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【目的】探究Runt相关转录因子1(RUNX1)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)发生上皮细胞间质转化(EMT)的作用及机制。【方法】通过CCK-8法检测不同感染复数的热灭活金黄色葡萄球菌处理后对MAC-T细胞活力的影响；通过倒置显微镜观察经金黄色葡萄球菌处理后MAC-T细胞的形态变化。通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测金黄色葡萄球菌处理MAC-T细胞后，细胞中EMT标志分子(E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)、α平滑肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin))、TGF/Smad通路信号分子(TGF-β1、Smad2、Swww.selleck.cn/products/chir-99021-ct99021-hclmad3、Smad4)和RUNX1的表达量变化情况；并比较了分别使用RUNX1和TGF-β特异性抑制剂前后细胞EMT标志分子、TGF/Smad通路信号分子和RUNX1的表达水平变化。【结果】不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理72 h后，MAC-T细胞活力较24和48 h组均极显著下降(P<0.01),通过显微镜观察发现此时细胞出现漂浮死亡现象。因此后续观察细胞形态变化时设置时间为12、24、36和48 h。当用感染复数(MOI)为100热灭活金黄色葡萄球菌处理MADiabetes medicationsC-T细胞48 h后，细胞形态由上皮细胞典型的“鹅卵石”样转变为间质细胞的“长梭状”;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果发现，与正常细胞相比，EMT标志分子E-cadherin mRNA表达量极显著下调(P<0.01),Vimentin、α-SMA、N-cadherin、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和RUNX1 mRNA表selleckchem BMN 673达量显著或极显著上调(P<0.01);且Vimentin、α-SMA、P-Smad2和RUNX1蛋白表达量明显上调。经LY2109761抑制剂处理后，与感染组相比，2个抑制剂组MAC-T细胞中Smad2、Smad3、Smad4、N-cadherin、Vimentin、α-SMA和RUNX1的mRNA表达量均极显著下调(P<0.01),E-cadherin mRNA表达量极显著上调(P<0.01);经抑制剂Ro5-3335处理后，MAC-T细胞形态未出现显著的间质细胞样变化；与感染组相比，2个抑制剂Ro5-3335组细胞中E-cadherin的mRNA表达量极显著上调(P<0.01),N-cadherin、Vimentin、α-SMA(除10μmol/L Ro5-3335抑制剂组α-SMA外)、TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达水平均极显著降低(P<0.01)。【结论】热灭活金黄色葡萄球菌处理MAC-T细胞48 h可激活TGF/Smad通路诱导MAC-T细胞发生EMT变化；RUNX1可通过介导TGF/Smad通路调节金黄色葡萄球菌诱导的MAC-T细胞EMT过程。

研究背景:老龄化社会,老年人增加,随着年龄的增大,许多疾病患病率增高,接受手术麻醉的老年患者数量增加。老年手术患者对麻醉药物的耐受性降低,全身麻醉前长时间的禁食禁饮容易引起血容量的不足,全身麻醉诱导后容易出现较大的血流动力学波动。围术期低血压多发生在麻醉诱导后至手术开始前,称之为诱导后低血压。低血容量是诱发诱导后低血压常见的因素,改善容量状态的前提是准确评估容量状态。超声检查下腔静脉与容量状态有较好的相关性,下腔静脉塌陷指数(Collapse index of inferior vena cava,IVC-CI)作为无创、简便Hepatic glucose的容量评估技术,可用于预测全身麻醉诱导后低血压。本研究探讨全身麻醉诱导前以下腔静脉塌陷指数导向补液对老年患者诱导后低血压的影响。方法:纳入50例进行择期手术的老年患者,手术前30分钟于术前准备室予超声评估患者下腔静脉情况,测定下腔静脉直径,测量下腔静脉直径最大值(Maximum value of inferior vena cava,IVCmax)和最小值(Minimum value of inferior vena cava,IVCmin),计算下腔静脉塌陷指数 IVC-CI=(IVCmax-IVCmin)/IVCmax×100%。