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研究目的:丰富环境(Enriched environment,EE)预处理可有效预防脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。然而,EE预处理的神经保护机制尚不清楚。大量研究报道,内质网应激在I/R损伤中广泛存在。轻度的内质网应激促进细胞脱离危险信号进入适应性过程,激活促生存机制挽救缺血损伤,而长期的内质网应激大多通过触发多种促凋亡机制损害神经细胞。本研究旨在探讨内质网应激介导的自噬和凋亡在I/R损伤中的作用及其潜在的调节机制,为进一步深入探究EE产生神经保护作用的分子机制提供研究基础,为脑缺血的预防提供新思路。研究方法:56只雄性Sprague Dawley大鼠在标准环境(Standard environment,SE)或EE中饲养4周后进行假手术或大脑中动脉闭塞/再灌注(Middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)以建立脑缺血损伤动物模Trimmed L-moments型。术后将大鼠分为假手术组、MCAO组和MCAO+EE组。应用激光血流散斑成像技术监测术前、闭塞中和再灌注后的脑血流状况。术后第0、24和48小时分别通过Zea Longa评分观察大鼠神经功能缺损程度。大鼠于术后48h全身麻醉断头处死,立即进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride,TTC)染色,计算脑梗死体积。苏木精-伊红染色法(Hematoxylin and eosin staining,HE)观察半暗带神经元的形态结构。免疫印迹法检测大鼠皮层内质网应激相关蛋白(GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1/IRE1、ATF6、ATF4、CHOP和p-JNK/JNK)、自噬相关蛋白(LC3II/I、Beclin-1和p62)和细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达。同时采用TUNEL染色检测细胞凋亡水平,免疫荧光法检测p-PERK、p-IRE1和LC3的表达。研究结果:1.丰富环境预处理可减少大鼠脑梗死体积以及减轻急性期神经元损伤为了评估MCAO/R模型的成功建立,本研究首先使用激光散斑血流成像技术监测了手术前、术中和术后大鼠脑血流量(Cerebral blood flow,CBF)的变化。结果显示MCAO组和MCAO+EE组大鼠的CBF分别下降至基线的22.33%和17.57%。表明本实验所需的脑缺血再灌注模型制备成功。TTC结果显示,相较于MCAO组,MCAO+EE组大鼠脑梗死体积显著减少(P<0.01)。Longa评分用于测试大鼠神经功能缺损情况。分析表明,在MCAO/R后48h,MCAO+EE组大鼠神经功能缺损得分明显少于MCAO组且具有显著性差异(P<0.01)。此外,HE染色结果显示MCAO组大鼠皮层神经元细胞排列紊乱并伴有形态肿胀、细胞膜破裂,表明大量神经元细胞死亡。而MCAO+EE组神经元结Dolutegravir构和完整性得到明显改善,神经元死亡显著减少。表明EE预处理可减轻脑I/R损伤引起的急性神经元损伤。2.丰富环境预处理可缓解缺血再灌注损伤引起的内质网应激MCAO/R术后48小时,对大鼠进行麻醉处死,通过免疫印迹法检测内质网应激水平。结果显示,MCAO+EE组中内质网应激标志物GRP78的表达低于MCAO组,具有统计学差异(P<0.05)。未折叠蛋白反应中的三个内质网跨膜受体p-PERK/PERK,p-IRE1/IRE1以及ATF6在蛋白水平上,MCAO组的表达相较于MCAO+EE组显著升高,且具有显著差异(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。此外,MCAO组中p-PERK以及p-IRE1的荧光强度高于MCAO+EE组(P<0.001,P<0.05)。提示缺血前EE预处理可显著抑制I/R损伤诱导的内质网应激。3.丰富环境预处理抑制缺血再灌注损伤后的自噬活性由于内质网应激介导的自噬在I/R损伤中起着至关重要的作用,本研究继续探索了EE预处理是否对自噬有影响。免疫印迹和免疫荧光检测了自噬标志物LC3的表达情况。结果显示,相较于MCAO组,MCAO+EE组LC3II/I的蛋白表达以及荧光强度均显著下降(P<0.GSK J4细胞培养01)。此外,MCAO+EE组Beclin-1的蛋白表达低于MCAO组(P<0.01),p62的蛋白表达高于MCAO组,均有统计学差异(P<0.05)。提示EE预处理能够抑制I/R损伤引起的自噬水平。4.丰富环境预处理可减轻缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡通过TUNEL染色检测大鼠患侧皮层细胞凋亡情况。MCAO+EE组细胞凋亡指数明显低于MCAO组(P<0.01)。此外,利用免疫印迹检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果表明,相较于假手术组,MCAO组中Bcl-2的表达下降(P<0.001),Bax的表达增加(P<0.001);而相对于MCAO组,MCAO+EE组增加了Bcl-2的表达(P<0.01),并减少了Bax的表达(P<0.05)。5.缺血前丰富环境预处理对内质网应激下自噬和凋亡相关信号通路的影响本研究通过免疫印迹评估了PERK信号通路下ATF4和CHOP以及IRE1信号通路下p-JNK/JNK的蛋白表达水平。结果显示,以上三种蛋白表达水平在MCAO+EE组中均高于MCAO组(P<0.05,P<0.001,P<0.01)。提示在长时间内质网应激下,EE预处理减弱I/R损伤介导的自噬和凋亡可能与激活PERK-ATF4-CHOP通路和IRE1-JNK通路有关。研究结论:1.丰富环境预处理可抑制脑缺血再灌注后引起的内质网应激,自噬活性和凋亡。2.缺血前丰富环境预处理产生的神经保护作用可能与调节内质网应激介导的PERK-ATF4-CHOP通路和IRE1-JNK通路进而抑制自噬和凋亡有关。

