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目的:1.复制衰竭心肌细胞模型。2.探索乌头碱对模型细胞的毒性作用与氧化应激、线粒体能量代谢障碍及钙超载的相关性。3.研究甘草次酸拮抗乌头碱对模型细胞毒性作用与缓解氧化应激、调节线粒体能量代谢及维持钙稳态的关联。4.验证甘草次酸是否通过AMPK、Ca MKⅡ通路拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用。方法:1.复制衰竭H9c2心肌细胞模型:采用不同浓度的戊巴比妥钠、过氧化氢、阿霉素分别处理H9c2心肌细胞后,通过CCK-8法,测定H9c2心肌细胞存活率。2.确定乌头碱、甘草次酸在模型细胞的给药浓度:将H9c2心肌细胞分空白对照组、模型组、乌头碱组(15、30、60、120、240、360、480、720μmol/L)、甘草次酸组(15、30、60、120、240μmol/L),除空白对照组,各组首先用100μL的2μmol/L阿霉素处理24 h以复制衰竭H9c2心肌细胞模型,各药物组分组给予100μL相应浓度的药物处理24 h后,采用CCK-8法,检测各组衰竭H9c2心肌细胞存活率。3.乌头碱配伍甘草次酸前后对模型细胞氧化应激反应、线粒体及钙离子的影响:将H9c2心肌细胞分为15组,即空白组,模型组,30μmol/L甘草次酸组,15、30、60、120、240、480μmol/L乌头碱组,及30μmol/L甘草次酸分别配伍15、30、60、120、240、480μmol/L乌头碱组。上述细胞除空白组外,均先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,各药物组模型细胞加1 m L相应浓度的药物孵育24 h。显微观察细胞形态、线粒体微观结构,CCK-8法测定细胞存活率,酶联免疫法检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、ATP酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),荧光探针法测定活性氧(specialized lipid mediatorsreactive oxygen species,ROS)、膜电位、线粒体内外Ca~(2+)浓度。4.测定乌头碱配伍甘草次酸前后模型细胞AMPK、PGC-1α,Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白的表达:1)将H9c2心肌细胞为7组,即空白对照组、模型组、AMPK抑制剂(Compound c)组、甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、Compound c与甘草次酸乌头碱FUT-175共同干预组LGK-974纯度。各组细胞处理流程如下:除空白对照组外,其余各组均先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,Compound c组及Compound c与甘草次酸乌头碱共同干预组再给予5μmol/L Compound c处理2 h;甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、Compound c与甘草次酸乌头碱共同干预组分别给予1 m L相应浓度的药物处理24 h后,采用蛋白免疫印迹法,检测各组AMPK、PGC-1α蛋白表达。2)将H9c2心肌细胞分为7组,即空白对照组、模型组、Ca MKⅡ抑制剂(KN-93)组、甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组。各组细胞处理程序如下:除空白对照组外,其余各组先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,KN-93组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组再给予5μmol/L KN-93处理2 h;甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组分别给予1 m L相应浓度的药物处理24h后,以蛋白免疫印迹法检测各组Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白表达水平。