残障率为14.4%,男13.6,女16.2,差异无统计学意义(P>0.05)。3.AIS患者预后的多因素Logistic回归结果显示,高年龄组(与<50岁年龄组相比,70岁~79岁OR=3.95,95%CI:1.54-10.15;≥80岁OR=5.66,95%CI:2.11-15.17)、高血压(OR=1.59,95%CI:1.06-2.37)、糖尿病(OR=1.90,95%CI:1.28-2.83)、房颤(OR=3.03,95%CI:1.41-6.49)、中性粒细胞(OR=1.02,95%CI:1.41-6.49)、NLR(与NLR第一分位组相比,NLR第四分位组:OR=2.28,95%CI:1.32-3.95,P<0.05)是AIS患者出院3月预后不良的主要相关因素。男性AIS患者预后不良的多因素Logistic回归结果显示高年龄组(与<50岁年龄组相比,70岁~79岁:OR=3.16,95%CI:1.07-9.35;≥80岁:OR=5.33,95%CI:1.71-16.61)、高血压(OR=1.69,95%CI:1.00-2.86)、NLR(与NLR第一分位组相比,NLR第四分位组:OR=2.28,95%CI:1.32-3.95,P<0.05)是AIS患者出院3个月预后不良的相关因素。女性AIS患者预后的多因素Logistic回归结果显示糖尿病为AIS患者预后不良的相关因素,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AIS患者出院后3个月不良预后的相关因素有年龄增加、糖尿病、房颤、中性粒细胞、NLR第四分位组,男性AIS患者出院后3个月不良预后的相关因素有年龄增加、高血压、NLR第四分位组,女性AIS患者出院后3个月不良预后的相关因素有糖尿病。本研究评价了AIS患者入院时NLR与其出院后3个月不良预后的关系,发现入院时NLR与CP-690550急性缺血性卒中患者近期预后具有相关性。综上所述,男性、年龄增加、文化程度为高中及以上、高血压、糖尿病、房颤、现吸烟、现饮酒、血尿酸、中性粒细胞计数、NLR与AIS患者出院后3个月预后不良有关。

目的 探讨微RNA(miR)-30d-5p在胰腺癌（PAAD）中的潜在作用和调控机制。方法 选择2016年12月至2019年1月来新疆维吾尔自治区人民医院接受手术治疗的胰腺癌病人35例，术后即刻获得胰腺肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织，采用实时定量PCR检测miR-30d-5p在胰腺癌组织和细胞中的表达水平。使用细胞计数试剂盒（CCK-8）、克隆形成、transwell和流式细胞术检测miR-30d-5p对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。通过萤光素酶测定和蛋白质印迹法评估miR-30d-5p对ABCB5表达的调控作用。进一步构建裸鼠成瘤模型通过肿瘤质量和体积验证miR-30d-5p对肿瘤生长的影响。采用苏木精伊红染色验证肿瘤组织增殖情况。结果 selleckchem INCB018424与癌旁组织（1.03±0.17）及正常细胞（0.98±0.18）相比，胰腺癌组织（0.35±0.08）和细胞（0.63±0.08,0.23±0.07,0.48±0.07及0.31±0.05）中miR-30d-5p的表达显著Q-VD-Oph使用方法降低（P<0.05）;miR-30d-5p的过表达抑制了肿瘤细胞的活力、迁移和侵袭并促进了细胞凋亡且差异有统计学意义（P<0.05）；抑制ABCB5的表达能抑制细胞活力、迁移和侵袭性并促进了胰腺癌的细胞凋亡且差异有统计学意义（P<0.05）；体内实验证明miR-30d-5p组能够抑制肿瘤生长且差异有统计学意义（P<0.05）。结Medical dictionary construction论MiR-30d-5p通过靶向ABCB5影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡，可能是PC病人潜在的预后生物标志物及靶向治疗的靶点依据。

