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研究目的通过生物信息学和网络药理学虚拟筛选四逆加人参汤(SNRS)治疗急性肝衰竭(ALF)的众多靶点中与糖酵解相关的关键靶基因和关键通路,并对关键靶基因进行免疫浸润分析,为SNRS通过影响糖代谢重编程调控巨噬细胞极化状态发挥治疗效应提供理论基础,并为后续实验设计提供参考思路;进一步通过腹腔注射LPS/D-Gal N构建小鼠ALF模型,开展SNRS治疗ALF的药效学研究,并观察SNRS对肝巨噬细胞亚型浸润情况的影响,验证SNRS治疗ALF的有效性及其对肝巨噬细胞极化状态的调控作用;最后制备并筛选最佳浓度SNRS含药血清,与LPS共处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,并基于m TOR/HIF-1α通路探讨SNRS含药血清对LPS诱导活化的巨噬细胞的能量代谢方式及极化状态的影响。为SNRS通过干预免疫代谢重塑巨噬细胞极化状态以治疗ALF提供科学依据。研究方法第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台下的基因表达综合数据库(GEO)收集乙肝相关性急性肝衰竭(HBV-ALF)、对乙酰氨基酚相关性急性肝衰竭(APAP-ALF)的人体肝组织芯片数据,并对二者各自所表达的差异基因进行筛选;随后,与糖酵解相关基因、SNRS效应靶基因进行取交集处理,从而获得SNRS通过作用于糖酵解干预ALF的潜在靶基因,并对其进行基因功能注释;最bioactive nanofibres后,对比分析ALF和正常肝组织中免疫细胞浸润情况,并将最终获取的靶基因表达水平与ALF肝组织免疫细胞浸润程度进行相关性分析。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究采用随机数字表法,将63只ICR小鼠随机分成空白组、模型组、中药组,每组各21只。模型组与中药组均单次腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg),而空白组予以单次腹腔注射等量生理盐水。中药组小鼠分别于造模前48h、24h以及造模后10min予以“四逆加人参汤”灌胃处理,而空白组和模型组于相同时间点予以生理盐水灌胃处理。于注射造模剂后8h,每组随意取6只用于样本取材及标本检测,每组余下的15只小鼠进行生存率分析。实验过程中,观察并记录造模后各组小鼠的精神状态、毛发状况、饮食及二便情况。利用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST;采用ELISA测定TNF-α、HMGB-1、IL-1β、IL-6及IL-10;对肝组织切片进行HE染色,观察肝组织病理学变化;采用免疫荧光染色观察肝组织中M1型、M2型巨噬细胞浸润情况。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选采用随机数字表法将20只SD大鼠分为SNRS组和空白组,每组10只。SNRS组灌服中药,空白组灌服等体积生理盐水。每日给药2次,连续给药3d,末次给药1h后采血。采血后对大鼠全血进行离心、灭活、除菌,制得SNRS含药血清。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中,加入LPS100ng/ml以诱导RAW264.7细胞向M1型极化。采用CCK8法检测不同浓度的空白血清、含药血清对正常培养的RAW264.7细胞及LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响,并根据结果设置高、中、低三个血清浓度,用于后续最佳浓度筛选。采用高、中、低浓度含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞24h后,采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α浓度,比色法检测LD释放量,Western Blot法检测m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达水平。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于96孔板中。利用CCK8法检测MHY1485、Rapamycin对未经LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响;检测10%含药血清、10%含药血清+MHY1485、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于6孔板中,共设置5个实验分组:(1)空白组;(2)模型组;(3)LPS+含药血清组;(4)LPS+含药血清+m TOR激动剂组;(5)LPS+空白血清+m TOR抑制剂组。药物处理24h后,利用光镜观察细胞形态;流式细胞仪检测分析M1(CD86+CD206)、M2(CD86-CD206+)细胞亚群的比例;WB检测细胞m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达;ELISA检测细胞上清IL-1β、TNF-α及IL-10水平,ELISA检测细胞提取液中HK2、PFK-1、PKM2及LDHA浓度;比色法检测细胞上清LD含量,比色法检测细胞提取液中Ac-Co A、ATP水平。此外,使用透射电镜观察空白组、模型组及LPS+含药血清组细胞超微结构。研究结果第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析本研究收VX-445生产商集了2个HBV-ALF的表达谱芯片数据集(GSE38941、GSE14668)和1个APAP-ALF的表达谱芯片数据集(GSE120652)。