结果:1.阿霉素、戊巴比妥钠、过氧化氢均可降低H9c2心肌细胞存活率:CCK-8法检测发现,H9c2心肌细胞经2μmol/L阿霉素、0.8%戊巴比妥钠及400μmol/L过氧化氢处理后细胞存活率均约为50%,且与空白组比较具有极显著差异(P<0.01)。2.乌头碱在模型细胞的梯度给药浓度为15、30、60、120、240、480μmol/L,甘草次酸在模型细胞的给药浓度为30μmol/L:通过CCK-8法检测15、30、60、120、240、360、480、720μmol/L乌头碱组及15、30、60、120、240μmol/L甘草次酸组衰竭H9c2心肌细胞的存活率变化,实验结果显示,15、30、60μmol/L乌头碱组细胞存活率与模型组比较,呈现下降趋势,无显著差异,120、240、360、480、720μmol/L乌头碱的细胞存活率与模型组具有显著差异(P<0.01或P<0.05),但720μmol/L乌头碱的细胞存活率过低,依照药理学实验给药浓度等比递增梯度法乌头碱给药浓度梯度设置为15、30、60、120、240、480μmol/L。15、30、60μmol/L甘草次酸的细胞存活率与模型组比较,均无显著差异,30μmol/L甘草次酸的细胞存活率与2μmol/L阿霉素的细胞存活率最接近,甘草次酸给药浓度设置为30μmol/L。3.乌头碱配伍甘草次酸后保护衰竭心肌细胞线粒体结构,提高线粒体膜电位、SOD、CAT、GSH、ATP含量、ATP转运酶活性,降低MDA、ROS及线粒体内外Ca~(2+)浓度:实验表明,与模型组比较,乌头碱破坏衰竭H9c2心肌细胞的线粒体结构,且不同浓度乌头碱均可降低模型细胞内SOD、CAT、GSH、ATP含量、线粒体膜电位、抑制心肌细胞内ATP相关转运酶活性、增加衰竭心肌细胞内MDA、ROS含量、提高细胞及线粒体内Ca~(2+)浓度(P<0.01或P<0.05),以上作用均呈剂量依赖(R~2=0.5445～0.9794)。与单用乌头碱比较,乌头碱配伍甘草次酸后,保护线粒体结构的同时,衰竭心肌细胞内SOD、CAT、GSH、ATP含量、线粒体膜电位、ATP相关转运酶活性等均增加,细胞内MDA、ROS含量、细胞及线粒体内Ca~(2+)浓度均降低(P<0.01或P<0.05)。4.乌头碱配伍甘草次酸影响模型细胞AMPK、PGC-1α,及Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2的蛋白表达:研究显示,与模型组相比,乌头碱降低模型细胞的AMPK、PGC-1α、SERCA2a蛋白表达,升高Ca MKⅡ、Ry R2蛋白表达(P<0.01或P<0.05);与乌头碱单用组相比,乌头碱配伍甘草次酸组使模型细胞的AMPK、PGC-1α、SERCA2a蛋白表达升高,Ca MKⅡ、Ry R2蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05)。结论:1.0.8%戊巴比妥钠及400μmol/L过氧化氢、2μmol/L阿霉素均能成功复制衰竭心肌细胞模型。前期预实验发现,0.8%戊巴比妥钠和400μmol/L过氧化氢诱导的衰竭细胞经乌头碱处理后,其细胞存活率过低,无法开展后续研究。故,本文以2μmol/L阿霉素复制衰竭心肌细胞模型。2.氧化应激、线粒体能量代谢障碍及钙超载是乌头碱损伤模型细胞的主要作用环节。3.甘草次酸通过缓解氧化应激、调节线粒体能量代谢及恢复钙稳态拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用。4.甘草次酸拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用机制可能与调节AMPK、PGC-1α,Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白有关。

