饮食中脂质是诱发炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)的重要环境因素。脂质代谢产生脂毒性产物,可刺激机体产生促炎因子,破坏肠粘膜屏障,加重IBD的病程。s PLA_2X(基因pla2g10)是分泌型磷脂酶一员,对磷脂酰胆碱(PC)具有最高的催化活性,可水解PC产生促炎介质(如溶血磷脂LPC、花生四烯酸AA)和抗炎介质(如ω3-PUFA),在炎症、哮喘和动脉粥样硬化等疾病中起着重要作用。实验室前期初步发现高脂饮食小鼠s PLA_2X上调,但其在高脂诱导的结肠上皮损伤中到底有何作用以及分子机制尚不明确。目的:通过动物模型研究高脂饮食对小鼠结肠的损伤,通过细胞模型研究棕榈酸(PA)对结肠细胞NCM460的影响。探讨s PLA_2X对PA诱导的结肠细胞炎症和细胞凋亡的生物学作用与分子机制。通过生物信息学分析和PA诱导前后脂质代谢物变化,分析s PLA_2X调控结肠细胞脂质代谢的作用。方法:1.将C57BL/6小鼠分为正常饮食组(NCD)和高脂饮食组(HFD),HFD组喂食60%的高脂饲料,NCD组喂食正常小鼠饲料,构建高脂模型24周。通过q-PCR和免疫荧光检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-23细胞粘附分子Ibiotin protein ligasefng、巨噬细胞迁移抑制因子Cd74、趋化因子Cxcl13、脂肪酸代谢相关基因(Fabp2)和分泌型PLA_2(pla2g10,pla2g2a)的变化。2.将PA与正常结肠上皮NCM460孵育,构建体外高脂细胞模型。用不同浓度PA或溶剂处理NCM460,通过q-PCR检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及pla2g10与pla2g2a表达变化。3.用PCR法从NCM460中克隆pla2g10基因,将pla2g10插入慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-PURO,构建PCDH-pla2g10过表达载体。导入HEK-293T进行慢病毒包装,收集病毒液感染结肠上皮细胞NCM460。用嘌呤霉素筛选阳性细胞,通过Western Blot和q-PCR检测s PLA_2X表达水平。4.将细胞分为空载组(PCDH)和s PLA_2X过表达组(PCDH~(s PLA2X)),用不同浓度的PA或溶剂处理空载组和s PLA_2X过表达组细胞24 h。q-PCR和Western Blot检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平,通过丙二醛试剂盒检测MDA的变化。5.从GEO数据库下载炎症性肠病患者和健康对照组的基因表达数据,通过Spearman分析溃疡性结肠炎发炎患者、未发炎患者及健康对照组中IL-6、IL-1β、TNF-α与pla2g10相关性。6.将PCDH和PCDH~(s PLA2X)细胞铺96孔板,待细胞贴壁后,分别用0、100、200、300、400、500、600、700、800μM的PA处理细胞24 h,通过CCK8试剂检测过表达s PLA_2X后结肠细胞对PA损伤的抵抗。7.将PCDH和PCDH~(s PLA2X)细胞铺6孔板,分别用300、400μM PA或溶剂处理两组细胞24 h,通过7ADD-PE凋亡试剂盒进行染色,流式细胞法检测s PLA_2X过表达对PA诱导的NCM460凋亡的影响。通过Western Blot和q-PCR检测凋亡过程中cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白与基因表达情况。8.从GEO数据库下载炎症性肠病患者和健康对照组的基因表达数据,按pla2g10表达水平分为高表达组(PLA2G10~H)和低表达组(PLA2G10~L),通过GSEA分析溃疡性结肠炎患者中PLA2G10~H和PLA2G10~L中IL6-JAK-STAT3通路激活情况。用400μM PA处理PCDH和PCDH~(s PLA2X)细胞24 h,通过Western Blot检测s PLA_2X过表达对PA处理后结肠细胞IL6-JAK-STAT3通路的影响。9.用脂质提取液提取上述两类细胞的脂质代谢物,使用氮吹仪吹干,通过超高效液相色谱联用质谱(UHPLC-MS)检测长链脂肪酸FA、溶血磷脂酰肌醇LPI、溶血卵磷脂LPC、二脂酰甘油DG等脂质代谢物变化。结果:1.在小鼠高脂模型中,与正常饮食小鼠结肠相比,高脂饮食小鼠结肠中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL23、细胞粘附分子Ifng,巨噬细胞迁移抑制因子Cd74和IFN-γ、TGF-β、Cxcl13表达都显著上升,而脂肪酸结合蛋白Fabp2表达显著下Smoothened Agonist生产商降,pla2g10在高脂饮食小鼠的结肠中显著上调。2.在细胞高脂模型中,高浓度PA诱导NCM460细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平上升,PA诱导后pla2g10表达显著升高。