利用韦恩图在线工具将APAPALF差异表达基因集、合并的HBV-ALF差异表达基因集、糖酵解基因集以及SNRS作用靶基因集进行取交集处理;筛选出SNRS调控糖酵解治疗HBV-ALF的作用靶基因共有5个,分别为己糖激酶2(HK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1);APAP-ALF并未获得类似基因。HBV-ALF组相较于正常组,HK2、CDK1表达上调,而SOD1、VEGFA和GOT1表达下调。对5个作用靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,GO分析结果显示生物过程(BP)主要涉及“对铜离子的响应”、“细胞衰老”、“对镉离子的响应”、“对轴突损伤的反应”、“卵泡发育”等;细胞成分(CC)主要富集在线粒体。KEGG富集通路主要集中在缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、碳代谢等。免疫浸润差异分析提示HBV-ALF肝组织中免疫细胞浸润水平较正常肝组织明显增加。HBV-ALF肝组织中浸润的免疫细胞主要包括树突状细胞、中性粒细胞、M2型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M0型巨噬细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞等。对5个作用基因与HBV-ALF肝组织更多中浸润的主要免疫细胞进行相关性分析,结果提示SNRS可以通过作用靶基因影响免疫细胞浸润。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究经腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg)诱导构建的ICR小鼠ALF模型,一般情况差,24h死亡率达80%。与空白组相比,ALT、AST水平明显升高;TNF-α、HMGB-1、IL-1β和IL-6的释放明显增加;肝组织病理学损伤严重;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显增加,M2型巨噬细胞标志物CD163表达相对增加。经SNRS处理的ALF小鼠,一般情况改善,24h死亡率为26.7%。与模型组相比,ALT、AST水平明显降低;TNF-α、HMGB-1及IL-1β释放明显减少,IL-6水平呈下降趋势,而IL-10表达水平明显增加;肝组织病理学损伤减轻;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显减少,M2型巨噬细胞标志物CD163表达明显增加。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选相同稀释浓度下的空白血清与含药血清对正常培养的RAW264.7细胞进行处理,两组细胞活力的组间差异无统计学意义。各稀释浓度(2.5%、5%、10%、15%及20%)的含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞,均可以降低细胞增殖活力。15%、20%浓度的空白血清可以降低LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力。选择2.5%、5%、10%的梯度浓度用于后续最佳含药血清浓度的筛选。SNRS含药血清呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子IL-1β、TNF-α,并减少了糖酵解代谢产物LD的生成。LPS诱导状态下的RAW264.7巨噬细胞m TOR/HIF-1α通路相关蛋白表达明显增加,而SNRS含药血清呈剂量依赖性降低p-m TOR/m TOR比值及HIF-1α蛋白相对表达量。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态MHY1485、Rapamycin对RAW264.7细胞增殖活力无明显影响。电镜结果显示模型组相较于空白组,细胞线粒体出现了严重肿胀,而SNRS含药血清可以有效改善线粒体肿胀程度。光镜及流式细胞仪结果提示,LPS诱导RAW264.7细胞活化后,M1型、M2型巨噬细胞增多;与模型组相比,含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞后,M1极化细胞减少,M2极化细胞增多;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清对M1型、M2型极化分布的影响。模型组IL-1β、TNF-α表达水平明显增加,IL-10具有增高趋势;含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可以抑制IL-1β、TNF-α表达,并显著升高IL-10水平;而MHY1485可以逆转含药血清的抗炎效应。模型组p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量显著升高;使用含药血清、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞进行干预后,p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量明显降低;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清降低p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量的作用。