目的 探讨阿昔莫司对高糖高脂诱导的心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 将H9C2细胞分为对照组(正常培养)、溶剂组(高脂溶剂+0.1%二甲基亚砜)、高脂高糖组(0.1 mmol·L~(-1)的棕榈酸和50 mmol·L~(-1)Hepatic stellate cell的葡萄糖)、低剂量组(高脂高糖诱导+5μg·L~(-1)的阿昔莫司)、中剂量组(高脂高糖诱导+10μg·L~(-1)的阿昔莫司)、高剂量组(高脂高糖诱导+25μg·L~(-1)的阿昔莫司)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖情况；用流式细胞术和TUNEL法检测各组细胞凋亡情况；用蛋白质印迹(Western blot)法检测各组细胞蛋白表达水平；并检测各组细胞氧化应激相关指标水平。结果 对照组、溶剂组、高脂高糖组、低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞48 h细胞(光密度值)分别为1.34±0.11、1.29±0.12、0.43±0.05、0.52±0.06、0.79±0.07和0.99±0.10;TUNEL阳性细胞率分别为(3.79±0.38)%、(3.86±0.43)%、(31.27±3.17)%、(25.13±2.10)%、(20.04±2.25)%和(8.34±0.59)%;活性氧水Nirmatrelvir采购平分别为(10.31±0.79)%、(10.29±0.84)%、(70.12±6.41)%、(61.97±5.12)%、(51.31±4.12)%和(48.97±3.49)%;LCPCI-32765分子式3 II/LC3 I蛋白水平分别为1.10±0.11、1.09±0.12、0.32±0.04、0.45±0.06、0.64±0.07和0.91±0.08。高脂高糖组上述指标分别与对照组、溶剂组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05);高脂高糖组上述指标与低剂量组、中剂量组、高剂量组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 阿昔莫司可通过抑制氧化应激、提高自噬活性减轻高脂高糖诱导的心肌细胞凋亡。

目的 探讨辣椒素受体(TRPV1)及瞬时性受体电点击此处位通道香草酸受体4(TRPV4)与癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6)共表达对结直肠癌(CRC)患者预后的影响。方法 使用GEPIA交互分析软件根据基因表达中值将620例CRC患者分为高表达和低表达两组(中值1例不入组),以设定阈值对TCGA和GTEX数据库中TRPV1和TRPV4基因的表达量进行log_2(TPM+1)转换及差异分析，采用Wilcoxon检验分析TRPV1/TRPV4和CEACAM6基因共表达与CRC患者总体生存期(OS)的关系，采用基因组数据分析及免疫组化染色法对上述结果进行验证。结果 CRC患者癌组织中TRPV1的表达量显著低于癌旁组织(1.70±0.51 Tezacaftor分子量vs topical immunosuppression3.10±0.46,t=-53.56,P<0.01),而TRPV4显著高于癌旁组织(1.47±0.78 vs 0.67±0.33,t=25.98,P<0.01)。TRPV1和CEACAM6双高表达组CRC患者的OS显著高于CEACAM6单高表达患者(中位OS:6.8年vs 5.5年，log-rank P=0.047 9)。结论 检测TRPV1及TRPV4水平可有效评估CEACAM6高表达CRC患者的预后。

目的：探讨中药蜚蠊改善氟尿嘧啶对错配修复基因缺失（dMMR）肠癌细胞敏感性的相关机制。方法：选择dMMR肠癌细胞，予以不同浓度氟尿嘧啶和蜚蠊作用后www.selleck.cn/products/s63845，利用MTT法检测两药联合的抑瘤性，根据抑制率计算出治疗指数（CI）值，明确MS-275 molecular weight联合增效作用，应用二代基因测序及脂质代谢分析，挖掘出差异代谢基因，数据库分析差异基因与相关机制通路。结果：中药蜚蠊可以改善氟尿嘧啶在HCT116和DLD1肠癌细胞中的疗效，GO功能富集分析和KEGG分析结果显示脂质代谢lung viral infection、自噬调控和凋亡通路发生主要改变，利用LC/MS进行脂质组学检测，共有153个脂质分子发生变化，包括脂肪类、鞘脂代谢物、磷脂代谢物和甘油酯。结论：蜚蠊与氟尿嘧啶联合用于dMMR肠癌细胞具有协同增效作用，可能通过调控代谢通路、自噬及凋亡通路机制改善药物疗效。