目的 探讨层粘连蛋白γ1(LAMC1)在膀胱癌细胞中的表达情况，以及沉默LAMC1基因表达对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响。方法 选取河北省邯郸市中心医院2019年1月至2021年12月收治的48例膀胱癌患者的癌及癌旁组织。采用RT-qPCR法检测UMUC3、T24、5637及J82细胞中LAMC1的m RNA表达水平。将LAMC1-si RNA质粒转染至5637细胞中，MAPK抑制剂设置LAMC1沉默组和阴性对照组，RT-qPCR和treatment medicalWestern blot验证转染效率；采用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测LAMC1基因沉默对膀胱癌细胞增殖、克隆形成能力及细胞周期的影响，Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin D1、p16和p21的表达水平。Colforsin分子量结果 5637细胞中LAMC1 m RNA表达水平较UMUC3、T24、J82细胞高（P<0.05）。癌旁组织与膀胱癌组织中LAMC1阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。LAMC1沉默组中LAMC1 m RNA和蛋白表达水平低于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中细胞增殖活力和克隆形成能力低于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中细胞中S期细胞所占百分比低于阴性对照组（P<0.01）,G1期细胞所占百分比高于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中的cyclin D1和cyclin A蛋白的表达水平低于阴性对照组（P<0.01），而p16和p21蛋白的表达水平高于阴性对照组（P<0.01）。结论 沉默LAMC1基因表达能够抑制细胞周期相关蛋白的表达从而抑制膀胱癌5637细胞增殖能力，提示其可能是膀胱癌潜在的治疗靶点。

目的 探讨层粘连蛋白γ1(LAMC1)在膀胱癌细胞中的表达情况，以及沉默LAMC1基因表达对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响。方法 选取河北省邯郸市中心医院2019年1月至2021年12月收治的48例膀胱癌患者的癌及癌旁组织。采用RT-qPCR法检测UMUC3、T24、5637及J82细胞中LAMC1的m RNA表达水平。将LAMC1-si RNA质粒转染至5637细胞中，MAPK抑制剂设置LAMC1沉默组和阴性对照组，RT-qPCR和treatment medicalWestern blot验证转染效率；采用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测LAMC1基因沉默对膀胱癌细胞增殖、克隆形成能力及细胞周期的影响，Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin D1、p16和p21的表达水平。Colforsin分子量结果 5637细胞中LAMC1 m RNA表达水平较UMUC3、T24、J82细胞高（P<0.05）。癌旁组织与膀胱癌组织中LAMC1阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。LAMC1沉默组中LAMC1 m RNA和蛋白表达水平低于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中细胞增殖活力和克隆形成能力低于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中细胞中S期细胞所占百分比低于阴性对照组（P<0.01）,G1期细胞所占百分比高于阴性对照组（P<0.01）。LAMC1沉默组中的cyclin D1和cyclin A蛋白的表达水平低于阴性对照组（P<0.01），而p16和p21蛋白的表达水平高于阴性对照组（P<0.01）。结论 沉默LAMC1基因表达能够抑制细胞周期相关蛋白的表达从而抑制膀胱癌5637细胞增殖能力，提示其可能是膀胱癌潜在的治疗靶点。

研究背景近年来,糖尿病的患病率在全球范围内迅速升高,糖尿病心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的最主要原因。糖尿病会导致心肌细胞代谢失调、细胞内钙离子超载、心肌壁内微血管病变等,进而引发心肌细胞肥大、凋亡和心肌纤维化导致心室重构的发生。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者所特有的一种心脏功能障碍,往往会出现左室舒张功能受损,伴或不伴有左室收缩功能障碍,其主要病理改变是左室扩大、心肌间质纤维化、心肌细胞肥大以及心肌细胞凋亡等。DCM的分子机制复杂,其关键调控机制不明,阻碍了有效治疗药物的开发。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在心力衰竭发病和进展中起着关键作用,血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockers,ARB)和醛固酮受体拮抗剂已被证明可改善心脏重构和功能障碍,成为心力衰竭治疗的基石药物。然而,这些经典RAS成员具有较多的限制性。作为锌离子依赖性金属蛋白酶超家族成员之一,解联蛋白和金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease protein-17,ADAM17)是一种由824个氨基酸组成的跨膜蛋白,其功能是通过蛋白水解作用裂解锚定于细胞膜上的多种细胞因子、细胞粘附因子、生长因子、受体、配体和蛋白酶,进而调节多种细胞功能。近年来研究发现,ADAM17可以裂解细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2),被裂解的ACE2胞外域仍具有ACE2酶活性,ADAM17的金属蛋白酶区对于ACE2的脱落起到主要作用。研究表明,心衰患者血清中的可溶性ACE2水平和活性显著增加,与心衰程度密切相关,其机制可能涉及RAS激活诱导的ADAM17活性升高,从而促进ADAM17对底物ACE2的剪切,使其从细胞膜脱落进入外周血液。