将下腔静脉塌陷指数≥43%的老年患者,随机分成快速补液组和对照组,快速补液组于诱导前30分钟予乳酸林格氏液12ml/kg快速扩容,每10分钟评估一次IVC-CI,直至IVC-CI<43%停止补液。对照组在患者在第一次下腔静脉超声评估完成后,不予输液。两组患者进入手术室开始麻醉诱导,记录诱导后(以诱导药物给予结束为准)至诱导后15分钟每分钟的心率、平均动脉血压和外周血氧饱和度。分析患者基线资料,比较两组患者Adezmapimod临床试验诱导后低血压的发生率和血管活性药物的使用率。采用重复测量方差分析比较两组患者诱导后平均动脉血压与心率的差异。以Spearman相关性分析快速补液组患者补液前后下腔静脉最大直径、下腔静脉最小直径、下腔静脉塌陷指数与补液量的相关性。结果:快速补液组和对照组患者在性别、年龄、身高、体重、血红蛋白、ASA分级、心功能分级,基础平均动脉压、基础心率差异、基础下腔静脉最大直径、基础下腔静脉最小直径、基础下腔静脉塌陷指数差异无统计学意义。快速补液组补液前后下腔静脉最大直径(1.54cPLX5622试剂m±0.13cm VS 1.72cm±0.11cm)、下腔静脉最小直径(0.80cm±0.09cm VS 1.03cm±0.08cm),下腔静脉塌陷指数(47.98%±3.30%VS 39.92%±2.40%)差异具有统计学意义。与对照组(72%)相比,快速补液组低血压发生率(32%)更低,差异具有统计学意义。快速补液组(20%)血管活性药物的使用率少于对照组(52%),差异具有统计学意义。全身麻醉诱导后,两组之间的心率差异无统计学意义,两组之间的两组之间的平均动脉血压差异具有统计学意义。补液前下腔静脉塌陷指数IVC-CI、补液前后下腔静脉最大直径变化量ΔIVCmax,补液前后下腔静脉最小直径变化量ΔIVCmin、补液前后下腔静脉塌陷指数变化量ΔIVC-CI与补液量存在相关性。结论:全身麻醉前以下腔静脉塌陷指数<43%为目标进行导向补液,可降低老年患者麻醉诱导后低血压的发生率,减少血管活性药物的使用。

目的 检测DCST1-AS1在非小细胞肺癌中的表达，并探讨其对癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 收集65例非小细胞肺癌患者的癌组织及其癌旁组织，体外培养正常人支气管上皮细胞16HBE和非小细胞肺癌细胞系（A549、H1299、H1650和HCC827）。RT-qPCR法检测组织和细胞中DCST1-AS1、miR-29b表达水平，并分析DCST1-AS1表达与非小细胞肺癌患者临Dental biomaterials床特征的相关性。将A549细胞分为对照组、si-NC组、si-DCST1-AS1组、si-DCST1-AS1+anti-NC组和si-DCST1-AS1+anti-miR-29b组。采用CCK-8法、克隆形成实验检测细胞增殖；Transwell检测细胞侵袭及迁移；Western blot检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达。结果 非小细胞肺癌组织和细胞中DCST1-AS1的表达均升高（P<0.05）,miR-29b的表达均降低（P<0.05）;DCST1-AS1的表达与非小细胞肺癌患者TNM分期、组织分化程度、淋巴结转移及病理类型有关（P<0.05）。与对照组或si-NC组比较，si-DCST1-AS1组A549细胞中DCST1-AS1表达、OD值、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数及Vimenti点击此处n、N-cadherin表达降低（P<0.05）,miR-29b、E-cadherin表达升高（P<0.05Fulvestrant体外）。敲低miR-29b可明显减弱下调DCST1-AS1表达对A549细胞恶性生物学行为的影响。结论 在非小细胞肺癌中DCST1-AS1呈高表达，敲低DCST1-AS1可能通过上调miR-29b表达抑制非小细胞肺癌细胞的恶性生物学行为。

FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)是治疗急性髓系白selleck HPLC血病(AML)的重要靶点。近年来在多数AML患者中发现了FLT3的过度表达和突变。因此本文进行了FLT3抑制剂的构效关系研究。主要研究内容如下:(1)FLT3抑制animal pathology剂的高低活性分类研究。收集了含有3867个人源野生型的FLT3抑制剂数据集。运用随机森林(RF)、支持向量机(SVM)、极致梯度提升树(XGBoost)、深度神经网络(DNN)和循环神经网络(RNN)算法共建立了39个定性分类模型。