【目的】黑素瘤具有高度恶性、进展迅速、早期转移、对放疗和化疗不敏感以及高死亡率等特点。转移性黑素瘤患者的生存率极低,深入研究黑素瘤转移的分子机制是提高疗效的关键。越来越多的证据表明,棕榈酸(palmitic acid,PA)参与肿瘤发生发展过程,而Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)在肿瘤信号转导过程中同样发挥重要作用。然而,在人和小鼠黑素瘤中,PA是否能介导TLR4以及下游信号未见相关报道。故本课题旨在研究PA是否激活TLR4介导其下游信号影响小鼠黑素瘤肺转移,为阐明高PA饮食促进肿瘤的发生发展提供科学依据,为后期临床治疗提供理论依据以及新的方向。【方法】1.随机将20只雄性C57BL/6小鼠(6 W龄)分为正常饮食组、高PA饮食组,饮食干预8 W后,检测小鼠血清胆regular medication固醇以及甘油三酯水平。尾静脉注射B16细胞,构建黑素瘤的肺转移模型。用HE染色检测肺转移灶的大小以及数量;用Western Blot检测肺转移灶组织的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达情况,用Western Blot以及免疫荧光检测小鼠肺转移灶组织的TLR4、TRIF、Peli1和p NF-κB蛋白表达。2.选用人黑素瘤A375细胞、小鼠黑素瘤B16细胞进行CCK-8实验,筛选PA促进黑素瘤细胞增殖的最佳浓度(12.5μM、25μM和50μM)。用最佳PA(25μM)浓度作用A375及B16细胞,通过Transwell实验及Western Blot检测E-cadherin、MMCaptisol配制P2和Vimentin蛋白表达水平,评估细胞侵袭能力。使用Western Blot以及免疫荧光检测PA处理细胞后TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白表达。3.使用TAK-242(TLR4抑制剂)和/或PA处理细胞,采用CCK-8检测细胞增殖能力。Western Blot检测TAK-242处理细胞后对E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达的影响,用Western Blot以及免疫荧光检测TAK-242处理对TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白表达的影响。4.使用靶向Peli1的si-RNA和/或PA处理细胞,通过CCK-8检测细胞增殖能力,用Western Blot检测沉默Peli1对黑素瘤细胞的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达影响,进一步通过Western Blot以及免疫荧光检测TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白的表达水平。【结果】1.与正常饮食组相比,高PA饮食组小鼠血清胆固醇水平升高了48%。高PA饮食组小鼠肺转移灶数量明显增多、体积明显增大,转移灶组织中TLR4、TRIF、Peli1和p P65蛋白的表达升高,同时E-cadherin表达下调,MMP2和Vimentin的表达上调。2.梯度浓度PA作用A375和B16细胞后,PA(25μM)具有最佳的促增殖效果,分别为46%(A375细胞)和20%(B16细胞)。PA(25μM)作用A375和B16细胞后,A375和B16细胞的侵袭能力分别提升了58%和54%,同时E-cadherin表达下调、MMP2和Vimentin的表达上调,并伴随着TLR4、TRIF、Peli1、p P65蛋白的表达上调。3.TAK-242(TLR4抑制剂)剂量依赖性地抑制了A375细胞和B16细胞的增殖,最佳抑制浓度为50 n M,分别抑制了44%(A375细胞)和39%(B16细胞)。TAK-242(50 n M)单独作用A375和B16细胞后,E-cadherin的表达上调,Vimentin、MMP2的表达下调,以及TRIF、Peli1、p P65蛋白的表达下调。此外,TAK-242(50 n M)也可显著减少PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin、TRIF、Peli1、p P65的高表达以及E-cadherin的低表达。4.3条靶向Peli1的si-RNA作用A375和B16细胞24h后,序列1号具有最佳的沉默效果,分别为65%(A375细胞)和45%(B16细胞)。si-RNA(序列1号)单独作用A375和B16细胞后,细胞增殖减少、E-cadherin表达上调,Vimentin、MMP2以及p P65蛋白的表达下调,而TLR4和TRIF表达不变。此外,si-RNA(序列1号)也可显著减轻PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin和p P65高表达以及E-cadherin低表达,但不能逆转TLR4和TRIF的高表达。【结论】PA通过激活TLR4/TRIF-Peli1-p P65信号通路从而促进小鼠黑素瘤肺转移以及黑素瘤细胞的增殖以Gefitinib及侵袭。