模型组HK2、PFK1、LDHA表达水平明显升高,细胞上清中LD含量显著增加;使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可使HK2、PFK1、LDHA表达水平明显下降,细胞上清中LD含量显著减少;而MHY1485可以逆转含药血清的调控效应。与空白组比较,模型组RAW264.7细胞中Ac-Co A、ATP含量明显减少;与模型组相比,使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,Ac-Co A、ATP含量显著增加;而在含药血清基础上加用MHY1485,AcCo A、ATP含量比单用含药血清明显降低。结论SNRS可以改善ALF小鼠一般状况,提高生存率,降低转氨酶水平,调控炎症介质释放,改善病理学组织损伤,影响肝巨噬细胞亚型浸润分布。肝巨噬细胞作为肝脏固有免疫系统的重要组成部分,参与了ALF发病过程中的免疫损伤。SNRS可以通过调控m TOR/HIF-1α信号通路,抑制HK2、PFK1、LDHA表达,减少LD分泌,增加Ac-Co A生成,促进ATP合成,改善免疫代谢;抑制M1型巨噬细胞激活,促进M2型巨噬细胞活化,重塑巨噬细胞极化状态;降低促炎因子IL-1β、TNF-α表达,增加抗炎因子IL-10分泌,积极发挥抗炎、促修复作用。此外,SNRS还可以保护RAW264.7细胞线粒体结构,维持其线粒体功能。

研究目的通过生物信息学和网络药理学虚拟筛选四逆加人参汤(SNRS)治疗急性肝衰竭(ALF)的众多靶点中与糖酵解相关的关键靶基因和关键通路,并对关键靶基因进行免疫浸润分析,为SNRS通过影响糖代谢重编程调控巨噬细胞极化状态发挥治疗效应提供理论基础,并为后续实验设计提供参考思路;进一步通过腹腔注射LPS/D-Gal N构建小鼠ALF模型,开展SNRS治疗ALF的药效学研究,并观察SNRS对肝巨噬细胞亚型浸润情况的影响,验证SNRS治疗ALF的有效性及其对肝巨噬细胞极化状态的调控作用;最后制备并筛选最佳浓度SNRS含药血清,与LPS共处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,并基于m TOR/HIF-1α通路探讨SNRS含药血清对LPS诱导活化的巨噬细胞的能量代谢方式及极化状态的影响。为SNRS通过干预免疫代谢重塑巨噬细胞极化状态以治疗ALF提供科学依据。研究方法第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台下的基因表达综合数据库(GEO)收集乙肝相关性急性肝衰竭(HBV-ALF)、对乙酰氨基酚相关性急性肝衰竭(APAP-ALF)的人体肝组织芯片数据,并对二者各自所表达的差异基因进行筛选;随后,与糖酵解相关基因、SNRS效应靶基因进行取交集处理,从而获得SNRS通过作用于糖酵解干预ALF的潜在靶基因,并对其进行基因功能注释;最bioactive nanofibres后,对比分析ALF和正常肝组织中免疫细胞浸润情况,并将最终获取的靶基因表达水平与ALF肝组织免疫细胞浸润程度进行相关性分析。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究采用随机数字表法,将63只ICR小鼠随机分成空白组、模型组、中药组,每组各21只。模型组与中药组均单次腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg),而空白组予以单次腹腔注射等量生理盐水。中药组小鼠分别于造模前48h、24h以及造模后10min予以“四逆加人参汤”灌胃处理,而空白组和模型组于相同时间点予以生理盐水灌胃处理。于注射造模剂后8h,每组随意取6只用于样本取材及标本检测,每组余下的15只小鼠进行生存率分析。实验过程中,观察并记录造模后各组小鼠的精神状态、毛发状况、饮食及二便情况。利用全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST;采用ELISA测定TNF-α、HMGB-1、IL-1β、IL-6及IL-10;对肝组织切片进行HE染色,观察肝组织病理学变化;采用免疫荧光染色观察肝组织中M1型、M2型巨噬细胞浸润情况。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选采用随机数字表法将20只SD大鼠分为SNRS组和空白组,每组10只。SNRS组灌服中药,空白组灌服等体积生理盐水。每日给药2次,连续给药3d,末次给药1h后采血。采血后对大鼠全血进行离心、灭活、除菌,制得SNRS含药血清。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中,加入LPS100ng/ml以诱导RAW264.7细胞向M1型极化。采用CCK8法检测不同浓度的空白血清、含药血清对正常培养的RAW264.7细胞及LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响,并根据结果设置高、中、低三个血清浓度,用于后续最佳浓度筛选。采用高、中、低浓度含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞24h后,采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α浓度,比色法检测LD释放量,Western Blot法检测m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达水平。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于96孔板中。