3.成功获得了重组PCDH-pla2g10载体,基因测序结果显示pla2g10序列正确。PCDH~(s PLA2X)细胞的s PLA_2X蛋白和m RNA水平较空载组表达显著增加,表明s PLA_2X过表达NCM460细胞系构建成功。4.细胞实验表明,正常培养条件下过表达s PLA_2X对NCM460细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达无https://www.selleck.cn/products/MLN8237.html明显影响。当用400μM的PA处理细胞时,与空载组相比,过表达s PLA_2X能显著降低PA诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白的表达水平。5.Spearman分析结果显示,在溃疡性结肠炎发炎患者中(n=74),pla2g10与炎症因子IL6、IL1β、TNF-α负相关;在溃疡性结肠炎未发炎患者中(n=23),pla2g10与IL6、IL1β、TNF-α无相关性;同样在正常组中(n=11),pla2g10与上述三种炎症因子也无相关性。6.通过CCK8检测发现:结肠细胞细胞活力随PA浓度增加而降低,而在200-400μM PA浓度下,过表达s PLA_2X能显著减轻PA对结肠细胞活力损伤,但当PA浓度大于500μM时,过表达s PLA_2X对PA引起的细胞损伤无保护作用。7.凋亡检测发现400μM PA可导致14%的NCM460细胞凋亡,而在s PLA_2X过表达组,细胞凋亡降至3.7%。Western Blot结果显示过表达s PLA_2X能下调cleaved-caspase3、Bax表达,并上调Bcl-2蛋白表达来减少PA导致的细胞凋亡。8.GSEA分析结果显示,在s PLA_2X低表达时,IL6-JAK-STAT3通路被激活。通过Western blot检测发现PA可上调JAK2,STAT3蛋白磷酸化,增加SOCS3蛋白表达,而过表达s PLA_2X能抑制JAK2,STAT3蛋白磷酸化,降低SOCS3蛋白表达。9.脂质代谢分析结果显示,PA刺激结肠细胞长链脂肪酸FA(26:1)、溶血磷脂酰肌醇LPI(20:4)、溶血卵磷脂LPC(3:0)、前列腺素脂质类FA(23:5)、二酰甘油DG(28:1)等促炎脂质含量上升,而过表达s PLA_2X能够降低长链脂肪酸、LPC、LPI、前列腺素等促炎脂质含量。结论:PA刺激结肠细胞促炎脂质如LPC、前列腺素、二酰甘油等产生,而过表达s PLA_2X能够降低长链脂肪酸、LPC、LPI、前列腺素等促炎脂质含量,从而降低炎症因子表达,抑制IL6-JAK-STAT3通路激活,减轻结肠细胞凋亡,增加细胞活力,进而保护结肠细胞。
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青少年抑郁症患者自杀态度、意念及其与家庭环境的关系
目的 调查青少年抑郁症患者自杀态度、意念,并分析其与家庭环境的关系,旨在为临床治疗青少年抑郁症并降低其自杀率提供相关依据。方法 选取2019年3月-2021年10月六安地区确诊的376例青少年抑郁症患者作为研究对象设为病例组,另选取376例正常青少年设为对照组。采用自杀态度调查问卷(QSA)、Beck自杀意念评估量表(BSS)、家庭环境量表(FES-CV)对两组青少年的自杀态度、自杀意念及家庭环境进行调查,并采用Logistic回归分析法分析青少年抑郁症患者自杀态度、意念的影响因素。采用Pearson相关性检验分析青少年抑郁症患者自杀态度、意念与家庭环境的相关性。结果 病例组的QSA、BSS量表得Optical immunosensor分高于对照组(t=43.352、96.527,P<0.001);病例组FES-CV量表中的亲密度、情感表达、知识性、娱乐性得分低于对照组(t=25.487、14.573、22.160、18.906,P<0.001),矛盾性得分高RepSox于对照组(t=30.311),差异有统计学意义(P<SAHA抑制剂0.001)。Logistic回归分析显示,年龄20～25岁(OR=2.016、2.261)、病情重度(OR=2.115、2.192)、成长环境为城市(OR=2.442、2.557)均为青少年抑郁症患者对自杀持积极态度、自杀意念强的危险因素(P<0.05)。病例组的QSA、BSS量表得分与FES-CV量表中的亲密度、情感表达、知识性、娱乐性得分均呈负相关(QSA:r=-0.891、-0.933、-0.788、-0.698,BSS:r=-0.901、-0.832、-0.725、-0.637,P<0.05),与矛盾性得分呈正相关(r=0.848、0.883,P<0.05)。结论 青少年抑郁症患者的自杀态度、意念均高于正常青少年,年龄、病情、成长环境均为青少年抑郁症患者自杀态度、意念的影响因素,且患者自杀态度、意念与家庭环境密切相关。
高粱淀粉的结构性质及定向调控