然而,ADAM17与DCM的因果关系及分子机制的研究甚少。迄今为止,尚无文献报道ADAM17基因修饰对DCM的影响和分子机制。我们前期的研究发现,心肌细胞特异性敲除ADAM17能够改善DCM小鼠的心肌纤维化、心肌细胞凋亡以及左室功能。这一初步的研究揭示了 ADAM17在DCM小鼠中的有益作用,但其具体机制仍未完全阐明,下列重点科学问题仍悬而未决:(1)ADAM17在心肌不同细胞中的表达和功能不明,ADAM17敲除后细胞凋亡定位于何种细胞仍不清楚;(2)在动物表型的研究中,前期研究的一个重要缺陷是缺少ADAM17α-MHCKO非糖尿病组(即ADAM17α-MHCKO Control组)的对照组,单纯心肌细胞敲除ADAM17基因对小鼠左室形态和功能的影响不明;(3)ADAM17对底物ACE2及其下游产物Ang Ⅱ和Ang-(1-7)作用不明,无法判断ADAM17敲除是否通过ACE2增加而发挥改善DCM的作用;(4)前期研究中使用的是未分化的H9c2细胞系,不具有心肌细胞oral bioavailability的表型特征,不能代表原代心肌细胞,采用分化的H9c2细胞和原代心肌细胞有何差别仍不清楚;(5)ADAM17与糖代谢的关系不明,糖尿病状态下通过何种途径影响ADAM17不明,AMPK是糖代谢的关键调控分子,但ADAM17与AMPK的关系并不清楚;(6)前期研究已知糖尿病状态下ADAM17可影响心肌细胞的自噬和凋亡,但具体调节机制不明,心肌细胞自噬和凋亡之间的因果关系不明。针对以上诸多科学问题,我们设计并进行了一系列体内和体外实验。此外,ACE2在心肌细胞特异性敲除ADAM17改善DCM的疗效中发挥了什么样的作用?当ACE2被干扰时ADAM17对心肌细胞凋亡和自噬的作用是否会消失?为了阐明这些重要的科学问题,我们在体内和体外实验中构建了ADAM17和ACE2基因双干扰的动物和细胞模型,进行了更加深入的探讨。论文Ⅰ ADAM17基因干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的1.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对糖尿病小鼠左室重构和心功能的影响。2.探讨糖尿病小鼠中ADAM17的表达和酶活性升高原因。3.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17如何调控AMPK信号通路。4.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对自噬流的影响以及影响自噬流的具体环节。5.探讨体外实验中ADAM17干扰在原代心肌细胞中的分子机制。研究方法1.敲基因小鼠的构建心肌细胞ADAM17基因特异性敲除小鼠采用CRISPR-Cas9技术构建,通过ADAM1 7flox/flox小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交后获得。将同窝出生的Cre阴性小鼠小鼠作为对照组小鼠。2.动物实验的分组动物实验中共分为四个组.:ADAM17fl/fl Control 组、ADAM17α-MHCKO Control组、ADAM17fl/fl DM组、ADAM17α-MHCKO DM组。3.小动物超声检测小鼠心功能Ⅱ型糖尿病小鼠造模成功后,进行小鼠超声测量评价小鼠的左心室收缩和舒张功能。4.小鼠组织标本取材及病理检查小鼠安乐死后留取心脏等标本放入4%多聚甲醛或负80度冰箱用于后续的病理学和分子生物学实验。对心脏组织切片进行HE、Masson染色、免疫荧光染色以及TUNEL和心肌细胞荧光共定位染色等。5.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取和H9c2细胞的分化选择新出生的Wistar大鼠乳鼠(1d-3d)利用差速贴壁法提取原代心肌细胞,H9c2细胞用低血清培养加RA刺激促使其向成熟心肌细胞的表型分化。6.细胞实验的分组细胞实验的分组如下:(1)Vehicle组;(2)高葡萄糖/棕榈酸组(GP组);(3)高葡萄糖/棕榈酸+无意义小干扰RNA组(GP+NC-siRNA组);(4)高葡萄糖/棕榈酸+ADAM17小干扰RNA组(GP+ADAM17-siRNA组)。此外,为了探索ADAM17影响自噬流的具体环节,在上述4个组中分别加入CQ及其空白溶剂对照,共分为8个组,分别是:Vehicle组、Vehicle+CQ组、GP组、GP+CQ组、GP+NC-siRNA 组、GP+NC-siRNA+CQ 组、GP+ADAM17-siRNA 组、GP+ADAM17-siRNA+CQ 组。7.RFP-GFP-LC3B自噬流检测使用Premo自噬流检测试剂RFP-GFP-LC3B检测细胞自噬不同阶段的动态过程。8.mRNA测序分析将ADAM17α-MHCKO DM组和ADAM17fl/fl DM组小鼠的心脏组织进行测序。9.Western Blot 实验对动物心脏组织和细胞进行蛋白提取后进行SDS-凝胶电泳,经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后进行发光显影。10.数据统计分析所有数据在分析前先进行正态分布检验,对于符合正态分布的数据,两组之间差异的比较采用非配对t检验。对于连续变量采用平均值±标准误(SEM)的方式表示。在所有的统计分析中,p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.糖尿病小鼠的心脏中ADAM17表达显著增加与对照组相比,DCM组心脏中ADAM17 mRNA水平和蛋白表达水平显著增高,ADAM17的酶活性显著增加。2.ADAM17在心脏中的表达分布情况ADAM17在心肌细胞中大量表达,在心肌成纤维细胞和内皮细胞中表达较少,此外与对照组小鼠相比,DCM组小鼠心脏心肌细胞中ADAM17的表达更多。3.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因不影响小鼠的体重、血糖、血脂水平以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。4.