背景与目的:新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome corona virus 2,SARS-CoV-2)是一种于2019年底出现的高传染性和高致病性冠状病毒。新冠病毒感染的典型临床特征包括弥漫性肺泡出血和渗出性肺炎,淋巴细胞减少,进一步发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),全身炎症反应性综合征(SIRS),血栓形成和栓塞、休克,最终导致包括肺损LY294002化学结构伤在内的多器官功能障碍和弥散性血管内凝血综合征(DIC)样综合征。大量研究显示新冠病毒导致的全身性炎症反应综合征和多器官衰竭并不是由SARS-CoV-2的入侵和复制所直接导致,而是SBE-β-CD临床试验在多种因素的共同作用下诱导的细胞死亡和免疫炎症反应所驱动的。新冠病毒的包膜蛋白(E蛋白)是构成病毒颗粒的一种结构蛋白,它定位在病毒颗粒的外壳上。研究显示SARS病毒E蛋白可在体外模型中引发细胞凋亡,并且在小鼠模型中引发炎症反应和肺损伤。基因序列比对表明SARS-CoV-2和SARS病毒的E蛋白高度保守,提示它们在功能上可能具有相似性。因此本课题拟利用体内外模型来探究SARS-CoV-2 E蛋白对细胞死亡和小鼠脏器损伤的作用,在此基础上探讨E蛋白诱导单核细胞死亡的分子机制,同时对靶向E蛋白诱导的单核细胞死亡的保护剂进行筛选和活性研究,以期为COVID-19的潜在靶点筛选和临床药物开发提供新的见解和思路。实验方法:1.SARS-CoV-2 E蛋白引起细胞死亡和多脏器损伤的作用:1)通过小鼠尾静脉注射E蛋白(20μg/kg)构建动物病理模型,收集血清和组织样本进行血清乳酸脱氢酶(LDH)检测和组织病理分析;2)体外培养人外周血单核细胞(THP-1),人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人支气管上皮细胞(BEAS-2B),采用不同浓度的E蛋白作用以上细胞,或用相同浓度的E蛋白作用细胞不同时长,通过CCK-8和LDH漏出率检测E蛋白对细胞的毒性作用;3)用不同SARS-CoV-2的结构蛋白和非结构蛋白分别处理THP-1细胞,通过CCK-8和LDH漏出率检测不同蛋白的细胞毒性作用。2.SARS-CoV-2 E蛋白诱导单核细胞焦亡的作用和机制分析:1)利用不同的死亡抑制剂预处理THP-1,CCK-8和LDH漏出率检测细胞毒性,Annexin V/PI染色和光学显微镜观察细胞形态学变化,分析E蛋白诱导的细胞死亡的可能形式;2)通过Western blot检测E蛋白刺激后THP-1细胞中NLRP3/GSDMD经典焦亡信号以及NF-κB和MAPK促炎信号通路激活情况;3)实时荧光定量PCR(QPCR)分析促炎细胞因子表达;4)利用NF-κB抑制剂和TLR2抑制剂预处理THP-1,CCK-8和LDH漏出率检测细胞毒性,证实E蛋白通过TLR2/NF-κB信号诱导单核细胞焦亡。3.Ruscogenin对SARS-CoV-2 E蛋白诱导的单核细胞焦亡的保护作用和机制分析:1)通过CCK-8和LDH漏出率检测,筛选出对E蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用的小分子化合物;2)利用不同浓度的Ruscogenin预作用THP-1,通过CCK-8,LDH漏出率和形态学观察,分析Ruscogenin对E蛋白诱导单核细胞焦亡的保护作用的量效反应;3)通过Western blot检测Ruscogenin对NLRP3/GSDMD焦亡途径和促炎信号通路激活情况的影响。实验结果:1.静脉注射SARS-CoV-2 E蛋白可导致小鼠血清中LDH水平显著升高,肺和肝脏组织出host-derived immunostimulant现明显的病理损伤和炎性浸润。外源性给予SARS-CoV-2 E蛋白可时间和剂量依赖诱导THP-1,HUVECs和BEAS-2B发生细胞死亡。在THP-1细胞中,SARS-CoV-2的S,N,NSP1,NSP3,NSP5,NSP7,NSP8蛋白不能诱导细胞死亡,仅E蛋白可以特异性诱导THP-1细胞死亡。2.SARS-CoV-2 E蛋白处理可以诱导THP-1发生细胞肿胀的典型焦亡样死亡,并时间和剂量依赖地引发NLRP3表达升高和焦亡相关蛋白GSDMD的活化;此外E蛋白可以诱导NF-κB,p38和JNK促炎信号的激活,并增加NLRP3和TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-6,CCL-5等促炎细胞因子的基因表达;而泛caspase,TLR2和NF-κB抑制剂可部分抑制E蛋白诱导的THP-1死亡。