四个最优模型Model 3A(SVM模型)、Model 3C(SVM模型)、Model 3H(XGBoost模型)和Model 3L(DNN模型)对测试集的马修斯相关系数(MCC)在0.70到0.72之间,预测准确率(Q)在84.95%到85.83%之间;对外部测试集的MCC在0.70到0.82之间,预测准确率(Q)在85.05%到90.97%之间。(2)基于模型和聚类进行构效关系分析。计算了描述符的信息增益(IG)以及在高低活性抑制剂中的频率差异,发现2-氨基嘧啶、1-乙基六氢吡啶、2,4-双(甲基氨基)嘧啶等分子片段为高活性抑制剂中的重要片段。随后,结合决策树算法生成的树状图,通过描述符组合得到了2个高活性骨架和1个低活性骨架。除此之外,采用K-means聚类总结了FLT3抑制剂的骨架结构类型和代表性侧链特征。(3)FLT3抑制剂活性的定量预测研究。收集了411个放射性测定方法测定的FLT3抑制剂及其IC_(50)值。基于支持向量机(SVM)和随机森林(RF)两种算法共建Staurosporine molecular weight立了48个定量预测模型。最优模型Model 8G(RF模型)对测试集的决定系数(R~2)为0.715,均方根误差(RMSE)为0.557。对描述符分析后发现分子的相对分子质量、复杂度以及分子不饱和键数目与FLT3抑制剂活性的相关性较大。

目的 观察晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清胸苷激酶1(TK1)、分泌型蛋白Dikkopf-1(DKK1)水平，并分析血清TK1、DKK1与NSCLC治疗预后的关系。方法 该研究采用前瞻性队列研究方法，纳入2020年1月至2021年6月上海市第六人民医院金山分院收治的91例晚期NSCLC化疗患者为研究对象。所有患者入院时均接受血清TK1、DKK1水平检测，均在上海市第六人民医院金山分院完成4个化疗周期，并随访3个月，参照相关标准评价患者疾病缓解率，将完全缓解、部分缓解纳入预后良好组，将病变稳定、进展纳入预后不良组，比较两组血清TK1、DKK1水平，采用Logistic回归分析血清TK1、DKK1水平与晚期NSCLC患者治疗预后的关系。结果 91例晚期NSCLC化疗患者中，预后良好58例(63.74%);预后不良33例(36.26%);预后不良组血清癌胚抗原(CEA)、TK1、DKK1水平均高于预后良好组(P<0.05);CHIR-99021说明书采用Logistic回归分析，血清TK1、DKK1高水平是晚期NSCLC患者治疗预后不良的影响因素(OR>selleckchem LEE0111,P<0.05);绘制受试者工作特征曲线，结果显示，血清TK1、DKK1单独及联合预测晚期NSCLC患者预后不良的曲线下面积均>0.700,均有一定的预测价值，其中联合预测价值最高。结论 血清TK1、DKK1水平异常升高可能提示晚期NSCLC患者预后不良高风险，早期监测患者血清TK1、DKK1水平，对预测、评估Fusion biopsy患者治疗预后有一定积极意义。

目的:通过研究α-viniferin在抗高尿酸血症、对高尿酸血症引起的肾损伤的保护作用和抗痛风性关节炎方面的作用,探讨α-viniferin抗痛风的作用机制。方法:(1)将小鼠随机分为六组(n=10):正常对照组(Control组)、高尿酸血症组(HUA组)、别嘌呤醇组(ALLOP组)和α-viniferin的低剂量(VINIFL)、中剂量(VINIFM)和高剂量(VINIFH)组。建立氧嗪酸钾(PO)和次黄嘌呤(HX)诱导的高尿酸血症小鼠模型,探究α-viniferin的降尿酸作用及作用机制,结合转录组学分析其对高尿酸selleck合成血症引起的肾损伤的保护作用。检测指标包括:生化分析检测血清尿酸(SUA)、尿尿酸(UUA)、血清肌酐(SCRE)、尿肌酐(UCRE)、血清尿素氮(SBUN)水平,计算尿酸排泄指数(FEUA),血清和肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)活力。记录小鼠体重和计算小鼠脏器系数(肾脏系数、肝脏系数和脾脏系数)。Western blot检测肝脏中XOD蛋白和肾脏中葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)Fasciotomy wound infections、尿酸转运蛋白1(URAT1)、ATP转运蛋白G2(ABCG2)和有机阴离子转运蛋白1(OAT1)的表达。HE染色法观察肾脏组织病理学改变。转录组学分析肾脏保护作用的信号通路和关键机制,并通过RT-PCR对转录组基因进行验证。(2)将小鼠随机分为六组(n=10):正常对照组(Control组)、急性痛风性关节炎组(MSU组)、秋水仙碱组(COL组)和α-viniferin的低剂量(VINIFL)、中剂量(VINIFM)和高剂量(VINIFH)。