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善糖尿病小鼠心室重构和功能心肌细胞特异性敲除ADAM17基因显著改善了糖尿病小鼠的左室重构以及收缩和舒张功能,单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的左室重构和功能。5.心肌细胞ADAM17缺乏显著改善心肌纤维化和心肌细胞凋亡Masson结果显示,心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病导致小鼠的心肌纤维化情况,而单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的心肌纤维化。TUNEL染色与WB结果显示,心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠心肌细胞凋亡情况,但不影响生理状态下小鼠心肌细胞的凋亡。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。6.体内和体外实验中ADAM17的作用与其裂解ACE2密切相关ACE2蛋白表达与mRNA表达的解偶联现象表明,在DCM的进程中ADAM17可能仅影响ACE2的转录后表达水平。小鼠血清中ACE2、Ang Ⅱ和Ang-(1-selleck AZD22817)水平的检测结果显示,在生理和病理状态下ADAM17均在调节ACE2-AngⅡ/Ang-(1-7)轴中发挥着关键作用。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。7.ADAM17在调节心肌细胞中AMPK/mTOR信号通路和TFEB表达发挥着重要作用WB结果显示,ADAM17基因敲除可逆转糖尿病所导致的AMPK通路失活和TFEB蛋白表达的抑制。体外实验得到了与体内实验一致的结论。此外,在心肌细胞中GP刺激抑制了 TFEB的核转位,而心肌细胞中抑制ADAM17基因能够显著增强TFEB的核转位。ADAM17通过调节4EBP1和p70S6K蛋白磷酸化影响了 AMPK/mTOR信号通路diABZI STING agonist核磁。8.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善心肌细胞的自噬流利用自噬抑制剂CQ和自噬双标腺病毒RFP-GFP-LC3B来测量自噬流,结果显示,GP刺激抑制了心肌细胞的自噬通量,心肌细胞中ADAM17的缺乏能够改善细胞的自噬通量。ADAM17可能是在自噬通量的早期通过减弱自噬小体的形成来抑制自噬通量,而心肌细胞中ADAM17缺乏可改善细胞的自噬通量。9.ADAM17缺乏对自噬小体形成过程中相关蛋白表达的影响通过检测Atg3、Atg5、Atg7、Atg12和Beclin-1的蛋白表达水平,发现ADAM17在自噬小体的形成过程中发挥着重要作用,心肌细胞中ADAM17缺乏可促进自噬流中自噬小体的形成。10.ADAM17缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应在NRCMs细胞中,ADAM17的缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应。11.ADAM17对ADRA1A/AMPK介导的心肌细胞自噬和凋亡的影响应用选择性AMPK抑制剂Dorsomorphin后检测细胞的自噬和凋亡水平。结果表明,心肌细胞中ADAM17的缺乏通过AMPK改善心肌细胞的自噬和凋亡,当AMPK被抑制时ADAM17的缺乏对细胞自噬和凋亡的改善作用也随之消失。12.HIF-1α可能是糖尿病小鼠中ADAM17上调的上游介质HIF-1α可能是介导糖尿病小鼠ADAM17上调的上游分子,这也解释了糖尿病小鼠心脏中ADAM17蛋白表达和活性升高的可能原因。实验结论1.心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡和心肌纤维化,并改善左室重构和功能障碍。2.在Ⅱ型糖尿病小鼠心脏组织中,HIF-1α的激活上调了 ADAM17的蛋白表达和活性,进而导致心肌组织ACE2蛋白水平显著降低,血清中可溶性ACE2含量显著升高。3.心肌细胞ADAM17敲除通过ADRA1A激活了 AMPK信号通路。4.心肌细胞ADAM17敲除促进自噬流中自噬小体的形成,改善自噬流,进而减少心肌细胞的凋亡。论文Ⅱ ADAM17和ACE2基因单独和合并干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的1.探讨ADAM17缺乏是否通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心室重构和心功能的作用。2.探讨当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除是否能继续改善糖尿病小鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡。3.探讨体外实验中当ADAM17和ACE2同时被抑制时心肌细胞自噬和凋亡的情况。研究方法1.动物实验的分组小鼠经过配繁后获得ADAM17α-MHCKO小鼠,将同窝出生的Cre阴性小鼠(ADAM17fl/fl小鼠)用于动物实验中的对照组。给予ADAM17fl/fl小鼠和ADAM17α-MHCKO小鼠尾静脉注射心肌细胞特异性启动子cTnT驱动的特异性敲减ACE2的九型腺相关病毒(AAV9-cTnT-shACE2)。动物实验分为4个组:ADAM17fl/fl DM+Vector组、ADAM17α-MHCKO DM+Vector 组、ADAM17fl/fl DM+AAV9-shACE2 组、ADAM17α-MHCKO DM+AAV9-shACE2 组。2.小动物超声检测小鼠心功能同论文Ⅰ部分3.小鼠组织标本取材及病理检查同论文Ⅰ部分4.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取选择新出生的Wistar大鼠乳鼠(1d-3d)利用差速贴壁法提取原代心肌细胞。5.细胞实验的分组按照实验的设计,细胞实验的分组情况如下:(1)Vehicle组;(2)GP组;(3)GP+NC-siRNA 组;(4)GP+ADAM17-siRNA 组;(5)GP+ACE2-siRNA 组;(6)GP+ADAM17-siRNA+ACE2-siRNA 组。