淀粉,除了作为人类主要能量来源之外,在非食品领域,如造纸、纺织、粘合剂、可生物降解塑料、制药和护肤品等应用广泛。其在各领域中的应用与理化特性直接相关,而理化特性是由淀粉来源和多尺度结构决定,因此,明确淀粉多尺度结构是实现各类型淀粉精准应用的前提。目前,针对天然淀粉在溶解性、凝胶性能和粘弹性、重结晶和消化性等方面存在的诸多不足,多采用化学、物理和生物学方法改性淀粉以赋予其新功能。生物学方法作为“绿色改性”方法之一可以在上游调控淀粉合成,以生产更多符合工业和社会需求的淀粉类型,是国内外研究人员共同关注的热点问题。高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)作为C4植物,因其抗盐碱、干旱、热胁迫等恶劣环境的能力强,被广泛种植于热带、亚热带和温带地区,是世界上仅次于小麦、玉米、水稻和大麦的第五大重要谷物作物。淀粉是高粱籽粒的主要成分(65%-70%),充分深入研究高粱淀粉的结构性质对拓宽高粱、高粱淀粉及selleck产品淀粉产业具有重要意义。然而,针对“从高粱淀粉的合成源头调控淀粉结构”的研究鲜有报道。在现阶段高粱种质资源的基础上,明确如何通过遗传转化的方式获取新型高粱淀粉类型对扩展淀粉应用有重要意义。本研究以不同直链淀粉含量高粱淀粉理化特性差异为基础,采用“倒序的方式”,探究不同品系不同生长阶段高粱胚乳中淀粉颗粒多尺度结构生长演变规律;通过转录组测序深入探讨调控淀粉多尺度结构合成基因的种类及功能;通过基因工程技术获取了多种类型高粱淀粉并在体外纯化获取了调控高粱淀粉合成的三种关键基因,进一步构建了淀粉合成关键基因-结构-性质的关系网络,为实现在高粱淀粉合成的源头精准调控淀粉结构提供了参考依据。主要研究内容如下:(1)不同品系不同生长阶段高粱淀粉多尺度结构与理化特性分析。结果显示发育过程中糯高粱、粘高粱和H37高粱中直链淀粉含量分布范围分别为4.80%-6.25%、5.82%-9.76%和17.87%-27.47%。中间级分在淀粉生成初期即存在,在蜡质高粱发育后期直链淀粉通过中间级分转化为支链淀粉;发育19天糯高粱支链淀粉中B1链含量最高,而粘高粱与之相反。通过分析支链淀粉内链发现,H37高粱淀粉内链聚合度高于蜡质高粱淀粉。高粱淀粉颗粒半结晶层状结构厚度介于9.4-10.7nTelaglenastat体内实验剂量m,且属于典型的A型结晶结构,其相对结晶度随发育时间延长增加。不同发育阶段糯、粘和H37高粱淀粉的~(13)C CP/MAS NMR图谱均在100-106ppm(C1)处出现了三个独立峰。发育10-19天高粱淀粉颗粒大小和光滑程度不均一,但是呈现规则形状,且颗粒表面存Farmed sea bass在孔径为178-298nm的微孔。随着发育时间延长,颗粒表面因受挤压成为不规则多边形,且微孔通道深度加深。此外,淀粉的焓值和抗水解能力均随着生长期延长而增长,但是蜡质高粱淀粉颗粒的水解速率显著高于H37高粱淀粉。(2)通过转录组测序分析明确了高粱胚乳中淀粉与蔗糖合成代谢通路:Ko00500。该通路共涉及184个基因,在高粱淀粉合成过程中发挥生理功能的基因有22个,但是在糯、粘和H37高粱中与淀粉合成相关酶直接相关且具有高表达量的基因共13个。基因的功能总结为如下:(1)AGPLS1决定籽粒产量;(2)GBSSI主要负责直链淀粉合成,参与支链淀粉长B链合成;(3)SSSI是支链淀粉合成必不可少的酶,SSSIIa和SSSIIIa分别负责DP>25和12
用系统发育学方法推断长期核苷(酸)类似物治疗应答不佳患者体内HBV复制动态
目的 了解核苷（酸）类似物治疗应答不佳的慢性乙型肝炎患者体内HBV的动态变化，以帮助指导治疗方案的调整以及新药的合成。方法 抽提同一患者多个时间点（≥arsenic biogeochemical cycle2个，至少间隔3个月）的血清HBV Staurosporine试剂RNA，进行高通量测序，构建系统发育树，计算遗传距离，分析耐药突变，推算HBV在治疗应答不佳患者体内的动态复制过程。结果 在治疗应答不佳的患者体内可以观察到HBV的进化及耐药突变体的出现，进化树的拓扑结构明显，遗传距离增加，且遗传距离的改变与血清HBV DNA水平变化一致；最大似然树更适合推断病毒的复制，而邻接树则更适合推断感染细胞的克隆增殖；某些病毒突变体可在应答不佳患者体内长期持续存在。结论 系统发育分析可以很Q-VD-Oph使用方法好地检测宿主体内HBV的复制动态，在实际研究中应当根据研究目的选择合适的建树方法。
2，4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU及其工程菌催化吲哚转化靛蓝的研究