采用足底注射MSU的方法建立尿酸钠(MSU)诱导的小鼠急性痛风性关节炎模型,探究α-viniferin的体内抗痛风作用,检测指标包括:采用游标卡尺测量不同组别小鼠足肿胀情况,ELISA法检测爪足组织中TNF-α以及IL-1β水平,HE染色法观察爪足组织病理学状态。用MSU诱导LPS致敏的THP-1细胞,建立体外痛风性关节炎模型,采用CCK-8法测定不同浓度α-viniferin对THP-1细胞的细胞毒性Trichostatin A说明书,以确定其安全性。PI染色法检测细胞膜完整性,ELISA法检测炎症因子(IL-1β、TNF-α)的分泌量,Western Blot法检测炎症相关蛋白(IL-1β、ASC、Caspase 1、NLRP3)的表达。结果:(1)生化分析结果显示,与Control组小鼠相比,HUA组小鼠的SUA水平显著升高(P<0.01),UUA水平显著(P<0.01)降低,SCRE水平显著(P<0.01)升高,UCRE水平显著(P<0.01)降低,SBUN水平显著升高(p>0.05),显著(P<0.01)抑制了FEUA,显著(P<0.01)升高肝脏和血清中XOD活性。与HUA组小鼠相比,,VINIFL、VINIFM和VINIFH组小鼠的SUA水平显著降低(P<0.05),VINIFH和VINIFM组UUA水平显著(P<0.01)升高,VINIFH组的SCRE水平显著(p>0.05)降低,VINIFM和VINIFH组尿肌酐UCRE水平显著(p>0.05)增加。此外,α-viniferin组以剂量依赖的方式显著(P<0.01)增加FEUA,α-viniferin组血清和肝脏中XOD活性显著(P<0.01)降低。小鼠体重和计算小鼠脏器系数结果显示,与Control组小鼠相比,别嘌呤醇组小鼠体重显著(P<0.01)下降,α-viniferin组对小鼠体重的增长没有影响(p>0.05),HUA组和ALLOP组肾脏系数(分别为1.48%,1.74%)显著(P<0.01)提高,α-viniferin各剂量组中肾脏系数无明显统计学差异(p>0.05)。Western blot显示,与Control组相比,HUA组XOD、GLUT9和URAT1的表达显著(P<0.01)上调,OAT1和ABCG2蛋白表达显著(P<0.01)下调,与HUA组相比,α-viniferin各剂量组的XOD、GLUT9和URAT1的表达显著(P<0.01)下调,OAT1和ABCG2蛋白表达显著(P<0.01)上调。HE染色结果显示,在HUA组中,观察到一些炎症细胞向肾小球浸润,HUA组出现重度肾水肿和肾小管严重扩张,并观察到大量炎症细胞向肾小球浸润,而α-viniferin各剂量组有不同程度的改善。通过转录组学分析,揭示了参与小鼠肾脏保护作用的关键机制与IL-17、趋化因子信号和PI3K-AKT信号通路有关。其中基因S100-A9(S100A9)、C-C趋化因子受体5型(CCR5)、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基5(PIK3R5)、toll样受体2亚型X1(TLR2)和整合素α-4前体(ITGA4)基因在给予α-viniferin后显著下调,表明其可能与α-viniferin保护高尿酸血症引起的肾损伤的机制有关。(2)小鼠急性痛风性关节炎模型结果表明:与Control组相比,造模后4h,MSU组小鼠足肿胀度显著增加(P<0.01),并在24h时足肿胀度达到最大值,同时爪足组织中的TNF-α和IL-1β水平明显增加(P<0.01),HE染色可观察到大量炎性细胞浸润。与MSU组相比,α-viniferin给药组能够显著降低小鼠足肿胀度(P<0.01或P<0.05),降低爪足组织中TNF-α和IL-1β水平(P<0.01或P<0.05),减少炎性细胞的浸润。MSU诱导LPS致敏的THP-1细胞构建体外痛风模型,对α-viniferin的抗痛风作用机制分析。结果表明:α-viniferin能够剂量依赖性的降低MSU诱导的体外痛风模型中IL-1β和TNF-α水平(P<0.01或P<0.05),并能够抑制IL-1β、ASC、Caspase-1和NLRP3蛋白的表达。同时α-viniferin能够改善该模型中细胞表面形态,减少PI染色细胞数。结论:α-Viniferin具有明显的抗高尿酸血症活性,并显著降低高尿酸症小鼠的血清尿酸水平,其发挥抗高尿酸血症的机制包括抑制XOD活性和下调XOD的蛋白表达从而抑制尿酸的产生,上调OAT1和ABCG2、下调GLUT9和URAT1蛋白的表达促进高尿酸血症小鼠的尿酸排泄。α-Viniferin减轻了小鼠的肾损伤,这表现为血清肌酐(SCRE)和血清尿素氮(SBUN)水平的降低,以及肾组织学的改善,其保护机制可能是通过调节IL-17、趋化因子和PI3K-AKT信号通路来逆转高尿酸血症引起的肾损伤。这表明α-viniferin是一种很有前途的抗高尿酸血症药物,具有较好的安全性。α-Viniferin可抑制痛风性关节炎,其机制可能与抑制炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌有关。同时,其机制还与保护细胞膜完整性、改善细胞形态、以及下调NLRP3,Caspase-1,ASC和IL-1β的蛋白表达有关。α-viniferin可能是治疗痛风性关节炎的有效药物。综上,α-viniferin可能是通过多靶点作用有效治疗痛风及高尿酸血症的药物。