6.Western Blot 实验对动物心脏组织和细胞进行蛋白提取后进行SDS-凝胶电泳,经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后进行发光显影。7.数据统计分析同论文Ⅰ部分。研究结果1.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因以及心脏组织ACE2敲减并不影响糖尿病小鼠的BW、FBG、TG和TC水平。2.ACE2在ADAM17敲除改善小鼠心室重构和心功能中发挥关键作用结果表明,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠左室重构以及左室收缩和舒张功能,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善糖尿病小鼠左室重构和功能的作用。3.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌纤维化中发挥关键作用Masson结果显示,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌纤维化,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其抗糖尿病小鼠心肌纤维化的作用。4.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡中发挥关键作用TUNEL与WB实验结果显示,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡,说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡的作用。5.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬中的作用ACE2在ADAM17通过AMPK通路改善心肌细胞自噬的效应中发挥了关键作用,ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善心肌细胞自噬的作用。实验结论1.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善左室重构和功能的作用,当心脏中ACE2被抑制时,ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的左室重构和功能。2.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌纤维化和细胞凋亡的作用。3.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬的作用。

表观遗传学是指不涉及DNA序列改变的基因或者蛋白表达的变化，并可以在发育和细胞增殖过程中稳定传递的遗传学分支学科。表观遗传学与人体皮肤衰老密切相关，其表现为人体皮肤表观遗传修饰的变化。通过研究及利用表观遗传修饰可逆转的特性，能够将表观遗传学的研究应用到皮肤抗衰及抗衰相关化妆品领域当中。文章概述了表观遗传学在皮肤抗衰及化妆品研究与应用当中的主要内容，通过DNA甲基化、组蛋白修饰和微小RNA调控在细https://www.selleck.cn/products/pci-32765.html胞外基质调节，细胞增殖分化调控，黑色素合成或代谢调节，抗氧化应激能力调节上的表观遗传修饰表现形式及逆转方式，展示了www.selleck.cn/products/lgx818基于表观遗传学的paediatrics (drugs and medicines)多种皮肤抗衰机制；以及通过人体衰老过程中表观遗传修饰的变化，对皮肤衰老的原因和表征进行解释，为抗衰相关化妆品的研发提供科学依据。本文综述了表观遗传学与皮肤抗衰相关的多种作用机制的关系与表现形式，为皮肤衰老研究提供理论依据，并对未来抗衰相关化妆品的发展进行展望。

由于全球经济社会的发展,衰老人群的逐年增加,人类对身体健康的重视severe combined immunodeficiency也在提高,医疗保健要求也在逐年攀升,随着科技的进步,医疗器械市场规模不断扩大,但高端医疗设备市场份额仍被国际巨头垄断,国内公司只能在中低端市场勉强维持竞争力,获得微薄的利润率。为了满足人民群众的健康需求,政府采取了一系列措施来支持中国医疗设备的发展,特别是在高端医疗设备方面,国内企业正在积极投入大量资源,以提升国家的医疗保健水平,以推动我国医疗产业的发展。“无线长时程动态心电检测系统”就是一种高端医疗器械,实现大幅度提高患者心律失常疾病的精准诊断功能,“无线长时程动态心电检测系统”是由ES公司研发和生产的主要产品。基于STP理论,LY-188011体外企业可以通过划分医疗机构等级和患病率来细分市场,从而更好地了解主要和次要的目标市场,这对企业的发展具有重要意义。经过深入分析研究,本文以结合4P理论的营销策略在产品方面提出了一种可穿戴多导联长时程的创新产品,以期获得更好的市场效果,通过与国内厂商的合作,降低设E-616452备成本。为了提升渠道效率,将采取多种措施,包括医疗器械设备出租的方式和心脏电生理项目打包销售的方式。在定价策略方面,将采用多种渠道定价方式,产品线差别定价法,发展阶段定价法。此外,我们还将扩大“长时程动态心电监测”的优势宣传,在全国各省市设立示范医院,并提出全面的方案。最终,通过优化组织结构、提升人力资源配置、健全服务机制以及实施经济效益等多种措施,保证营销方案的实施。本文旨在为ES公司提出实用的营销指导,并为国内外高端医疗器械行业中小企业提出借鉴,以期为中国医疗器械产业的市场进行有效的弥补和完善。