目的 探讨原发性高血压患者血清中miR-192表达与左心室肥厚的相关性。方法 收集2018年6月至2019年12月期间治疗的187例原发性高血压患者临床资料，行超声心动图检查获得LVPWd、IVST、LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LAD、LVEF和LVMI等指标，并根据超声心动图检查结果将患者分为肥厚组和对照组。实时荧光定量PCR检测血清中miR-192表达，ELISA法测定TGF-β1、Ⅰ型前胶原羧基末端肽（PⅠCP）和Ⅲ型前胶原氨基端肽（PⅢNP）水平。结果 经超声心动图检查，187例原发性高血压患者中，76例出现左心室肥厚（肥厚组），111例未发现左心室肥厚（对照组）；肥厚组患者LVPWT、IVST、LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LAD、LVMI和hs-CRP均较对照组升高（P <0.Pexidartinib05）；肥厚组患者血清中miR-192、TGF-β1、PⅢNP和PⅠimmune cytolytic activityCP水Torin 1抑制剂平较对照组升高（P <0.05）;Pearson相关分析结果显示，原发性高血压患者血清中miR-192水平与LVPWT、IVST、LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LAD、LVMI、TGF-β1、PⅠCP和PⅢNP呈正相关（P <0.05）；多元线性回归分析结果显示，LVPWT、IVST、LVEDD、LVESV、TGF-β1、PⅠCP和PⅢNP是影响原发性高血压患者血清中miR-192水平的相关因素（P <0.05）。结论 血清miR-192水平在原发性高血压左心室肥厚患者中升高，且与左心室肥厚程度及心肌纤维化有关。

目的 构建基于多模态超声的原发性甲状腺淋巴瘤诊断预测模型,并分析其预测效能。方法 回顾性选取2015年1月至2020年3月衢州市人民医院收治的30例原发性甲状腺淋巴瘤(primary thyroid lymphoma,PTL)患者(PTL组)和30例桥本甲状腺炎(hashimoto thyroiditis,NHT)患者(NHT组)为研究对象,所有患者均接受组织病理学检查及多模态超声检查,评估PTL和NHT结节在多模态超声检查上的成像特征参数差异,对有价值的参数进行多因素Logistic回归分析,绘制受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线,分析预测模型的诊断效能。结果C59生产商 多模态超声检查显示,PTL组和NHT组成像特征参数比较,结节最大直径、达峰时间(time to peak,TTP)比、时间-强度曲线(time-sINCB28060ignal intensity curve,TIC)面积比、血管分布、峰值强度(peak intensity,PI)比及向心增强型,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示结节最大直径、TTP比、TIC面积比、血管分布、PI比是PTL的诊断因子。ROC曲线显示诊断模型曲线下面积为0.940,特异性为93.43%,敏感度为92.74%。结论 在原发性甲状腺淋巴瘤诊断中,通过多模态超声检查患者甲状腺结节最大直径、TTP比、TIC面积比、Myoglobin immunohistochemistry血管分布、PI比建立的预测模型可用于鉴别诊断PTL和NHT。