目的:氟尿嘧啶类联合铂类(Fluoropyrimidine plus platinum,FP)与紫杉烷联合铂类(Taxanes plus platinum,TP)是食管癌(Esophageal cancer,EC)的标准治疗方法。本系统综述和Meta分析旨在探讨FP和TP方案在EC患者同步放化疗中的疗效和毒性差异。方法:通过全面搜索Pub Med、Embase和Cochrane数据库,查找从建库到截至2022年3月22日发表的应用FP和TP方案的同步放化疗食管癌患者的相关文章。采用Rev Man 5.3分析软件对相关结局指标进行统计学分析。结果采用相对危险度(Risk ratio,RR)及其95%可信区间(95%Confifence interval,95%CI)表示统计效应量。采用Stata 14.0版软件进行敏感性分析。结果:31篇文献纳入分析,共3432例患者。综合数据显示:在根治性同步放化疗(definitive chemoradiotherapy,d CRT)组:TP组的预后和疗效优于FP组(3年OS:RR:1.25,95%CI:1.08-1.44,P=0.003;selleck激酶抑制剂3年PFS:RR:1.43,95%CI:1.17-1.75,P=0.006;ORR:RStreptococcal infectionR:1.17,95%CI:1.06-1.29,P=0.001)。然而TP组的治疗与白细胞减少症和血小板减少症的发生显著相关(RR:1.28,9Alpelisib化学结构5%CI:1.05-1.58,P=0.02;RR:1.65,95%CI:1.02-2.68,P=0.04)。而在新辅助放化疗(neoadjuvant chemoradiotherapy,n CRT)组,TP组与FP组的生存率无明显差异(3年OS:RR:0.93,95%CI:0.82-1.05,P=0.26;3年PFS:RR:0.99,95%CI:0.86-1.13,P=0.84)。FP组病理完全缓解率优于TP组(RR:0.81,95%CI:0.68-0.96,P=0.02),而TP组的R0切除率更占优势(RR:1.06,95%CI:1.01-1.11,P=0.02)。FP组的血小板减少症的发病率较高(RR:0.33,95%CI:0.14-0.79,P=0.01),而TP方案与发热性白细胞减少症的发生显著相关(RR:1.78,95%CI:1.07-2.98,P=0.03)。结论:因此,对于接受d CRT的食管癌患者,TP方案可产生更好的临床反应和生存效益。两种治疗方案对接受n CRT的食管癌患者可产生相似的生存效益。

目的 研究黄芪注射液selleck合成对白血病患者化疗后免疫功能的影响，并Cell Biology对影响因素进行评价和分析。方法 将我院2016年1月至2019年1月收治的100例白血病患者以随机信封法平均分成黄芪组和对照组，对照组实施常规VDP方案化疗，黄芪组在对照组基础上增用黄芪注射液治疗。比较两组患者临床疗效、化疗前后免疫功能变化情况、生存质量评分以及不良反应发生情况，并采用Logistic回归分析影响白血病患者化疗后感染的相关因素。结果 黄芪组患者临床治疗总有效率及生存质量均明显高于对照组(P<0.05)。化疗后黄芪组患者CD3~+、CD4~+水平及CD4~+/CD8~+均明显高于对照组(P<0.05)。黄芪组患者恶心呕吐、多汗、出血以及感染的发生率均明显低于对照组(P<0.05)。进一步Logistic回归分析显示，年龄、免疫功能低下以及未使用黄芪注射液均是白血病患者化疗后感染的独立危险因素(P<0.05)。结论 黄芪注射液可有效提高白血病患者化疗效果，同时有效减轻化疗对患者免疫功能的影响，降低化疗相关不良反应发生风险。此外，年龄的NVP-TNKS656纯度增加、免疫功能的下降以及未使用黄芪注射液均会增加患者化疗后感染发生的几率，值得临床重点关注。