目的:通过对加味建瓴汤治疗高血压病肝阳上亢证的临床研究,观察其在血压水平、相关检查指标及中医证候等方面的临床疗效,初步评价加味建瓴汤的有效性和安全性,以冀为中西医结合治疗高血压病提供更多的诊疗思路与方法。方法:选取来自山东中医药大学附属医院心病科门诊及病房且符合纳入标准的患者60例,将其随机分为对照组和治疗组,每组均为30例。对照组采用常规西药治疗,治疗组在常规西药基础上联合加味建瓴汤进行治疗,两组的治疗周期均为4周。疗程结束后分别观察两组患者治疗前后诊室血压、24小时动态血压、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、中医证候积分和中医单项症状的变化情况。结果:(1)诊室血压:两组治疗后的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)均较治疗前明显降低(P<0.01),且治疗组优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);在降压疗效方面,治疗组的降压总有效率为93.33%,对照组的降压总有效率为82.76%,治疗组的降压疗效优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)24小时动态accident and emergency medicine血压:治疗后两组患者的24小时平均收缩压(24h SBP)、24小时平均舒张压(24h DBP)、日间平均收缩压(dSBP)、日间平均舒张压(dDBP)、夜间平均收缩压(n SBP)、夜间平均舒张压(nDBP)与治疗前相比均显著降低(P<0.01),治疗组24h SBP、dSBP、dDBP和n SBP均低于对照组(P<0.05),24h DBP、nDBP与对照组无差异(P>0.05)。(3)血脂水平:治疗组TC、TG、LDL-C水平较前显著下调(P<0.01),HDL-C则无明显差异(P>0.05),对照组TC、TG水selleck HPLC平较前显著下降(P<0.01),而LDL-C、HDL-C无明显改变(P>0.05),且治疗后治疗组较对照组有更低的TC、TG、LDL-C水平(P<0.05),HDL-C无明显差异(P>0.05)。(4)中医证候疗效:治疗组的中医证候总有效率为90.00%,优于对照组62.07%(P<0.05),对于中医单项症状,治疗组对眩晕、头痛、腰膝酸软、面红、口苦、急躁易怒和失眠的改善效果优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)安全性:治疗期间两组患者均未出现明显的不良反应,安全指标检测无异常。结论:加味建瓴汤联合常规西药治疗高血压病肝阳上亢证临床疗效显著,能有效降低患者的血压水平,调节血脂以及改善临床症状,且临床应用安全性高,未见明显不良反应及副作用,为高血压病的中西医结合诊疗提供了新的思路和方法,加味建瓴汤Nirogacestat试剂值得进一步的临床应用及推广。

【研究背景】脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,而胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是其中恶性程度最高、侵袭性最强的一种弥散性肿瘤,平均每年发病人数在25万以上。目前针对GBM患者主要的治疗方式仍是手术切除辅以放化疗的综合治疗,但预后极差,患者的中位生存期<14.6个月,5年生存率只有5.6%。由于人体存在血脑屏障,化疗和免疫治疗在胶质瘤患者中的应用受到限制,对于患者生存期的改善十分有限。放疗在GBM的治疗中占有极其重要的地位,手术切除GBM后放疗可以杀伤残留肿瘤细胞,降低复发率;对于难以手术切除的GBM,也可以通过放疗抑制胶质瘤生长。但GBM对放射容易产生抗性是预后不良的主要原因,因此,寻找新的靶点来为胶质瘤患者放疗增敏以改善治疗效果、延长生存期成为了迫在眉睫的工作。【研究目的】利用CRISPR/Cas9文库筛选GBM放疗抵抗相关基因,系统探索该靶点介导放疗抵抗的功能与机制,并以该靶点为基础,探索基因编辑技术在GBM治疗中的新策略。【研究方法】1.运用全基因组CRISPR文库感染GBM细胞,构建原位GBM模型进行体内筛选,文库测序分析GBM放疗抵抗靶点;2.构建放疗抵抗GBM细胞,RNA测序与文库结果取交集,通过数据分析和实验初步确定GSS是放疗抵抗关键基因;3.构建稳定敲除GSS细胞株和放疗抵抗PDX模型,通过体内外实验,如免疫荧光、Western Blot、CCK-8、平板克隆实验等确定GSS表达水平与放疗敏感性的联系;4.通过分析公共数据库资料和GBM组织芯片,探究GSS与胶质瘤的临床相关性;5.利用免疫荧光和RNA-seq实验分析GSS介导的放疗增敏激活了细胞铁死亡通路;6.数据库分析、流式细胞仪检测脂源性ROS、透射电镜图像、CCK-8实验等方法验证放射与GBM细胞铁死亡之间联系;7.通过免疫组化、WB、代谢组学分析等实验系统阐明GSS在胶质瘤放疗过程中发挥作用机制;8.将Cas9/sgGSS复合物装载入靶向胶质瘤的细胞外囊泡,并在原位胶质瘤模型中验证效果,探索其对放疗敏感性的影响。【研究结果】1.成功进行了体内全基因组CRISPR文库的筛选,数据分析得到放疗敏感基因;2.成功构建了放疗抵抗细胞株,RNA-seq与文库结果取交集得到目的靶点GSS;3.成功构建了稳定敲除GSS细胞株和放疗抵抗PDX模型,免疫荧光、WB等实验证明放疗抵抗模型中GSS蛋白高表达,CCK-8、细胞克隆形成实验等证明GSS敲除增强了放疗效果;4.数据库资料和组织芯片显示,GSS的高表达导致了不良预后;5.根据免疫荧光和RNA-seq结果得出,GSS介导的放疗增敏与DNA损伤修复无关,与细胞铁死亡通路相关;6.放射后,流式细胞仪检测显示脂源性ROS上升,透射电镜、CCK-8实验、数据库分drugs: infectious diseases析得出放射诱导GBM细胞铁死亡;7.放疗过程中,敲除GSS抑制了GSH合成,一方面降低了GPX4活性,导致脂质过氧化物累积;另一方面加剧了Fe~(2+)的积累,形成了不稳定铁池,引起芬顿反应,产生过量的ROS,加剧铁死亡发生;8.构建Ang/TAT-sgGSS-EV,并在LN229原位模型和GSC原位模型中验证可以有效干扰GSS表达,与放射联合处理显著增强了放疗敏感性,证明在体基因编辑治疗策略成功。【结论】1.通过CRISPR/Cas9文库体内压力筛选出放疗联合致死基因集,联合放疗抵抗细胞株的转录组测序结果,发现了GSS在胶质瘤放疗抵抗过程中发挥了关键作用。2.通过在线数据库资料、组织芯片和临床样本系统证实GSS表达水平与胶质瘤患者分级分期及不良预后密切相关,级别越更多高的胶质瘤,GSS表达水平越高,预后越差;3.通过细胞学实验、分子生物学实验和数据库资料分析,GSS介导的放疗抵抗机制与铁死亡相关。GSS通过合成还原性谷胱甘肽增强diABZI STING agonist体内GPX4活性,从而还原脂质过氧化物,减少了亚铁离子的积累,抑制芬顿反应,从而抑制铁死亡。4.在LN229原位胶质瘤模型和胶质瘤干细胞原位模型中,Ang/TAT-sgGSS-EV具有较高的靶向效率和较强的基因编辑能力,能够实现对GSS的体内靶向干预,与放疗联用可显著抑制胶质瘤发展,具有潜在的临床应用前景。