乳腺癌是全球女Baf-A1抑制剂性常见的癌症,发病率和死亡率一直高居不下。确定临床靶点并揭示乳腺癌的潜在机制对我们来说是当务之急。微小RNA(miRNA)在肿瘤进展中起着重要作用。据报道,miR-99b-3p可促进肝癌细胞的侵袭和增殖。然而,miR-99b-3p在乳腺癌癌中的作用仍未被发现。因此,我Ayurvedic medicine们的研究是为了研究miR-99b-3p在乳腺癌中的作用。在我们目前的研究中,我们已经证明,与亲本细胞相比,miR-99b-3p在乳腺癌耐药细胞中显著上调。此外,miR-99b-3p可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并提高其对紫杉醇的敏感性。然后,通过生物信息学工具、荧光素酶报告基因测定以及互补实验,证实PPP2CA是miR-99b-3p的新靶点,并且miR-99b-3p明显抑制了PPP2CA在乳腺癌细胞中的蛋白质表达。总之,我们的研究表明,miR-99b-3p/PPP2Smoothened Agonist配制CA轴可能是乳腺癌的诊断标志物和治疗靶点。

背景:胶质母细胞瘤(Gliomablastoma,GBM)是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有侵袭性强、预后差、复发率高等特点,其五年生存率仅为5%。由于胶质母细胞瘤向周围组织浸润性弥漫性生长的生物学特性,目前采用最大程度手术切除并辅以放疗和口服替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗的综合治疗方案,患者的中位生存时间也仅延长至16-18个月。TMZ为治疗GBM最有效的抗肿瘤活性的烷化剂。研究表明,不敏感的GBM细胞在长期应用TMZ后会逐渐产生耐药性,残留的耐药细胞是术后复发的关键原因。因此,探索针对浸润性GBM细胞并克服耐药性的有效治疗策略具有重要的理论价值和临床意义。铁死亡(Ferroptosis)是一种依赖铁离子参与,区别于细胞坏死、细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式。越来越多的研究表明,溶质载体家族7成员11(Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶 4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)等作为铁死亡的关键调节因子,在克服GBM细胞耐药及抑制GBM复发中发挥不可或缺的作用。爱拉斯汀(Erastin)是第一个被发现可通过胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白(the cystine/glutamate antiporter system,System Xc-)、电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)和肿瘤蛋白 p53(TP53)等选择性且有效地介导铁死亡的小分子诱导剂。这也表明Erastin作为新型放射增敏剂和化学增敏剂具有良好的应用前景。然而,Erastin在普通溶剂中极差的溶解性限制了其在GBM治疗中的有效应用。脂质体(Liposomes)作为一个纳米载体,它的膜结构主要由胆固醇和磷脂组成,具有封装不同理化性质药物的能力。甲基丙烯化明胶(GelMA)为双键改性明胶,是具有光敏性的生物材料。基于上述理念,我们为了成功实现药物递送并抑制术后胶质母细胞瘤复发,构建了一种3D打印光固化水凝胶(Hydrogel)作为药物库,用于递送含有TMZ和Erastin的RGD环状肽(cRGD)修饰的脂质体(T+E@LPs-cRGD+GelMA)。cRGD可以识别肿瘤细胞过表达的ανβ3整合素受体以实现靶向治疗胶质母细胞瘤策略。Erastin激活铁死亡并与TMZ协同对耐药的GBM细胞表现出显著的抗肿瘤效果。另外,GelMA-脂质体递药系统通过IFN/PD-L1信号通路调节肿瘤免疫微环境,抑制术后胶质母细胞瘤复发。方法:将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2000-cRGD和Erastin以一定比例溶解在氯仿中,蒸发成膜,加入替莫唑胺溶液,经超声和脂质体挤出仪处理形成脂质体制剂。将合成的脂质体与GelMA溶液以一定比例混合,经3D打印光固化形成GelMA-脂质体系统。我们通过诱导筛选建立TMZ耐药细胞系U251TR和LN229TR。通过CCK-8、EdU、流式细胞术、Transwell实验及细胞划痕实验检测了不同纳米制剂对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过实时定量PCR(RT-qPCR)技术与Western Blot实验检测了铁死亡相关调控因子的表达量。