3.通过筛选发现天然产物Ruscogenin可以剂量依赖地减轻E蛋白诱导的THP-1焦亡样死亡,减少NLRP3表达以及下游Caspase-1和GSDMD的活化;Ruscogenin可以抑制促炎信号NF-κB的激活,而不影响p38和JNK信号。实验结论:1.在整体动物水平,SARS-CoV-2 E蛋白可以诱导小鼠组织损伤和炎性浸润;体外模型中,E蛋白可诱导多种细胞发生死亡,提示E蛋白可能作为一种毒力因子参与新冠肺炎导致的组织损伤。;2.SARS-CoV-2 E蛋白可能部分通过TLR2/NF-κB,p38和JNK信号通路,激活NLRP3/GSDMD途径,诱导单核细胞焦亡。3.Ruscogenin可能通过抑制NF-κB信号通路,阻止NLRP3/GSDMD激活,从而减轻SARS-CoV-2 E蛋白导致的单核细胞焦亡。

目的：分析姜黄素影响肝癌（LC）细胞系BEL-7402体外Pidnarulex体内实验剂量侵袭、转移与增殖及其潜在分子机制。方法：对LY2835219试剂BEL-7402细胞实施浓度不等的姜黄素（0、30、60μmol/L）干预，经由四甲基偶氮唑蓝（MTT）技术对细胞的增殖情况展开测定，Transwell法对细胞侵袭与迁移活性展开测定；用姜黄素（60μmol/L）处理BEL-7402细胞，Western blot法检测细胞内Tolablation biophysicsl样受体4(TLR4)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达情况。结果：MTT实验显示，在BEL-7402细胞增殖能力上，相较空白对照组，姜黄素1组、2组皆显著偏低（P<0.05）。Transwell侵袭和迁移实验结果显示，相较于空白对照组，姜黄素1组和姜黄素2组BEL-7402细胞侵袭能力和迁移能力均显著降低（P<0.05）。Western blot结果表明，姜黄素2组BEL-7402内mTOR、TLR4蛋白表达量显著下调（P<0.05）。结论：对于LC细胞BEL-7402的增殖、转移与侵袭，姜黄素具抑制功能，其机制和下调信号途径TLR4/mTOR可能相关。

【背景】幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)与多种消化系统疾病的发生密切相关,铋剂四联疗法被推荐为根除Hp的一线治疗方案,但该方案因药物使用种类多、抗生素剂量高、治疗周期长等问题,导致腹痛、腹胀及腹泻等不良反应发生率高,从而影响治疗效果。积极探索更为简便有效安全的Hp感染治疗方案具有重要意义。【目的】本研究拟通过比较伏诺拉生联合小剂量阿莫西林二联7天疗法与铋剂四联14天疗法治疗Hp感染的疗效及安全性,为根除Hp寻找简便有效安全的治疗方法。【方法】本研究为前瞻性、随机对照、单盲、非劣效性临床研究,共纳入2022年8月到12月在我院诊断为Hp感染且未经过根除治疗的患者220例,按照1:1的比例,随机分为二联疗法组110例,四联疗法组110例。二联疗法组:伏诺拉生片20mg 2次/天+阿莫西林胶囊500mg 3次/天,疗程7天;四联疗法组:奥美拉唑肠溶胶囊20mg 2次/天+胶体果胶铋胶囊200 mg 2次/天+阿Biogenic synthesis莫西林胶囊1000mg 2次/天+克拉霉素片500mg 2次/天,疗程14天。治疗结束至少4周后,复查~(13)C-尿素呼气试验,比较两组患者Hp根除率及不良反应发生率。【结果】意向性(Intention to treat,更多ITT)分析二联疗法组和四联疗法组Hp根除率分别为62.7%(69/110,95%CI:53.5%-71.9%)、64.5%(71/110,95%CI:50.2%-68.1%),率差为1.82%(95%CI:-14.53%-13.22%),二联疗法Hp根除率的95%CI下限(53.5%)低于非劣效边界(95%CI:64.5%-6.3%=58.2%),差异无统计学意义(P=0.779):符合方案集分析(Per protocol,PP)二联疗法组和四联疗法组Hp根除率分别为75.8%(69/91,95%CI:66.9%selleckchem ZD1839-84.8%)、82.5%(71/86,95%CI:74.4%-90.7%),率差为6.73%(95%CI:-18.64%-5.17%),二联疗法Hp根除率的95%CI下限(66.9%)低于非劣效边界(95%CI:82.5%-6.3%=76.2%),差异无统计学意义(P=0.271)。二联疗法组总体不良反应发生率为15.4%,四联疗法组总体不良反应发生率为31.8%,二联疗法组不良反应发生率显著低于四联疗法组,差异有统计学意义(P=0.004)。【结论】在中国,伏诺拉生联合小剂量阿莫西林二联7天疗法未能提供满意的Hp根除率,但二联疗法的不良反应发生率显著低于四联疗法。