研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,近年来,靶向治疗和免疫疗法已取得了重大的进步,弥补了CRC传统疗法如化疗、放射治疗和手术的缺陷。但由于治疗耐药性和副作用,诊断后只有63%的CRC患者能够存活5年以上,因此,需要开发新的治疗手段用于预防和治疗CRC。大量研究表明,从植物中分离的化学物质对癌症和其他疾病非常有效。胭脂素是一种从胭脂树种子中提取的天然化合物,广泛应用在食品添加剂和着色剂,近年研究表明,胭脂素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等多种药理学作用,但迄今为止,胭脂素是否具有抗CRC的作用以及潜在的分子机制尚未见报道。方法:人类CRC细胞系Ca CO2和SW480细胞,以及正常的人类结肠上皮细胞系HIEC和NCM460培养于含10%胎牛血清的Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中。胭脂素溶解于二甲基亚砜(DMSO)中至终浓度为200μM。为检测胭脂素对CRC细胞在体外增殖和转移的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度(0μM、10μM、40μM和80μM)的胭脂素刺激24小时后,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)检测细胞增殖,通过成克隆试验检测细胞在体外的存活能力,通过transwell试验检测细胞在体外转移和侵袭能力。为检测胭脂素对CRC细胞凋亡的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度(0μM、40μM和80μM)的胭脂素或不同浓度(100 ng/ml和200 ng/ml)的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-relatLY294002临床试验ed apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或者二者联合刺激24小时后,通过Annexin V/propidium iodide(PI)双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡比例,并通过western blot检测剪切后Caspase 3、剪切后Caspase 9、Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和Bax(BCL2-Associated X)蛋白的含量。为检测胭脂素对CRC细胞中AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)通路、内质网应激和自噬的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度的胭脂素或TRAIL或二者联用刺激后,通过western blot检测AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA–like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、真核翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2,e IF-2α)、磷酸化e IF-2α和转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的表达。为检测AMPK通路在胭脂素诱导内质网应激和拮抗CRC中的作用,Ca CO2和SW480细胞在体外经AMPK特异性抑制剂Compound C预处理后再给与胭脂素,检测细胞增殖、转移和凋亡,并检测内质网应激相关蛋白的表达。为检测胭脂素诱导细胞自噬与AMPK通路之间的关系,通过不同浓度胭脂素处理Ca CO2和SW480细胞,检测自噬蛋白、细胞增殖蛋白LC-3B、Beclin-1、p-m TOR、p-p70S6K、p-4EBP、p-ACC的表达水平,在加入AMPK抑制剂Compound C处理后,检测自噬蛋白和p-AMPK的表达水平。为检测胭脂素在体内对CRC细胞的抑制作用,建立Ca CO2的裸鼠荷瘤模型,给与100bio metal-organic frameworks (bioMOFs) mg/kg的胭脂素或者胭脂素联合Compound C(10 mg/kg)后,观察不同时间点肿瘤的生长,在肿瘤种植第21天处死小鼠称量肿瘤重量,通过苏木素/伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色对小鼠心、肝、肺和肾进行组织学检测。结果:低于80μM的胭脂素处理对HIEC和NCM460细胞没有表现出明显的毒性作用,而40μM和80μM的胭脂素处理显著抑制了Ca CO2和SW480细胞体外的增殖和Ed U染色阳性细胞数。此外,胭脂素处理可以剂量依赖的方式显著抑制Ca CO2和SW480细胞集落的形成。与0μM胭脂素处理的对照组细胞相比,随着胭脂素浓度的增加,Ca CO2和SW480细胞的划伤修复率越来越低,80μM胭脂素处理的细胞伤口增大明显。并且transwell检测的结果表明,胭脂素处理以剂量依赖性方式显著减少了迁移和侵袭细胞的数量,80μM胭脂素处理的细胞迁移率和侵袭率均低于50%。TRAIL和胭脂素均能以剂量依赖性方式诱导Annexin V/PI阳性的Ca CO2和SW480细胞显著增加,而与胭脂素联合处理,即使在较低剂量下,也能够增强TRAIL对CRC细胞的促凋亡能力。此外,免疫印迹分析表明,在Ca CO2和SW480细胞系中,与TRAIL、胭脂素单独处理相比,TRAIL和胭脂素联合处理增加了caspase依赖的细胞凋亡,因为它诱导更高水平的剪切后Caspase 3、剪切后Caspase 9和Bax,与TRAIL、胭脂素单独处理相比,二者联合处理显著降低了Bcl-2表达水平。