通过谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)检测、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测、JC-1探针检测线粒体膜电位变化等实验检测了铁死亡的典型特征变化。RNA-Seq测序揭示了递药系统(T+E@LPs-cRGD+GelMA)参与的潜在机制,确定了 GelMA-脂质体系统通过IFN/PD-L1通路参与了胶质母细胞瘤的免疫调节。此外,我们通过建立原位脑胶质瘤动物模型对GelMA-脂质体系统体内抗肿瘤效果进行评价。结果:(1)水凝胶-脂质体纳米制剂的表征通过粒径电位检测仪、透射电镜对纳米粒进行理化表征,显示TNirmatrelvir+E@LPs-cRGD具有良好的球形纳米形态,平均水合粒径为164±3.05nm,平均电位为21.24±1.27mV,在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中 7 日内纳米粒径基本保持不变。傅里叶红外光谱表明脂质体成功载入水凝胶,T+E@LPs-cRGD+GelMA的总体平均杨氏模量约为500 kPa。(2)水凝胶-脂质体纳米制剂的释放与细胞摄取以U252TR、LN229TR、NHA细胞系为模型,通过细胞摄取实验证明cRGD介导的主动靶向显著提高了肿瘤细胞的药物摄取效率;将荧光染料Sulfo-Cyanine5.5(Cy5.5)装载入脂质体(LPs-cRGD+GelMA)可以在PBS中持续释放14天。动物活体成像观察荧光标记的Cy5.5@LPs-cRGD+GelMA在C57BL/6J小鼠颅内可以稳定存在14天。(3)T+E@LPs-cRGD+GelMA体外抗肿瘤效果评价通过EdU、流式细胞术、Transwell及细胞划痕实验证实T+E@LPs-cRGD+GelMA具有最佳降低细胞活力,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移和侵袭能力。(4)T+E@LPs-cRGD+GelMA 诱导铁死亡T+E@LPs-cRGD+GelMA通过诱导铁死亡,显著降低GPX4、xCT、MGMT的表达水平;GSH水平下降;MDA及ROS水平升高;与T+E@LPs-cRGD+GelMA共孵育的U52lTR与LN229TR细胞电镜下可观察到其线粒体萎缩,线粒体嵴减少或消失。(5)T+E@LPs-cRGD+GelMA参与调控肿瘤免疫RNA-seq测序筛选具有差异表达基因主要富集在干扰素相关通路。进一步实验证实T+E@LPs-cRGD+GelMA可以通过降低干扰素-γ(Interferon gamma,IFN-γ)的表达水平来逆转细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)的表达水平从而抑制GBM细胞免疫逃逸。(6)T+E@LPs-cRGD+GelMA体内抗肿瘤药效评价采用原位脑肿瘤小鼠为动物模型,手术减瘤后颅内给予不同治疗组。通过动物活体实验、苏木精伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色、免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色等实验表明T+E@LPs-cRGD+GelMA组有显著肿瘤抑制作用并使小鼠生存时间延长。免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测PD-LI组织表达水平降低。结论:本研究构建了一种用于颅内植入的新型3D打印水凝胶-脂质体纳米递药系统(T+E@LPs-cRGD+GelMA),实现了两种药物(TMZ和Erastin)共递送,提出了靶向清除残存GBM细胞的治疗Biomolecules策略。课题从细Alpelisib体外胞水平、分子水平、动物组织水平论证了 T+E@LPs-cRGD+GelMA递药系统可以诱导铁死亡,调控IFN/PD-L1信号通路,克服肿瘤细胞耐药。阐明了该递送系统能够协同调控肿瘤免疫微环境,有效抑制胶质瘤复发转移的分子生物学和免疫学调控机制。