研究目的:乳腺癌是当前女性群体中发病率、死亡率高,预后较差的恶性肿瘤,化疗是临床乳腺癌常用疗法,但长期以来都面临多药耐药问题。自噬激活导致的凋亡抵抗为多药耐药产生的重要原因之一;此外,乳腺癌微环境中含量丰富的脂肪细胞同样具有激活乳腺癌细胞自噬和增强乳腺癌细胞耐药性的作用。因此,本研究将基于乳腺癌单细胞培养以及乳腺癌细胞与脂肪细胞的共培养模型,研究瑞香狼毒提取物(LD)对乳腺癌细胞自噬相关过程的调控以及多药耐药的影响,同时对相关作用机制进行初步探索。研究方法:针对乳腺癌单细胞模型,采用MTT法检测阿霉素(ADR)和LD对两种乳腺癌化疗敏感细胞株及其对应的阿霉素耐药株存活率的影响,计算IC50及耐药因子;DAPI染色检测LD对耐药细胞凋亡特征的影响;annexin-V-pi双染法检测LD对两乳腺癌耐药细胞株凋亡的影响;western blot检测LD对两乳腺癌耐药细胞株细胞凋亡相关蛋白caspase-8、cleaved caspase-8、caspase-3、cleaved caspase-3 以及自噬相关蛋白mTOR、p-mTOR、p62、LC3表达水平的影响;MDC染色检测LD对耐药细胞自噬小体的影响;LC3免疫荧光检测LD对耐药细In Vivo Testing Services胞LC3表达水平的影响;GFP-LC3B-mcherry重组腺病毒Laduviglusib小鼠转染检测LD对耐药细胞自噬过程的影响;试剂盒检测LD对敏感耐药细胞上清葡萄糖及乳酸、ATP含量的影响;最后采用自噬抑制剂氯喹(CQ)对LD的药效和作用机制进行正向验证。针对脂肪细胞与乳腺癌细胞的共培养模型,采用MTT法检测ADR和LD对乳腺癌敏感及耐药细胞存活率的影响,流式细胞术检测LD对耐药细胞凋亡的影响。Western blot检测LD对敏感及耐药细胞自噬相关蛋白p62、LC3B表达水平的影响;油红O染色检测LD对MDA/ADR细胞脂滴的影响;bodipy荧光与LC3免疫荧光的共定位检测LD对耐药细胞脂滴自噬的影响;试剂盒检测LD对上清乳酸、葡萄糖以及脂肪酸含量的影响;最后,RT-PCR检测LD对共培养体系中脂肪细胞分化标志物FABP4及炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α转录水平的影响。针对乳腺癌移植瘤模型,将乳腺癌耐药细胞接种于裸鼠背部皮下作为对照组,接种于腹股沟脂肪垫作为模型组以模拟脂肪含量丰富的乳腺微环境,在此基础上通过阿霉素给药研究两移植瘤的耐药性差异,LD给药研究其对两移植瘤的抑制作用,并通过western blot检测肿瘤组织中自噬蛋白LC3、p62的表达水平。研究结果:针对乳腺癌单细胞模型的研究中,MTT结果显示ADR对于两乳腺癌耐药株均具有较高的IC50值,耐药因子分别为58.21和14RSL3核磁.20;LD能够显著抑制乳腺癌敏感及耐药细胞的增殖过程,且其作用于两耐药细胞株的IC50值更低,耐药因子分别为0.53和0.51。DAPI染色结果显示,LD能够使耐药细胞出现核变形、裂解等凋亡特征;流式结果显示,各浓度组LD均可显著增高乳腺癌耐药细胞的凋亡比例。Western blot结果显示,LD能够显著提高两乳腺癌耐药株cleaved caspase-3/caspase-3 和 cleaved caspase-8/caspase-8 比值;显著降低两细胞 p-mTOR/mTOR比例,上调LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例,升高p62表达水平。MDC染色及LC3免疫荧光结果均显示LD能够使耐药细胞的阳性荧光区域增加。GFP-LC3B-mcherry转染结果显示,LD能够显著增加耐药细胞黄色荧光斑点的数量。上清能量代谢产物检测结果显示,LD能够显著降低两乳腺癌耐药细胞株上清中乳酸及ATP的含量,显著升高上清葡萄糖的含量。CQ的正向验证结果表明,LD与CQ在抑制乳腺癌耐药细胞增殖,调控自噬蛋白p62和LC3表达水平的变化以及促进凋亡均具有相同的作用趋势。