目的:通过对气阴两虚型类风湿关节炎患者的临床资料、中医证候特点及合并症的回顾性分析,探讨本证型与患者年龄、性别、病程、临床表现、疾病活动度、实验室指标、合并疾病等的相关关系,并与其他证型进行比较,为气阴两虚型Air medical transport类风湿关节炎的中医辨证治疗提供一定的循证医学证据;通过网络药理学方法,探讨益气养阴通络方治疗类风湿关节炎作用机制;通过应用动物实验的方法,评价益气养阴通络方治疗类风湿关节炎大鼠疗效,并基于TNF-α/MAPK/JNK信号通路探讨本方的作用机制。材料与方法:1.临床观察:收录2019.01-2021.06于辽宁中医药大学附属医院风湿科住院的类风湿关节炎患者共237例,主要观察项目为:⑴一般情况:性别、年龄、病程;⑵临床表现:关节症状:关节压痛数、关节肿胀数;全身症状:口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多等;⑶实验室指标及相关检查:炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)、疾病活动度((DAS28评分);⑷合并疾病:骨质疏松症、骨性关节炎、肺间质改变、干燥综合征及2型糖尿病。应用SPSS 22.0统计学软件对各结果进行分析比较。2.网络药理学研究:通过中药系统药理学数据库(TCMSP)与分析平台和本草组鉴数据库(HERB),并结合文献筛选成分靶点,补充未检索到的化学成分并查找相应作用靶点,并应用Uniport数据库将靶点信息标准化,使用CytoscaKPT-330溶解度pe3.9.1软件构建”药物-活性成份-靶点”关系图,并根据网络拓扑参数筛选出中药治疗的重要活性成分。通过Gene Cards、TTD、OMIM、Pharm Gkb和Drug Bank数据库获得类风湿关节炎疾病的相关靶点基因,绘制韦恩图并获取益气养阴通络方与类风湿关节炎的共同靶点,通过String数据库将获得的共同靶点进行蛋白质相互作用网络分析,并根据网络拓扑参数获得益气养阴通络方治疗类风湿关节炎的核心靶点,通过对GO生物功能和KEGG信号通路富集分析的研究,筛选益气养阴通络方发挥治疗类风湿关节炎作用的相关信号通路。3.动物实验:制备类风湿关节炎CIA大鼠模型,选取50只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(CON组),模型组(CIA组),益气养阴通络方组(TCM组),甲氨蝶呤组(MTX组)和益气养阴通络方汤剂加甲氨蝶呤组(TCM+MTX组),每组10只。持续给药8周后取血清及关节滑膜组织。观察大鼠一般状态、关节肿胀度和关节炎指数变化,制备大鼠关节病理切片并检测血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和白介素-17(IL-17)MDV3100作用水平评价大鼠关节炎症状态。运用Western blot和QPCR方法分别检测大鼠滑膜组织中TNF-a、MAPK、JNK、P-JNK蛋白表达情况以及TNF-a、MAPK、IL-1β、IL-6基因表达情况。结果:1临床研究结果:⑴气阴两虚型RA与性别、年龄关系不明显,而病程与气阴两虚型呈正相关,气阴两虚型患者较非气阴两虚型患者病程更长。⑵炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)与气阴两虚型RA的相关性不明显。⑶气阴两虚型RA与关节压痛数关系不明显,与关节肿胀数、疾病活动度呈负相关,气阴两虚型RA患者关节肿胀数、疾病活动度均低于非气阴两虚型。⑷气阴两虚型RA患者较非气阴两虚型患者更易伴发骨质疏松症、肺间质改变、干燥综合征,与骨性关节炎和2型糖尿病相关性不明显。⑸气阴两虚型较非气阴两虚型RA临床特点上更易出现口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多症状。2.网络药理学研究结果:⑴益气养阴通络方治疗RA的”药物-活性成分-靶点”结果显示槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素等成分是益气养阴通络方治疗RA的主要活性成分⑵益气养阴通络方活性成分治疗RA所调控的靶点互作网络显示PTGS2、PTGS1、TNF、JUN、IL-6、MAPK1、IL-1β、AKT1等是该网络的关键靶点,其很可能在益气养阴通络方治疗RA的过程中发挥主要作用。⑶益气养阴通络方治疗RA的关键靶点GO功能富集显示,益气养阴通络方可能通过信号转导、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、炎症反应、对脂多糖的反应等生物学过程来治疗RA,其靶点大部分在质膜、细胞液、细胞质、细胞外间隙、细胞表面、膜筏等处,具有酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质结合、蛋白激酶活性、血红素结合、内肽酶活性等分子功能。KEGG结果表明益气养阴通络方通过干预癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路等信号通路,达到治疗RA的作用。3.动物实验研究结果⑴益气养阴通络方可以显著改善RA大鼠关节肿胀程度,并从HE染色可以观察出大鼠关节内部有效缓解炎性细胞浸润、滑膜组织增生、血管翳形成以及软骨组织破坏。