2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU作为一种新颖的羟化酶,具有较广的芳香族化合物底物谱,对多种氯酚类和联苯类底物均有一定的催化活性。课题组前期通过对TfdB-JLU底物非专一性(substrate promiscuity)与蛋白结构之间关系的研究,利用半理性设计对其催化氯酚类和联苯类底物的非专一性实现了调控。近期研究发现,TfdB-JLU还可以催化多种吲哚类杂环芳香化合物,但目前尚不清楚其催化机制,具有实际应用价值的吲哚生物催化转化体系也鲜有报道。本研究一方面通过对TfdB-JLU的结构及其与吲哚之间的相互作用分析,选择可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性中心的氨基酸作为突变位点,通过对野生型及其突变体进行表达、纯化、酶活检测,结合分子动力学模拟研究,对TfdB-JLU催化吲哚的机制进行了初步探究;另一方面考虑到酶促吲哚生物转化过程中酶纯化过程繁琐、耗损率高和需要额外添加昂贵的辅酶等因素,本研究探讨了以TfdB-JLU工程BAY 73-4506供应商菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化路径,并对转化条件进行了优化,为探索TfdB-JLU催化吲哚生物转化的实际应用提供了可能性。本研究的主要内容和研究结果如下:(1)2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB-JLU催化吲哚的研究以2-羟基联苯-3-单加氧酶(PDB ID:5BRT)的晶体结构为模板进行同源模建得到TfdB-JLU的结构,利用Auto Dock 4.2与吲哚进行分子对接;基于分子对接结果选择了His47、Met251、Pro316这三个可能与底物具有相互作用或影响底物进入活性口袋的位点进行单点和组合突变,对TfdB-JLU的野生型和突变体进行表达、纯化和酶活检测,发现与野生型相比,突变体M251G和P316G提高了对吲哚的催化活性,而突变体H47A、M251G/P316G则基本丧失了对吲哚的催化活性。通过分子对接结果推测,突变体P316G催化吲哚活性提高的原因可能是酶与吲哚之间的价键作用增加,提高了与吲哚的亲和力;突变体M251G催化吲哚活性提高的原因可能是突变后酶活性口袋的入口变大,更有利于底物的进入;突变体H47A催化吲哚活性基本丧失,说明47位的组氨酸可能是TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一。通过对野生Staphylococcus pseudinter- medius型和突变体的分子动力学模拟研究推测组合突变体M251G/P316G催化吲哚活性大幅降低的原因可能是突变对活性口袋附近的结构柔性改变太大导致酶的稳定性降低。(2)TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的研究本研究建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,并对转化条件进行了优化,以提高吲哚转化靛蓝的效率。结果表明TfdB-JLU工程Cobimetinib作用菌的全细胞催化能够将吲哚转化为靛蓝,靛蓝的起始产率为11.9%;对转化条件进行优化后的最适条件为:培养基为M9培养基,诱导时间为8 h,吲哚浓度为2.5 m M,反应温度为25℃,反应时间为16 h,反应p H为9,在此条件下TfdBJLU工程菌催化吲哚转化靛蓝的产率达到35.7%。综上所述,本研究运用蛋白质工程和生物信息学手段对TfdB-JLU催化吲哚进行了初步研究,发现酶局部结构变化会对TfdB-JLU与吲哚的结合方式、结合能力和酶的稳定性产生影响,进而影响其催化吲哚的能力,同时发现47位的组氨酸可能是影响TfdB-JLU催化吲哚的关键氨基酸之一,为TfdB-JLU催化吲哚机制的解析奠定了一定基础;本研究也建立了TfdB-JLU工程菌全细胞催化吲哚转化靛蓝的生物转化体系,将对吲哚类废水的处理和资源化转化具有重要意义。
葛根素通过AMPK调控的铁死亡信号通路保护脓毒症心肌损伤的作用研究
背景和目的:葛根素作为从中药野生葛根中提取的天然活性产物,因其在临床应用上表现出多靶点作用,目前广泛用于多种心血管疾病的治疗,如动脉粥样硬化、缺血性心肌病、心肌肥厚以及心律失常等。研究显示,葛根素可有效改善脓毒症引起的心肌损伤,但其心肌保护作用的机制研究并不全面,目前认为主要与抑制炎症反应及氧化应激等机制有关。铁依赖性铁死亡是一种新发现的脂质氧化调控的细胞死亡模式,与传统的细胞死亡模式不同,其发生机制主要是与铁死亡促进剂(Erastin)抑制胱氨酸进入细胞内有关,导致谷胱甘肽耗竭和谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)失活,进而大量Fe~(2+)进入线粒体,产生大量活性氧(ROS),最终导致细胞死亡。已证实铁死亡在多种原因引起的心肌损伤中起着关键作用,如糖尿病心肌病、缺血性心肌病以及脓毒症心肌损伤等。研究显示,脓毒症发生后,脂多糖(LPS)通过与位于免疫细胞及其它细胞上的Toll样受体(TLRs)相互作用,从而促使机体产生大量炎性细胞因子,影响线粒体内氧化呼吸链的偶联过程,进一步导致ROS的增多从而促进氧化应激反应发生对心肌细胞造成损伤,同时,ROS的蓄积又可引起铁死亡的发生,从而导致了细胞死亡。因此,抑制铁死亡的发生发展可改善脓毒症心肌损伤。目前认为,多种信号通路均可调控铁死亡的发生,其中AMPK信号通路是其调控通路之一,激活该通路可抑制铁死亡的发生发展。