目的:肝癌的死亡率仅次于胰腺癌,其中肝细胞癌是主要亚型。由于缺乏有效的早期诊断指标,患者往往在出现症状时已经晚期,导致预后极差。铁死亡是一种非凋亡形式的程序性细胞死亡方式,在肝细胞癌的发生和发展中扮演重要角色。本研究通过分析铁死亡相关的长链非编码RNAs(LncRNAs),构建了预后评估模型,用于评估肝细胞癌(HCC)患者预后生存期和对化疗药物敏感性差异。研究方法:1.数据下载:本研究从TCGA数据库下载HCC患者的表达数据和临床数据;从Ferr Db V2数据库和Gene Cards数据库下载铁死亡基因;从UCSC Xena数据库下载TCGA数据库中肝细胞癌患者无进展生存期的数据用于后续研究。2.筛选铁死亡相关lncRNAs:对样本中的铁死亡基因进行差异分析,筛选出差异表达的铁死亡基因,然后找出与铁死亡基因共表达的lncRNAs,再对lncRNAs进行差异分析,筛选出差异表达的铁死亡相关lncRNAs。3.构建铁死亡相关lncRNAs预后评估模型:对差异表达的铁死亡相关lncRNAs进行单因素COX回归分析,找到生存相关lncRNAs,然后进行LASSO-COX回归分析,构建铁死亡相关lncRNAs风险评估模型。4.验证lncRNAs高/低风险模型预测性能:对不同风险患者进行主成分分析;结合HCC患者的生存数据对患者的OS和PFS进行Kaplan-Meier生存分析;此外,对各因素进行单因素和多因素COX回归分析;绘制ROC曲线和C-index曲线比较各临床因素和预后评估模型的特异性和敏感性;绘制nomogram图把预后模型可视化;对不同风险的患者进行多重GSEA分析和ss GSEA分析。5.药物敏感性预测:本研究使用”Onco Predict”R包,根据癌症药物敏感性基因组学数据库(GDSC数据库)中癌细胞系对抗癌Dibutyryl-cAMP溶解度化合物的敏感性以及遗传或谱系特征,预测lncRNAs高/低风险模型患者对抗癌药物的药物敏感性。结果:1.从TCGA数据库获取了50例癌旁或正常样本以及374例HCC患者样本的表达数据和临床数据。对Ferr Db V2数据库和Gene Cards数据库的铁死亡基因进行交叉富集分析,得到187个铁死亡基因。148个铁死亡基因在样本中有表达,69个基因在肝细胞癌组织和正常或癌旁组织中的表达存在差异。经共表达分析,得到2118个铁死亡相关lncRNAs,其中1680个铁死亡相关lncRNAs在HCC患者中存在差异表达。2.本研究通过对差异表达的铁死亡相关lncRNAs进行LASSO-COX回归后,成功构建了Risk score=0.598969386·expr(NRAV)+0.818981106·expr(FAM182B)+0.440228024·expr(AC090772.3)+0.334809744·expr(AC092115.3)+2.080886975·expr(AC012313.86)+(-1.622946646)·expr(HOXB-AS1)的预后风险评估模型,用于预测HCC患者的预后生存期的情况。3.对肝细胞癌患者进行主成分分析,显示这6个铁死亡相关lnbiocontrol agentcRNAs的表达量可以有效区分不同风险的患者。Kaplan-Meier生存分析表明,风险评分和HCC患者的OS和PFS显著相关。单因素和多因素COX回归分析显示,风险评分可以作为独立于其他因素的预测指标。风险评分ROC曲线的AUC值依次为AUC_(1year)=0.765、AUC_(3year)=0.696、AUC_(5year)=0.680。4.多重GSEA分析显示,高风险组患者的基因主要富集在于癌症相关的通路中。ss GSEA分析显示,两组患者多种免疫细胞的浸润存在显著差异,低风险组患者的CD8~+T细胞、NK细胞和B细胞BAY 73-4506小鼠等免疫细胞的含量更高,高风险组患者的多种免疫检查点基因的表达量高于低风险患者。5.通过药物敏感性预测分析,发现低风险患者对Sorafenib更敏感,而高风险患者对Gemcitabine、Mitoxantrone、Camptothecin、Irinotecan、Topotecan和Ibrutinib等抗癌药物更敏感。结论:1.本研究发现由FAM182B、AC090772.3、AC092115.3、AC012313.86、HOXB-AS1和NRAV等6个铁死亡相关lncRNAs构成的风险评估模型可用于预测肝细胞癌患者的预后生存期。2.本研究发现,对于预测为低风险肝细胞癌患者,Sorafenib治疗可能有效;而预测为高风险肝细胞癌患者,Gemcitabine、Ibrutinib、Mitoxantrone、Camptothecin、Irinotecan、Topotecan治疗则可能更具潜力。