并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。⑵通过ELISA检测的实验结果可知,益气养阴通络方可以降低RA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17表达,调节炎症因子水平,达到控制炎症的作用,并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。⑶从Western blot和Q-PCR检测的实验结果可知,本实验造模动物为RA大鼠模型,在靶蛋白分析相关结果中找到大量的MAPK相关蛋白,证明由于TNF-α/MAPK/JNK信号通路被激活引起炎症反应,形成类风湿关节炎。益气养阴通络方可以降低RA大鼠滑膜组织中的TNF-a、MAPK、JNK、P-JNK蛋白表达水平和TNF-a、MAPK、IL-1β、IL-6m RNA的表达水平,并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。证明益气养阴通络方可以通过TNF-α/MAPK/JNK信号通路,发挥治疗RA的作用。结论:1.气阴两虚型RA与性别、年龄、炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)、关节压痛数关系不明显,与病程呈正相关,与关节肿胀数、疾病活动度呈负相关,并且气阴两虚型RA患者较非气阴两虚型患者更易伴发骨质疏松症、肺间质改变、干燥综合征,与骨性关节炎和2型糖尿病相关性不明显。在临床症状方面,气阴两虚型RA较非气阴两虚型更易出现口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多症状。2.采用网络药理学的方法与技术,预测出益气养阴通络方发挥作用的活性成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素等,其作用的靶点可能为PTGS2、PTGS1、TNF、JUN、IL-6、MAPK1、IL-1β、AKT1等,通过GO富集分析和KEGG通路分析发现,其作用的通路可能是通过调控癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路等多条途径,故益气养阴通络方治疗RA是通过多成分、多靶点、多通路实现。3.结合网络药理学结果,通过制备CIA大鼠模型,应用动物实验的方法对治疗RA作用机制进行最终验证。通过对组织、蛋白和基因表达等多层面的分析,表明了益气养阴通络方通过作用于TNF-α/MAPK/JNK信号通路,下调TNF-α/MAPK/JNK信号通路的活性,从而降低炎症因子,改善炎症反应,最终达到治疗RA的目的,且益气养阴通络方联合甲氨蝶呤治疗效果更好。

核酸修复酶包括DNA修复酶和RNA修复酶,是生物体内自发表达的蛋白酶,能够识别并修复由紫外线(ultraviolet,UV)、电离辐射、毒性化学品以及活性氧物种等因素导致的DNA/RNA损伤。核酸修复酶的异常表达与癌症息息相关。低活性的核酸修复酶能够促进癌症发生与发展,而高表达的核酸修复酶能够使癌细胞维持无限增殖能力。因此,核酸修复酶是一种癌症早期筛查中极具代表性的生物标志物。此外,抑制核酸修复酶的活性可以更好地提高对癌症的治疗效果,使其成为癌症治疗的重要靶点。因此,开发针对核酸修复酶活性的检测方法在临床早期诊断,癌症治疗和抗癌药物研发中具有重要意义。本论文将核酸扩增与化学发光和荧光等技术相结合,选择O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)、脂肪量和肥胖相关的酶(the fat mass and obesity-associated enzyme,FTO)、人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(human alkyladenine DNA glycosylase,h AAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycoFUT-175sylase,UDG)为研究模型,发展了一系列生物传感器,实现了对癌细胞或者癌症组织中的核酸检测酶的活性检测。本论文主要内容如下:1.fluoride-containing bioactive glass基于在完全等温条件下(37℃)外切酶III(exonuclease III,Exo III)辅助的信号扩增,我们开发了一种简单快速的一步反应的荧光生物传感器,用于灵敏地检测MGMT的活性。封闭的哑铃探针被MGMT去甲基化后,内切酶Pvu II切割哑铃探针,产生带有3’羟基(3’hydroxyl,3-OH)端的发卡探针。随后,EXO III消化发卡探针,产生长的引物DNA,引物DNA能作为长模板,触发EXO III对修饰了BHQ和Cy5的信号探针的循环消化,从而产生明显增强的荧光信号。