利用CCK8法检测MHY1485、Rapamycin对未经LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响;检测10%含药血清、10%含药血清+MHY1485、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞,接种于6孔板中,共设置5个实验分组:(1)空白组;(2)模型组;(3)LPS+含药血清组;(4)LPS+含药血清+m TOR激动剂组;(5)LPS+空白血清+m TOR抑制剂组。药物处理24h后,利用光镜观察细胞形态;流式细胞仪检测分析M1(CD86+CD206)、M2(CD86-CD206+)细胞亚群的比例;WB检测细胞m TOR、p-m TOR及HIF-1α的表达;ELISA检测细胞上清IL-1β、TNF-α及IL-10水平,ELISA检测细胞提取液中HK2、PFK-1、PKM2及LDHA浓度;比色法检测细胞上清LD含量,比色法检测细胞提取液中Ac-Co A、ATP水平。此外,使用透射电镜观察空白组、模型组及LPS+含药血清组细胞超微结构。研究结果第一部分四逆加人参汤调控糖酵解治疗ALF潜在靶基因的免疫浸润分析本研究收VX-445生产商集了2个HBV-ALF的表达谱芯片数据集(GSE38941、GSE14668)和1个APAP-ALF的表达谱芯片数据集(GSE120652)。利用韦恩图在线工具将APAPALF差异表达基因集、合并的HBV-ALF差异表达基因集、糖酵解基因集以及SNRS作用靶基因集进行取交集处理;筛选出SNRS调控糖酵解治疗HBV-ALF的作用靶基因共有5个,分别为己糖激酶2(HK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1);APAP-ALF并未获得类似基因。HBV-ALF组相较于正常组,HK2、CDK1表达上调,而SOD1、VEGFA和GOT1表达下调。对5个作用靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,GO分析结果显示生物过程(BP)主要涉及“对铜离子的响应”、“细胞衰老”、“对镉离子的响应”、“对轴突损伤的反应”、“卵泡发育”等;细胞成分(CC)主要富集在线粒体。KEGG富集通路主要集中在缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、碳代谢等。免疫浸润差异分析提示HBV-ALF肝组织中免疫细胞浸润水平较正常肝组织明显增加。HBV-ALF肝组织中浸润的免疫细胞主要包括树突状细胞、中性粒细胞、M2型巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M0型巨噬细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞等。对5个作用基因与HBV-ALF肝组织更多中浸润的主要免疫细胞进行相关性分析,结果提示SNRS可以通过作用靶基因影响免疫细胞浸润。第二部分四逆加人参汤对LPS/D-Gal N诱导的急性肝衰竭模型的药效学研究经腹腔注射D-Gal N(800mg/Kg)+LPS(20μg/Kg)诱导构建的ICR小鼠ALF模型,一般情况差,24h死亡率达80%。与空白组相比,ALT、AST水平明显升高;TNF-α、HMGB-1、IL-1β和IL-6的释放明显增加;肝组织病理学损伤严重;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显增加,M2型巨噬细胞标志物CD163表达相对增加。经SNRS处理的ALF小鼠,一般情况改善,24h死亡率为26.7%。与模型组相比,ALT、AST水平明显降低;TNF-α、HMGB-1及IL-1β释放明显减少,IL-6水平呈下降趋势,而IL-10表达水平明显增加;肝组织病理学损伤减轻;肝组织中M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显减少,M2型巨噬细胞标志物CD163表达明显增加。第三部分四逆加人参汤重塑巨噬细胞极化状态体外实验研究实验一四逆加人参汤含药血清制备及浓度筛选相同稀释浓度下的空白血清与含药血清对正常培养的RAW264.7细胞进行处理,两组细胞活力的组间差异无统计学意义。各稀释浓度(2.5%、5%、10%、15%及20%)的含药血清处理LPS诱导活化的RAW264.7细胞,均可以降低细胞增殖活力。15%、20%浓度的空白血清可以降低LPS诱导活化的RAW264.7细胞增殖活力。选择2.5%、5%、10%的梯度浓度用于后续最佳含药血清浓度的筛选。SNRS含药血清呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子IL-1β、TNF-α,并减少了糖酵解代谢产物LD的生成。LPS诱导状态下的RAW264.7巨噬细胞m TOR/HIF-1α通路相关蛋白表达明显增加,而SNRS含药血清呈剂量依赖性降低p-m TOR/m TOR比值及HIF-1α蛋白相对表达量。实验二四逆加人参汤调控m TOR/HIF-1α信号通路影响糖代谢重编程重塑巨噬细胞极化状态MHY1485、Rapamycin对RAW264.7细胞增殖活力无明显影响。电镜结果显示模型组相较于空白组,细胞线粒体出现了严重肿胀,而SNRS含药血清可以有效改善线粒体肿胀程度。光镜及流式细胞仪结果提示,LPS诱导RAW264.7细胞活化后,M1型、M2型巨噬细胞增多;与模型组相比,含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞后,M1极化细胞减少,M2极化细胞增多;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清对M1型、M2型极化分布的影响。模型组IL-1β、TNF-α表达水平明显增加,IL-10具有增高趋势;含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可以抑制IL-1β、TNF-α表达,并显著升高IL-10水平;而MHY1485可以逆转含药血清的抗炎效应。