单独使用TRAIL或胭脂素处理可增加磷酸化PERK(p-PERK)和磷酸化e IF2α(p-e IF2α)的水平,以及GRP78、CHOP和ATF4的蛋白质水平。而胭脂素和TRAIL的联合处理增强了这种效果,使磷酸化PERK(p-PERK)和磷酸化e IF2α(p-e IF2α)的水平,以及GRP78、CHOP和ATF4的蛋白质水平均得到显著提升。胭脂素还能增加CRC细胞中p-AMPK水平,与TRAIL联合处理后p-AMPK表达增强。经过AMPK特异性抑制剂Compound C处理后,显著抑制了胭脂素与TRAIL单独诱导和联合诱导的p-AMPK、p-PERK、p-e IF2α、GRP78、ATF4和CHOP蛋白表达水平的上调。单独使用胭脂素处理LC3BⅡ/Ⅰ,Beclin-1水平增加,磷酸化m TOR(p-m TOR)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)和磷酸化4EBP(p-4EBP)水平降低,磷酸化ACC(p-ACC)水平升高,而加入AMPK特异性抑制剂Compound C后,与不加入胭脂素组相比,LC-3BⅡ/Ⅰ的比值、Beclin-1和磷酸化AMPK(p-AMPK)表达水平增加。Compound C处理可以减弱胭脂素对体外Ca CO2和SW480细胞增殖的抑制作用,以及逆转胭脂素诱导的Ed UErdafitinib核磁阳性细胞数量的下调。Compound C处理可以消除胭脂素对CRC细胞迁移和侵袭的抑制作用。Compound C也能抑制胭脂素诱导的Ca CO2和SW480细胞凋亡。体内实验结果表明,胭脂素处理显著抑制了携带Ca CO2肿瘤移植小鼠的肿瘤生长,而Compound C处理降低了胭脂素的抗肿瘤能力。胭脂素和Compound C单独处理与联合处理对小鼠体重无显著影响。此外,组织学分析数据表明,用胭脂素和Compound C单独处理与联合处理对小鼠主要器官,包括心脏、肝脏和肾脏没有毒性。结论:综上所述,本研究结果表明,胭脂素在体外实验以及裸鼠荷瘤模型中表现出了抑制CRC细胞增殖、转移和侵袭的作用,并促进CRC细胞的凋亡,对正常细胞和组织器官无明显的毒性。研究结果还揭示胭脂素激活AMPK通路从而诱导CRC细胞发生内质网应激,是其抑制CRC作用的机制,为CRC等恶性肿瘤提供一种潜在的新型治疗手段。

目的:调查大理地区住院老年非瓣膜性房颤(Non-valvular atrial fibrillation,NVAF)患者的临床特征及抗凝治疗现状,分析其影响因素。方法:通过病历资料收集及电话问卷调查等方式收集了2020年07月01日—2021年12月31日在大理大学第一附属医院老年病科住院的年龄≥60岁的老年非瓣膜性房颤患者资料。共纳入208例住院老年房颤患者,大理州内房颤患者166例,其中NVAF患者155例(93.37%),瓣膜性房颤患者11例。对155例大理州内的NVAF患者分析房颤知晓率、临床特征、抗凝治疗率及影响因素,并进行出院1年电话随访,了解生存状态、再入院治疗、抗凝治疗、脑血管事件及出血事件等发生情况。综合使用t检验、卡方检验、Logistic回归分析对入院时、出院时、出院1年抗凝治疗组与非抗凝治疗组患者基线资料、临床特征进行Erastin体内分析,使用Cox比例风险回归模型分析NVAF患者出院1年全因死亡的危险因素。结果1.155例大理州内的NVAF患者平均年龄为75.77岁;汉族77例(49.68%),白族62例(40.00%),其它少数民族16例(10.32%);吸烟者45例(29.03%),饮酒者22例(14.19%);CHA_2DS_2-VASC评分平均为5.26分,HAS-BLED评分平均为2.28分。2.入院时房颤知晓率为47.74%,抗凝治疗率为21.94%;接受抗凝治疗患者新型口服抗凝药使用率为70.59%,抗血小板治疗率为11.61%,其中阿司匹林占77.78%,氯吡格雷占16.67%。出院时房颤抗凝治疗率为70.97%,其中新型口服抗凝药使oncology access用率为89.09%,抗血小板治疗率为22.58%,其中阿司匹林占68.57%,氯吡格雷占31.43%。Logistic回归分析发现血栓栓塞性疾病(OR=70.014,95%CI 3.220～1522.320,P=0.007)、持续性房颤(OR=4selleckchem Baf-A1.052,95%CI 1.172～14.007,P=0.027)是出院时抗凝治疗的预测因素。男性患者(OR=0.232,95%CI 0.061～0.880,P=0.032)、既往出血史(OR=0.014,95%CI0.002～0.098,P<0.001)、抗血小板治疗(OR=0.048,95%CI 0.013～0.168,P<0.001)是出院时未抗凝治疗的预测因素。3.出院1年随访到133例患者,其中31例死亡(23.31%)。1年后房颤抗凝治疗率仅为51.96%,Logistic回归分析显示年龄≥75岁(OR=4.207,95%CI1.091-16.224 P=0.037)、血栓栓塞性疾病(OR=212.536,95%CI7.110-6352.904 P=0.002)、卒中史(OR=48.251,95%CI 2.054-1133.352 P=0.016)、持续性房颤(OR=12.656,95%CI 2.861-55.984 P=0.001)是抗凝治疗的预测因素;出血史(OR=0.082,95%CI 0.011-0.616 P=0.015)是非抗凝治疗的预测因素。Cox比例风险回归模型分析显示年龄(HR=1.057,95%CI 1.005～1.111,P=0.031)、纽约心功能分级IV级(HR=2.503,95%CI1.148～5.458,P=0.021)是NVAF患者全因死亡的危险因素。出院1年未抗凝治疗的原因中,27.03%的患者表示不知道需长期服药,24.32%的患者感服药效果不佳,10.81%的患者症状好转后停药,10.81%的患者出现出血情况。4.出院1年随访,有4例新发脑梗死,其中3例未抗凝治疗,1例抗凝治疗,有4例新发出血,其中2例抗凝治疗,2例抗血小板治疗。结论:大理地区老年非瓣膜性房颤患者入院时房颤知晓率、抗凝治疗率低,卒中风险较高;出院时抗凝治疗率高,但1年内全因死亡率也较高。出院后抗凝治疗率明显下降,急需建立有效的综合干预策略,以规范房颤患者的管理,改善预后。