该方法非常简单、快速(60分钟),具有超高的灵敏度和良好的特异性,可以在单细胞水平上检测MGMT的活性。此外,该方法还可用于MGMT抑制剂的筛选和不同癌细胞中MGMT活性的区分。2.通过整合PARP-1介导的聚合超支化聚(ADP-核糖)(poly(ADP-ribose),PAR)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)-3-(2’-螺旋氨甲烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰苯基)-1,2-二氧杂环丁烷(3-(2’-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3‖-phosphoryloxyphenyl)-1,2-diox etane,AMPDD)化学发光系统,我们构建了一个超灵敏的化学发光生物传感器,用于快速检测人类乳腺组织中的PARP-1。PARP-1被双链DNA(double-stranded DNA,ds D NA)激活后,PARP-1裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+),启动生物素(biotin)化ADP-核糖的重复聚合,形成ds DNA-PAR-biotin复合物。随后,ds DNA-PAR-biotin复合物通过Au-S共价键组装到金纳米颗粒(Au nanoparticles,Au NPs)上,从而构建出Au NPs-ds DNA-生物素纳米结构。Au NPs-ds DNA-biotin纳米结构随后捕获链霉亲和素(streptavidin,SA)修饰的ALP以形成Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构。离心分离后,Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构引发AMPPD的去磷酸化,从而产生极高的化学发光信号。在这个实验中,只有PARP-1被ds DNA激活才能裂解NAD~+,有效地消除了Dehydrogenase抑制剂背景信号。冷冻法的引入大大缩短了检测时间。由于PARP-1催化NAD~+裂解的高精度、biotin化ADP-核糖聚合反应的高效率、以及ALP-AMPPD化学发光系统的高信噪比,该生物传感器可以快速灵敏地检测PARP-1,检测限为2.94×10-7 U/μL,准确筛选PARP-1抑制剂,并在单细胞水平上对PARP-1进行量化。最重要的是,该方法可以区分乳腺癌患者组织和健康人组织之间的PARP-1表达,在临床诊断和生物医学研究中具有广阔的应用前景。3.我们开发了一种无荧光团标记的超支链置换扩增方法,用于灵敏检测癌细胞中的FTO活性。当FTO存在时,能够催化N~6-甲基腺嘌呤(N~6-methyladenine,m~6A)修饰的ds DNA底物的去甲基化,从而引发甲基化敏感内切酶Pvu II对ds DNA的裂解,产生带有3-OH末端的ss DNA。带有3-OH的ss DNA被末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,Td T)延长,形成―X-(XXX)_n‖型模板,用于随后的超支链置换扩增。最后,在聚合酶和切口酶的辅助下进行超支化链置换扩增,产生大量的寡核苷酸片段,这些片段可以用核酸染料SYBR Gold染色,产生增强的荧光信号。该检测方法表现出良好的特异性和高灵敏度,对FTO的检测限为9.07×10~(-11) mg/m L(～1.5 f M)。此外,该方法可以有效地筛选FTO抑制剂,并检测单个癌细胞中的FTO活性。4.我们构建了一种用于多重检测癌细胞中h AAG和UDG的去磷酸化介导的化学发光生物传感器。在该生物传感器中,化学发光信号依赖于ALP催化下AMPPD的脱磷酸化。我们设计了一种双功能的ds DNA基底,一个biotin标记的聚-(T)探针,以及两个用于h AAG和UDG的捕获探针。该方法涉及以下4个步骤:(1)DNA糖基化酶诱导双功能ds DNA基底的裂解;(2)Td T识别引物的3-OH末端进行Td T介导的聚合反应;(3)构建Au NPs-ds DNA-ALP纳米结构;(4)ALP引发AMPPD的去磷酸化以产生增强的化学发光信号。通过利用Td T介导的聚合扩增的独特功能和基于ALP-AMPPD的化学发光系统的内在优势,该生物传感器表现出良好的特异性和高灵敏度,对h AAG的检测限为1.53×10~(-6) U/m L,对UDG检测限为1.77×10~(-6) U/m L,并且可以在单细胞水平上量化多种DNA糖基化酶。此外,这种生物传感器还可用于测量动力学参数和筛选DNA糖基化酶抑制剂,在DNA损伤相关的医学研究和疾病诊断方面具有巨大潜力。