模型组p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量显著升高;使用含药血清、Rapamycin对LPS诱导活化的RAW264.7细胞进行干预后,p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量明显降低;而在含药血清基础上加用MHY1485,可以逆转含药血清降低p-m TOR/m TOR比值、HIF-1α相对表达量的作用。模型组HK2、PFK1、LDHA表达水平明显升高,细胞上清中LD含量显著增加;使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,可使HK2、PFK1、LDHA表达水平明显下降,细胞上清中LD含量显著减少;而MHY1485可以逆转含药血清的调控效应。与空白组比较,模型组RAW264.7细胞中Ac-Co A、ATP含量明显减少;与模型组相比,使用含药血清、Rapamycin处理LPS诱导的RAW264.7细胞,Ac-Co A、ATP含量显著增加;而在含药血清基础上加用MHY1485,AcCo A、ATP含量比单用含药血清明显降低。结论SNRS可以改善ALF小鼠一般状况,提高生存率,降低转氨酶水平,调控炎症介质释放,改善病理学组织损伤,影响肝巨噬细胞亚型浸润分布。肝巨噬细胞作为肝脏固有免疫系统的重要组成部分,参与了ALF发病过程中的免疫损伤。SNRS可以通过调控m TOR/HIF-1α信号通路,抑制HK2、PFK1、LDHA表达,减少LD分泌,增加Ac-Co A生成,促进ATP合成,改善免疫代谢;抑制M1型巨噬细胞激活,促进M2型巨噬细胞活化,重塑巨噬细胞极化状态;降低促炎因子IL-1β、TNF-α表达,增加抗炎因子IL-10分泌,积极发挥抗炎、促修复作用。此外,SNRS还可以保护RAW264.7细胞线粒体结构,维持其线粒体功能。

目的 对比熟地黄水提取物（RRPAE）与生地黄水提取物（DRRAE）治疗肝缺血再灌注损伤的药效和机制，以期为临床患者更优的治疗选择提供科学依据。方法 将48只C57雄性小鼠随机分为8组（每组6只）：假手术组，模型组，RRPAE低、中、高剂量（2.5、5.0、10.0 g·kg~(-1)）组，DRRAE低、中、高剂量（2.5、5.0、10.0 g·kg~(-1)）组。ig给药，假手术组和模型组ig 0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续1周；各组小鼠于末次给药2 h后行手术建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型，假手术组仅开腹不缺血，再灌注后6 h取材。检测各组小鼠肝脏、脾脏系数；苏木素-伊红染色观察各组小鼠肝脏组织病理学改变；试剂盒法检测小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、一氧化氮（NO）水平；试剂盒法GSK1120212抑制剂检测小鼠肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、NO、丙二醛（MDA）水平；Western blotting法检测各组小鼠肝脏组织中铁死亡相关蛋白转铁蛋白（Transferrin）、溶质载体家族7成员11 (SLC7A11)、溶质载体家族39成员14 (SLC39A14)、poly结合蛋白2(PCBP2)的表达水平。培养BRL肝细胞，用50、100、150mg·mL~(-1)的RRPAE处理1h（对照组不加药）后，加野百合碱（500μmol·L~(-1)）或埃拉斯汀（10μmol·L~(-1)）处理24 h，试剂盒法分别检测细胞亚铁/总铁离子以及谷胱甘肽水平。结果 与模型组比较，经过RRPAE或DRRAE预给药后，给药组小鼠的肝脏、脾脏系数出现下降趋势，其中RRPAE低、高剂量组肝脏系数差异显著（P<0.05、0.001）；病理染色结果显示模型组肝脏出现明显的缺血-充血区和肝细胞坏死，经过RRPAE与DRRAE给药后肝细胞状态均有所恢复，且前者的效果明显优于后者。生化结果显示，与模型组相比，RRPAE可显著降低血清中肝损伤指标AST、ALT、LDH水平，升高NO含量；显著降低肝脏MDA水平，升高SOD和NO水平（P<0.05、0.01）；而DRRAE给药后对上述肝损伤及氧化应激相关指标的恢复作用整体并不显著。Western blotting实验结果显示，Microscopes and Cell Imaging Systems与模型组比较，RRPAE能够显著抑制促进铁死亡相关蛋白Transferrin、SLC39A14的表达，上调抑制铁死亡相关蛋白SLC7A11、PCBP2的表达（P<0.05、0.001），而DRRAE对铁死亡相关蛋白的调控并不明显。与模型组比较，RRPAE可上调野百合碱或铁死亡激动剂埃拉斯汀诱导的肝细胞培养基中亚铁/总铁离D-Lin-MC3-DMA子以及谷胱甘肽水平（P<0.05、0.01、0.001）。结论 熟地黄缓解肝缺血再灌注损伤效果更好，其作用机制可能与调控Transferrin、SLC7A11、SLC39A14、PCBP2蛋白的表达，抑制小鼠铁死亡进程有关。