而研究显示,葛根素可通过激活AMPK信号通路进而改善多种心肌疾病,包括病理性心肌肥厚和心肌缺血损伤等。因此,我们推测葛根素可以通过活化AMPK信号通路进而抑制炎症反应、氧化应激以及铁死亡的发生从而减轻LPS诱导的心肌损伤。综上所述,本研究的目的是首先通PEG300说明书过离体细胞明确葛根素对脓毒症心肌损的保护作用,并进一步通过在体动物实验验证葛根素是否通过活化AMPK信号通路抑制铁死亡改善脓毒症心肌损伤,为明确其作用机制提供理论依据。方法:1.第一部分:葛根素对LPS诱导的H9c2细胞毒性损伤的保护作用。根据处理方法不同,将H9c2细胞分成5组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)、脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂(LPS+Pue+Era组)以及脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C(LPS+Pue+CC组)。测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平以及铁离子含量;观察细胞活力以及细胞凋亡情况;测定心肌细胞中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)以及磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平。2.第二部分:葛根素抑制铁死亡介导的脓毒症心肌损伤。将36只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)和脓毒症+葛根素组+铁死亡促进剂(LPS+Pue+Era组)。除对照组腹腔注射等量生理盐水外,分别使用葛根素(Pue)以及葛根素联合铁死亡促进剂(Era)对脓毒症大鼠进行处理;采样前行超声心动图评估心功能;测定血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(c Tn I)及乳酸脱氢酶(LDH)的水平以及大鼠心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化酶(MDA)的活性;观察心肌组织的病理变化;测定心肌组织中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、铁蛋白(Ferritin)、转铁蛋白受体(TFR)PD-0332991研究购买、磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平以及铁离子含量;测定凋亡蛋白(Cleaved-caspase3)Isolated hepatocytes、促凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达水平;TUNEL法染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况。3.第三部分:葛根素通过激活AMPK信号通路抑制铁死亡。将12只健康雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、脓毒症组(LPS组)、脓毒症+葛根素组(LPS+Pue组)和脓毒症+葛根素组+AMPK抑制剂Compound C(LPS+Pue+CC组)。分别使用Pue以及Pue联合AMPK抑制剂Compound C(CC)对脓毒症大鼠进行处理。测定心肌组织中铁蛋白(Ferritin)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、转铁蛋白受体(TFR)、磷酸化AMPK(P-AMPK)的表达水平以及铁离子含量。结果:1.第一部分:1.1葛根素可以改善LPS诱导的H9c2细胞损伤,降低LDH及TNF-α的水平,减少细胞凋亡,上调GPX4的表达水平并降低铁离子含量。1.2葛根素的脓毒症心肌保护作用可被铁死亡促进剂Era以及AMPK抑制剂CC废除。2.第二部分:2.1葛根素可以下调大鼠血清中心肌损伤标记物CK-MB、LDH和c Tn I的浓度。并且通过观察HE切片发现,葛根素可以减轻LPS诱导的心肌组织损伤。2.2葛根素可以改善LPS模型大鼠的左室射血分数和左室短轴收缩率。葛根素可以抑制LPS诱导的炎症反应,并且可以下调炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α的表达。葛根素可以抑制LPS诱导的氧化应激反应,上调抗氧化指标GSH和SOD的表达以及抑制脂质过氧化指标MDA的表达。2.3检测各组大鼠凋亡相关蛋白和观察TUNEL染色结果,结果显示葛根素可以促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并抑制凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Bax的表达,进而减少心肌细胞凋亡。