针对共培养模型中的研究中,MTT结果显示,过继培养及共培养组乳腺癌敏感及耐药细胞存活率均显著上升,ADR作用后共培养组的存活率显著高于对照组,LD则能够显著降低两模型中乳腺癌细胞的存活率。流式细胞术结果显示,与对照组阿霉素处理后相比,共培养组阿霉素处理后凋亡率显著降低,LD则显著升高模型组乳腺癌细胞的凋亡比例。Western blot结果显示共培养可显著降低敏感及耐药细胞p62的表达水平,升高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值,LD处理后,p62水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值相比对照组显著升高;共培养同时给药的油红O染色结果显示LD能够显著减少乳腺癌耐药细胞中脂滴数目,共培养后给药则显示LD能够显著增加乳腺癌耐药细胞中的脂滴数目。Bodipy与LC3荧光共定位结果显示,与对照组相比共培养组自噬小体和脂滴特异性荧光均显著增强,LD与CQ作用后两种荧光强度均进一步增强。能量代谢检测结果显示,与对照组相比,两乳腺癌细胞模型组上清中的乳酸及脂肪酸含量显著升高,葡萄糖含量显著降低,LD给药组与模型组相比葡萄糖含量均显著升高,乳酸及脂肪酸含量均显著降低。CQ的正向验证结果表明,在共培养体系中LD与CQ在抑制乳腺癌耐药细胞增殖,调控自噬蛋白p62和LC3表达水平的变化以及促进凋亡方面同样均具有相同的作用趋势。最后,RT-PCR结果显示,与乳腺癌耐药细胞共培养的脂肪细胞FABP4表达水平显著降低,LD处理后,与模型组相比FABP4的转录水平有显著回升;共培养后脂肪细胞IL-6、IL-1β和TNF-α转录水平显著升高,LD作用后,各炎性因子转录水平较模型组均显著降低。体内实验结果显示,与对照组相比,模型组移植瘤质量显著增大,对照+ADR组、对照+LD低剂量组、对照+LD高剂量组移植瘤质量显著降低;与模型组相比,模型+ADR、模型+LD低剂量、M+LD高剂量组移植瘤质量均显著降低;与对照+阿霉素组比较,模型+阿霉素组抑瘤率更低。瘤组织的western blot结果显示模型组p62表达水平无显著变化,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高,LD则能够显著升高模型组p62表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平。研究结论:综合以上实验结果,我们认为,LD能够通过抑制乳腺癌细胞自噬过程后段自噬小体与溶酶体的结合或溶酶体的酸化过程,导致自噬小体积累,抑制能量代谢,促进凋亡,从而发挥抗耐药作用。而且,LD不仅能够抑制共培养体系中乳腺癌细胞的自噬及能量代谢过程,导致其凋亡;还能够阻止脂肪细胞向CAA的表型转变,减少炎性因子和脂肪因子分泌,从而降低乳腺癌恶性化的风险,通过对共培养体系的整体调节,改善乳腺癌微环境,抑制乳腺癌发生和发展;最后,在裸鼠移植瘤模型中,LD同样能够有效抑制瘤体的生长。LD的以上作用,反映了中医药多靶点、多途径、整体调节的作用特征,说明其具有进一步开发为克服乳腺癌多药耐药的中药新药的潜力。

当归芍药散是出自张机《金匮要略》的一首经方，配伍经典、功效颇多，临床常用来治疗妇科疾病及其他多种疾病，疗效肯定，不良反应少。为使临床和实验中更好、更深入地研究当归芍药散，通过对当归芍药散的相关文献进行检索和整理，总结了其临床应用、药理作用机制及化学成分等方面的研究，发现该方不仅可SCH727965体内实验剂量以治疗慢性盆腔炎、卵巢囊肿、痛经、月经不调、乳腺疾病、妊娠高血压、不孕、围绝经期综合征等妇科疾病，对非酒精性脂肪肝、肾病综合征、心力衰竭、认知障碍、黄褐斑、风湿病等疾病也有很好的临床效果，无论与西药联用还是单独运用，临床效果均明显优于单纯西药治疗，而且很大程度上能纠正西药的不良反应。药理作用机制方面，经查阅文献整理发现当归芍药散具有抗炎、调节免疫、保护血管内皮、保护神经细胞、调控内分泌、调控脂代谢等药理作用。在总结中发现，目前对当归芍药散的Genetic hybridization研究较多，但某些相关疾病的临床报道较少，动物体内实验研究多而细胞层次研究较少，缺乏方中有效selleck化学成分及药理作用探索研究且不够深入，以及与近年相关研究热点结合不够，这些都有待进一步研究和完善，为临床和实验研究提供科学依据。