目的:纵向弛豫时间定量成像(longitudinal relaxation time mapping,T1-mapping)技术能够以非侵入性手段检测组织的纤维化、水肿等病理改变,非增强T1-mapping无需使用造影剂,肾功能严重受损者也可接受检查,扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)技术可以对在人体组织中呈非高斯扩散运动得水分子进行量化分析,从而反映组织器官相应的病理生理改变,血氧饱和水平依赖成像(blood oxygenation level-dependent MRI,BOLD-MRI)将机体的血氧浓度变化作为天然造影剂,组织内氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白比例的改变会引起磁共振信号的改变,由此来评价组织器官的氧合状态。本研究旨在探讨非增强T1-mapping、DKI及BOLD-MRI在IgA肾病(immunoglobulin A nephrop athy,IgAN)患者的肾功能评估中的应用价值,并对各项磁共振(magnetic resohepatic veinnance imaging,MRI)参数的评估效用进行比较。方法:研究纳入就诊于南通大学附属医院经肾活检确诊的57例IgAN患者,根据肾功能不全严重程度按肾小球滤过率(estimatedglomerular filtrationrate,eGFR)水平将IgAN患者分为慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)轻(eGFR≥60ml/min·1.73m~2)、中(eGFR 30-59ml/min·1.73m~2)、重度组(eGFR<30ml/min·1.73m~2),另招募19名健康志愿者作为对照组;受试者均在3.0T磁共振仪上接受检查,并在工作站生成相应的功能磁共振伪彩图以获取相应的肾脏MRI参数值;比较健康对照组与IgAN组中各CKD亚组间的肾脏MRI参数,对于计量资料中符合正态分布的数据采用独立样本t检验进行两组间比较,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法;对于计量资料中不符合正态分布的数据采用秩和检验进行两组及多组间比较,利用Pearson或Spearman相关性检验分析各项MRI数据与eGFR、肌酐及胱抑素C等用于评价肾功能的生化的相关性,探索多种肾脏MRI在评估IgAN患者肾功能中的应用价值。结果:对照组与IgAN组T1值的差异有统计学意义[(1592.15±89.91)ms比(1776.30±172.08)ms,P<0.001],IgAN组T1值较对照组显著升高;IgAN各CKD亚组间T1值两两比较,各组间差异均有统计学意义[CKD轻度组(1684.86±103.57)ms、CKD中度组(1888.99±182.01)ms、CKD重度组(1969.14±133.74)ms;P<0.001],肾功能损伤越严重,T1值越大;Fak值在对照组与IgAN组组间差异有统计学意义[0.15(0.08～0.20)比0.19(0.11～0.32),P<0.05],IgAN组Fak值较对照组明显升高;CKD轻与重度组组间Fak值差异有统计学意义[0.17(0.11～0.25)比0.35(0.28～0.40),P<0.01],CKD重度组Fak值明显高于CKD轻度组;各组间R2*值均无统计学显著差异。IgAN组T1值与eGFR(r=-0.620,P<0.001)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)(r=-0.679,P<0.001)、红细胞压积(hematocrit,HCT)(r=-0.629,P<0.001)呈负相关,与血清肌酐(serum creatinine,Scr)(r=0.559,P<0.001)、胱抑素C(Cystatin C,Cysc)(r=0.604,P<0.001)呈正相关;Fak与eGFR(r=-4.004,P<0.05)呈负相关,与Scr(r=0.3658,P<0.05)、CPidnarulex作用ysc(r=0.378,P<0.01)呈正相关;MD与Hb(r=0.4717,P<0.001)、HCT(r=0.4983,P<0.001)呈正相关;R2*值与各项临床指标皆无相关性;T1值预测IgAN轻度肾功能损害、中度肾功能损害及重度肾功能损害的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.791(95%CI 0.660～0.922,P<0.01)、0.972(95%CI 0.914～1.000,P<0.01)、0.988(95%CI 0.958～1.000,P<0.01);Fak值预测IgAN重度肾功能损害的AUC为0.883(selleck激酶抑制剂95%CI0.678～1.000,P<0.01)。结论:与对照组相比,IgAN组T1值及Fak值均显著升高,且皆与eGFR呈负相关、与肌酐及胱抑素C呈正相关,提示非增强T1-mapping、DKI对IgAN患者的肾功能状态具有预测价值;T1值在各CKD亚组间的差别均有统计学意义,而Fak值仅CKD轻与重度组间的差异具有统计学意义,提示非增强T1-mapping的预测价值优于DKI。

以薄壳扁桃和厚壳扁桃为试验材料,观察扁桃发育过程中内果皮结构差异,研究扁桃发育过程中内果皮的理化性质。旨在为扁桃薄壳性状优质种质材料的发掘以及壳发育机制提供理论依据,为薄壳扁桃的育种做储备。主要试验结果如下:(1)厚壳扁桃内果皮较薄壳扁桃更早完成木质化。扁桃内果皮木质化顺序为从尖部到尾部,从缝合线处到脊部逐渐硬化。部分厚壳扁桃于花后51天内果皮已经完全木质化,薄壳扁桃未出现完全木质化现象。(2)厚壳和薄壳扁桃花后30天内果皮中果皮界限明显,中果皮细胞体积和细胞壁厚度大于内果皮细胞,内果皮较中果皮而言细胞较小,细胞排布紧密,中果皮的导管首先出现木质素沉积,观测到内果皮中染色顺序为:导管,细胞团,整个内果皮。(3)厚壳扁桃内果皮细胞壁厚度大于薄壳扁桃,同时期的薄壳扁桃细胞间隙比厚壳扁桃大。花后30天扁桃细胞壁明显较薄,细胞壁的支撑能力较弱。木质素在细胞角隅处先出现,后逐渐积累,‘厚4-8’扁桃优株花后44天细胞壁明显加厚,出现次生细胞immediate early gene壁,可见MRTX1133说明书细胞次生壁上的具缘纹孔状结构,薄壳扁桃‘16-23’花后44天中可见直径较小的宏纤丝,以宏纤丝为骨架木质素呈颗粒状附着其上分布形成网络。