2.4葛根素可以促进LPS大鼠模型心肌组织中GPX4和Ferritin的表达,并且抑制ACSL4和TFR的表达。此外葛根素还可促进心肌组织中AMPK的磷酸化,并且铁死亡促进剂Era对AMPK的磷酸化无影响。铁死亡促进剂Era可抑制葛根素的抗炎、抗氧化应激和抗凋亡作用。3.第三部分:3.1葛根素提高了脓毒症大鼠心肌组织中AMPK磷酸化水平。3.2 AMPK抑制剂CC促进了脓毒症心肌组织中铁死亡的发生,且其可废除葛根素对铁死亡的抑制作用。结论:1.离体细胞实验及在体动物实验均证实葛根素可以通过抑制LPS诱导的心肌细胞铁死亡的发生,进而对脓毒症心肌损伤产生保护作用并改善心脏功能。2.葛根素可以上调脓毒症心肌细胞毒性损伤模型中AMPK的磷酸化水平。3.铁死亡促进剂Era和AMPK抑制剂CC均可有效废除葛根素对脓毒症心肌损伤的保护作用。4.葛根素可通过调控AMPK调控的铁死亡信号通路对脓毒症心肌损伤进行保护。
乙肝病毒X蛋白抑制逆转录元件Ⅰ型长弥散核元件（LINE-1）逆转座活性的现象及机制研究
研究背景及目的:人类乙型肝炎病毒(HBV)能够感染人类宿主并引发慢性持续感染,可能导致感染者出现肝炎、肝硬化、肝细胞癌,严重威胁人类生命健康。HBV基因组编码的乙肝病毒X蛋白(HBx),是一种具有多种调节功能的蛋白,参与宿主信号转导调节、基因转录、蛋白质降解等过程,在HBV高效复制、基因组整合、逃逸宿主免疫反应中发挥重要生物学功能,对HBV感染、疾病慢性化以及肿瘤的发生有重要意义。I型长弥散核元件(LINE-1)是人体细胞中唯一已知具有自主转座活性的非LTR逆转录元件,在基因组进化、基因组稳定性以及宿主天然免疫反应中均具有重要生物学意义。有关HBV与逆转录元件之间是否存在直接相互作用,目前仍缺乏广泛的证据。LINE-1在复制过程中可以破坏DNA的稳定性并激活干扰素信号系统,两者均可对HBV的感染复制及整合过程产生负面影响。作为应对措施,HBV可能会利用自身蛋白来抑制LINE-1的逆转座活性。HBx作为一种多功能调节因子,其C端功能区更是具有结合RNA、DNA能力,提示HBx蛋白作为HBV的重要组成成分,极有可能对LINE-1的活性存在调控作用,相关研究成果对深入考察HBV、LINE-1、天然免疫系统三者之间的关系将产生明确的指导作用。本研究拟聚焦HBx与LINE-1,围绕HBx是否影响LINE-1活性展开研究,逐步探讨HBx蛋白与LINE-1之间的相互作用、可能机制及其生物学意义。研究方法:1、考察HBx蛋白对LINE-1逆转座活性的影响:采用学术界广泛使用的、依赖报告基因表达的LINE-1逆转座活性实验,通过流式细胞学检测、Western blotting等实验方法,考察HBx是否影响LINE-1的活性。2、探索HBx蛋白调控LINE-1活性的分子机制:LINE-1的复制分为RNA转录、蛋白表达、RNP组装、TPRT及整合五大步骤。因此,通过Western blotting、Luciferase、co-IP、qRT-PCR等实验方法,分别考察HBx是否对LINE-1 5’-UTR启动子活性,LINE-1RNA稳定性、LINE-1蛋白ORF1p和ORF2p的表达及稳定性、LINE-1 RNP的组装及功能以及LINE-1的整合能力产生影响,探究HBx调控LINE-1活性的具体机制。3、鉴定HBx蛋白影响LINE-1活性的关键功能区:构建HBx的不同截短体或突变体,通过上述实验考察HBx影响LINE-1活性的关键功能区,并对HBx调控LINE-1活性的分子机制进行反向验证。4、解析HBx蛋白影响LINE-1活性的生物学意义:通过Luciferase、ELISA、qRT-PCR等实验方法考察HBx、LINE-1、干扰素三者之间作用关系;通过彗星实验方法考察HBx对LINE-1破坏基因组(或ds DNA)稳定性这一功能的影响。研究结果:1、HBx蛋白具有抑制LINE-1活性的功能通过LINE-1逆转录转座试验考察HBx对LINE-1逆转录转座活性的影响,结果发现:HBx蛋白可以有效抑制LINE-1的逆转座活性,且在一定程度内,这种抑制作用具有剂量依赖性。2、HBx结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性对HBx蛋白抑制LINE-1活性的机制研究提示:HBx蛋白不影响LINE-1 5’-UTR的启动子活性;而是通过结合LINE-1 RNA,破坏LINE-1 RNA稳定性,从而下调LINE-1ORF1p和ORF2p蛋白的表达并发挥限制LINE-1活性的作用。3、HBx 120-141片段对HBx下调LINE-1逆转座活性十分重要实验结果表明,HBxΔ120-141不再能够有效结合并下调LINE-1 RNA,在对LINE-1活性抑制上也表现出功能性缺陷。4、HBx蛋白抑制LINE-1活性的现象具有潜在的生物学意义彗星实验结果表明,HBx在抑制LINE-1活性的同时,可以使基因组免于LINE-1复制过程中所产生的破坏;对细胞内干扰素表达水平的考察结果也证实,HBx可以下调LINE-1selleck产品对先天免疫系统的活化selleck合成能力。研究结论:本研究发现HBx蛋白可以识别LINE-1 RNA上的ORF1和ORF2区域,从而结合并破坏LINE-1 RNA的稳定性,进而下调LINE-1蛋白的表达,最后实现对LINE-1活性的抑制;HBx 120-141区域是HBx抑制LINE-1活性的关键功能区,缺失这一区域后,HBxΔ120-141不再能够实现对LINE-1 RNA的识别与结合;通过对LINE-1活性的抑制,HBx可以保护基因组(或其它双链DNA)的稳定性免受破坏,也可以在HBV复制期间降低细胞内的干扰素水平;本研究揭示了HBx具有调控LINE-1活性的全新功能与相关分子机制,解析了这一现象的潜在生物学意义,并讨论了其对HBV感染复制的可能影响,这是本研究的创新点。后续研究将进一步解析HBx在HBV感染复制过程中的作用与机制,从而为靶向HBx的药物设计,优化抗HBV治疗策略提供sexual transmitted infection更新的角度和更有效的参考。
miR-144/451调控精神分裂症表型及抗氧化应激相关研究
精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种慢性重性精神疾病,其特征在于一系列可共存的不同症状,包括幻觉、妄想、情感平淡、社交退缩和认知障碍等。目前精神分裂症的发病机制尚不十分明确,治疗手段亦有限,因此,探索精神分裂症的深层机制、寻找其治疗靶点意义深远。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类非编码RNA,通过序列特异性碱基配对与靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’端非编码区(3’UTR)相互作用以降解靶mRNA或抑制翻译,从而下调(沉默)目的基因的表达。每个miRNA都可能调节数百个靶基因的表达,因而miRNAs的功能失调,特别是这种失调发生在中枢神经系统时,临床意义是重大的,对研究疾病潜在的分子机制和开发有效的治疗方法而言都是巨大的挑战。充分证据表明miRNAs在精神分裂症的发生发展中发挥重要作用。miR-144/451是一个双顺反子miRNA基因位点,编码miR-144和miR-451两种miRNAs。大量数据表明,miR-144/451参与调控多种神经精神类疾病如抑郁症、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等,但其对精神分裂症是否有调控作用未见相关研究。基于以上背景,本研究旨在明确miR-144/451是否对精神分裂症有调控作用,并探讨可能的分子机制,为精神分裂症提供新的miRNA靶点的思路,分为以下3个部分:第一部分:miR-144/451敲除对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:通过遗传学方法繁殖小鼠获得同窝野生型(WT)小鼠和miR-144/451基因敲除(KO)小鼠并建立精神分裂症小鼠模型,明确miR-144/451敲除对精神分裂症表型是否有调控作用。方法:1.分别将同窝WT和KO小鼠随机分为conWT组、SZWT组和conKO组、SZKO组。通过连续腹腔注射14天(+)-MK-801建立精神分裂症小鼠模型,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.评估小鼠精神分裂症症状:利用旷场实验检测小鼠genetic phenomena自发活动度(阳性症状),利用前脉冲抑制实验检测小鼠感觉门控selleckchem功能状态,利用筑巢实验检测认知功能,利用强迫游泳实验检测焦虑抑郁程度(阴性症状)。3.采用原位杂交法检测conWT组和SZWT组海马区miR-144和miR-451的mRNA水平。4.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组小鼠前额叶皮质和纹状体中多巴胺含量。结果:1.旷场实验中,conWT和conKO小鼠的活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05),腹腔注射MK-801能显著增加SZWT和SZKO小鼠的活动路程和平均速度即小鼠自发活动过度(P均<0.05),而SZKO小鼠的自发活动较SZWT小鼠显著减少(P<0.05)。前脉冲抑制实验中,conKO小鼠较conWT小鼠的PPI%显著降低(P均<0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠的PPI%(P均<0.01),而在前脉冲刺激为80dB和85dB时显著升高SZKO小鼠的PPI%(P均<0.05)。SZKO小鼠的PPI%较SZWT小鼠显著升高(P均<0.05)。筑巢实验中,conWT和conKO小鼠的筑巢评分无显著差异(P>0.05)。MK-801注射能显著降低SZWT小鼠筑巢评分(P<0.001),而SZKO小鼠评分较SZWT小鼠显著升高(P<0.01)。强迫游泳实验中,conWT和conKO小鼠的不动时间无显著差异(P>0.05)。MK-801注射显著延长SZWT和SZKO小鼠的不动时间(P均<0.001),而SZKO小鼠的不动时间较SZWT小鼠显著缩短(P<0.001)。