花后44天薄壳扁桃‘15-12’出现了直径较大结构中空的维管束。(4)细胞壁的加厚伴随着微纤丝的积累和细胞壁物质不断沉积形成次生壁,扁桃内果皮前期往往具有浓度较高的细胞质,而后随着内果皮的生长发育内果皮细胞中的细胞质浓度变低,至花后44天时沉积的细胞壁物质明显增多,成为次生细胞壁。形成球形蛋白体,同时细胞中存在数量不等电子密度很低的淀粉粒,通常沿细胞壁分布。(5)扁桃内果皮发育过程中木质素、纤维素、半纤维素含量均总体上增加,花后30天扁桃内果皮木质素含量为42.52～273.10mg/g,到花后51天木质素含量达到373.49～595.28mg/g。扁桃内果皮发育过程中,木质素含量与纤维素含量(0.27)、半纤维素含量(0.43)变化呈极显著正相关,厚壳扁桃内果皮木质素含量大于薄壳扁桃。苯丙氨酸解氨酶(PAL),肉桂酸-4-羟基化酶(C4H),4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL),肉桂醇脱氢酶(CAD),过氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)酶活性变化为降低或上升后降低,苯丙氨酸解氨Ceralasertib NMR酶、肉桂酸-4-羟基化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性与木质素含量均呈极显著负相关,相关系数分别为-0.45、-0.38、-0.43、-0.52。木质素相关酶活性较高可以为木质素的积累提供前体物质。

目的：研究木香乙醇提取物对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肝损伤的保护作用及相关机制。方法：将SD大鼠随机分成空白组、LPS组、高剂量木香（3.24 g/kg）+LPS组、低剂量木香（1.08 g/kg）+LPS组，给药组每天各给药1次，连续7 d，除空白组外，其他各组腹腔注射LPS诱导肝损伤。HE染色观察大鼠肝组织病理变化，检测各组血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；同时检测肝组织中核因子E_2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白和mRNA的表达。ZD1839试剂结果：LPS可诱发肝脏损伤；与模型组比较，低、高剂量木香+LPS组均可降低LPS诱导的血清ALT、AST及MDA水平，升高SOD及GSH-Px水平。木香乙醇提取物可上调被LPS抑制的肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表达。结论toxicology findings：木香乙醇提取物可改善LPS诱导的大鼠急性肝损伤，其作用机制可能与影响Nrf2/HO-1通获悉更多路从而抑制氧化应激反应有关。

目的评估高剂量二联疗法根除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的疗效及安全性。方法纳入2019年12月至2022年5月就诊于宁夏医科大学总医院消化内科门诊确诊为幽门螺杆菌感染且初次治疗的患者577例,随机分为高剂量二联组(艾司奥美拉唑肠溶片+阿莫西林)和含铋剂四联组(艾司奥美拉唑肠溶片+铋剂+阿莫西林+克拉霉素),其中高剂量二联组277例,含铋剂四联组300例,疗程均为14天;在治疗开始1周及治疗结束后进行电话随访;治疗结束停药至少1月后复查13C或14C呼气试验;观察各组的根除率,分别对各组的根除率进行按意向(ITT)分析及按方案(PP)分析,分析各组的不良反应发生率、服药依从性、治疗成本。结果在高剂量二联组277例患者中,有258例患者完成治疗及随访,含铋剂四联组300例患者中,有282例患者完成治疗及随访。1、高剂量二联组男性142例,女性135例,平均年龄(41.95±10.8)岁;含铋剂四联组男性149例,女性151例,平均年龄(40.93±8.1)岁;两组间性别及年龄均无统计学差异(P>0.05)。2、根除率统计分析结果:(1)ITT分析:高剂量二联组的H.pylori根除率是86.2%,含铋剂四联组的H.pyloGSK1120212使用方法ri根除率是88.0%,两组根除率无统计学差异(P>0.05)。(2)PP分析:高剂量二联组的的H.pylori根除率是92.6%,含铋剂四联组的H.pylori根除率是93.6%,两组根除率无统计学差异(P>0.05)3、不良反应发生率:高剂量二联组的不良反应发生率为6.6%,含铋剂四联组的不良反应发生率为18.3%,不良反应发生率的差异存在统计学意义(X~2=13.15,P<0.05)。4、服药依从性:高剂量二联组的服药依从性为93.1%,含铋剂四联组的服药依从性为93.3%,两组NVP-TNKS656采购服药依从性无统计学差异(P>0.05)。5、治疗成本:完成整个疗程治疗的高剂量二联组C/E值为4.63,含铋剂四联组的C/E值为5.87,高剂量二联疗法的成本-效果比要高于含铋剂四联组,其治疗成本更低。结论高剂量二联方school medical checkup案用于感染幽门螺杆菌初治的患者,其根除率与含铋剂四联方案相当,且不良反应发生率更低。

在现代社会中,氧化应激严重威胁着人类的身体健康。从生物原料如胶原蛋白中提取的具有抗氧化活性的生物活性肽因其安全性高、活性强且易吸收、易获取等优势逐渐引起关注。鹿茸作为哺乳动物唯一可完全再生的器官,其生长十分迅速,可达到2cm/天,但其根部由于骨化严重,传统热炸法加工方式难以对其充分利用。研究表明鹿茸骨化组织胶原蛋白的含量十分丰富,且鹿源产品污染风险小、使用限制少。因此,鹿茸骨化组织是一种良好的生物活性肽来源。本研究以鹿茸骨化组织为原料,分别利用醋酸和胃蛋白酶制备胶原蛋白,随后选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对两种方法获得的胶原蛋白分别进行水解,以DPPH自由基清除率为指标,比较两种胶原蛋白酶解产物抗氧化性能差异并筛选最适蛋白酶。进一步利用单因素试验与响应面法优化酶解工艺并以超滤法和尺寸排阻色谱法分离纯化出抗氧化活性最强的胶原肽,并检测胶原肽的氨基酸组成。实验结果表明,中性蛋白酶为最佳水解酶,并确定胃蛋白酶提取胶原蛋白作为胶原肽来源。优化获得最佳酶解工艺为酶用量3200U/g、酶解温度为52℃、p H为6.1、底物浓度为10%、酶解时间3h,此条件下酶解产物DPPH自由基清除率为73.41±0.48%。经分离纯化后获得抗氧化活性最强的鹿茸骨化组织胶原肽,其DPPH自由基清除率为90.58±1.27%。氨基酸组成分析表明该胶原肽中具有抗氧化能力的氨基酸占比较高。为进一步确定获得的鹿茸骨化组织胶原肽的抗氧化活性,在体外水平与细胞水平对其进行综合检测。体外水平主要检测了胶原肽对常见自由基的清除能力和对质粒DNA氧化损伤的保护能力,细胞水平检测了胶原肽对H_2O_2诱导的HaCaT细胞氧化损伤模型的影响。体外实验结果显示胶原肽的DPPH自由基清除率matrix biology为90.66%,超氧阴离子自由基清除PLX5622生产商率为78.33%,ABTS自由基清除率为99.59%,羟基自由基清除率为83.34%,并对质粒DNA的氧化损伤具有保护能力。在细胞水平,胶原肽的预处理可显著抑制HaCaT细胞内ROS的积累以及脂质过氧化反应,提高CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的酶活力,保护HaCaT细胞免受氧化损伤并维持细胞活力。利用鹿茸骨化组织胶原肽作为核心原料设计面膜精华液、面霜、精华乳三款护肤化妆品,对其分别进行感官测试、稳定性检测、微生物检测、理化检测以及毒理学检测。结果证实三款寻找更多化妆品肤感较好,稳定性达标,卫生度达标,重金属及有害物质含量符合《化妆品安全技术规范》且对皮肤无刺激性,最终成功获得三个国产非特殊用途化妆品备案文号。综上,本研究建立了具有较强抗氧化活性的鹿茸骨化组织胶原肽酶解工艺,并建立了基于超滤法及尺寸排阻色谱法的分离纯化工艺。在体外水平和细胞水平分别检测了鹿茸骨化组织胶原肽的抗氧化活性。同时设计出三款基于鹿茸骨化组织胶原肽的化妆品生产工艺,进行了化妆品的安全性检测并获得化妆品备案文号。为鹿茸产品的深度开发应用以及具有抗氧化能力的生物活性肽的开发和应用提供了新的思路。

目的 分析头抱菌素类药物的临床药学服务应用效果，以期提升抗生素临床应用安全，减少药物所致不良反应。方法选取2021年1月—2022年1月在上海市嘉定区中医医院接受头抱菌素类抗生素治疗的感染患者20NN2211生产商0例作为观察对象，随机分SB203580 NMR为参照组和研究组各100例。参照组给予常规用药指导，未给予特殊药学干预，研究组给予综合临床药学服务干预。比较两组不合理用药情况、不良反应发生率、服务满意率、用药依从率及治疗费用。结果 研究组胃肠道反应、过敏反应、心血管系统等不良反应发生率为2.00%，低于参照组的10.00%，差异有统计学意义（χ~2=5.674,P<0.05）。研究组每日平均治疗费用、总治疗费用Expression Analysis低于参照组，住院时间短于参照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。研究组用药总依从率、服务总满意率高于参照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。研究组不合理用药发生率为1.00%，低于参照组的7.00%，差异有统计学意义（χ~2=4.688,P<0.05）。结论 临床药学服务应用在头抱菌素类抗生素治疗过程中，有利于提高合理用药率，减少药物所致不良反应，提升抗生素临床应用安全性，减少治疗费用，缩短治疗时间，为患者的用药安全提供帮助。

目的 探讨淫羊藿苷联合地塞米松对阿霉素诱导足细胞损伤的保护作用及分子机制。方法 体外培养大鼠肾小球足细胞，阿霉素诱导建立足细胞损伤模型，分为：空白组、模型组、淫羊藿苷联合地塞米松组及氯喹组。免疫荧光法测定足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin的表达；转染mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系，激光共聚焦显微镜观察足细胞内自噬流的强弱；透射电镜观察足细胞内自噬体、自噬溶酶体的变化；Western Blot法检测足细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62及自噬信号通路蛋白PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达。结果 与模型组比，淫羊藿苷联合地塞米松组的synaptopodin的表达升高（P<0.05）；足细胞内自噬流水平、自噬体及自噬溶酶体数量均增加（P<0.01）; LC3-Ⅱ、PTEN的表达上调（P<0.01Dolutegravir小鼠），但p62、pPI3K、p-Akt、p-mTOR的表达下调（P<0.01）。与淫羊藿苷联合地塞米松组比，氯喹组synaptopodin的表达降低（P<0.05）；足细胞内自噬流的水平降低；自噬体数selleckchem量增加（P<0.05），自噬溶酶体的数量减少（P<0.01）；且LC3-Ⅱ和p62表major hepatic resection达同步升高（P<0.05,P<0.01），但PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达无明显变化（P>0.05）。结论 淫羊藿苷联合地塞米松可能通过激活PTEN，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，增强足细胞自噬水平，达到保护足细胞的作用。