2.MK-801注射显著增加SZWT小鼠海马区miR-144和miR-451 mRNA水平(P均<0.001)。3.conWT和conKO小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量无显著差异(P均>0.05)。MK-801注射显著降低SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量而显著升高纹状体中多巴胺含量(P均<0.001)。SZKO小鼠前额叶皮质中多巴胺含量的降低程度和ABT-263生产商纹状体中多巴胺含量的升高程度均显著弱于SZWT小鼠(P均<0.01)。结论:miR-144/451基因敲除后小鼠精神分裂症症状及多巴胺失调明显改善,提示其对精神分裂症有明显调控作用,同时发现腹腔注射MK-801后SZWT小鼠海马区miR-144/451 表达增加。第二部分:脑内miR-144/451过表达对精神分裂症小鼠模型表型的调控作用目的:明确脑内过表达miR-144/451对精神分裂症表型的调控作用。方法:1.将WT小鼠随机分为con组,ago组,SZ组和SZago组,通过脑立体定位注射miR-144-3p和miR-451a agomir混合物实现miR-144/451的脑内过表达,以等量miR-NC为对照。连续腹腔注射14天(+)-MK-801诱发精神分裂症症状,注射剂量为0.2mg/kg,以等量生理盐水为对照。2.利用旷场实验检测小鼠自发活动度(阳性症状),利用筑巢实验检测小鼠认知功能。3.应用ELISA法检测小鼠前额叶皮质和纹状体中的多巴胺含量。结果:1.旷场实验中con组与ago组小鼠活动路程和平均速度无显著差异(P均>0.05)。SZago组小鼠活动路程和平均速度较SZ组小鼠显著增加(P均<0.05)。筑巢实验中con组和ago组筑巢得分无显著差异(P>0.05),SZago组和SZ组相比筑巢得分无显著差异(P>0.05)。2.con组和ago组前额叶皮质及纹状体中多巴胺含量均无显著差异(P均>0.05)。SZago组前额叶皮质中多巴胺含量较SZ组显著减少(P<0.001),纹状体中多巴胺含量较SZ组显著增多(P<0.001)。结论:脑内miR-144/451过表达加重精神分裂症症状和多巴胺失调,再次提示miR-144/451参与调控精神分裂症。第三部分:miR-144/451对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症的调控作用目的:利用自第一部分收集的前额叶皮质样本和制作的冰冻切片探讨miR-144/451 是否对精神分裂症小鼠模型脑内氧化应激和神经炎症有调控作用。方法:1.应用试剂盒检测各组小鼠前额叶皮质中丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)的含量,进一步应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠前额叶皮质中抗氧化酶包括NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1)、超氧化物歧化酶1(Sod1)、超氧化物歧化酶2(Sod2)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx1)、过氧化氢酶(Cat)的mRNA相对表达量。2.采用免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白B-细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)及小胶质细胞标志物离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的蛋白表达量。3.采用免疫荧光双染法检测各组前额叶脑区Iba-1和神经元核抗原(NeuN)的原位表达量。4.采用原位末端标记(Tunel)法检测各组前额叶脑区细胞凋亡数。结果:1.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中MDA的含量(P均<0.001),SZWT小鼠较SZKO小鼠MDA含量显著增加(P<0.05);可显著下调前额叶皮质中GSH、SOD、ATP的含量及NQO1、Sod1、Sod2、Gpx1和Cat的mRNA相对表达量(P均<0.01),SZWT小鼠较SZKO小鼠显著减少(P均<0.001)。2.MK-801注射可显著上调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质中Iba-1蛋白的表达量及Iba-1阳性细胞数(P均<0.001),而SZWT小鼠较SZKO小鼠Iba-1蛋白表达量和Iba-1阳性细胞数显著增加(P均<0.001)。3.MK-801注射可显著下调SZWT和SZKO小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白的表达量而显著上调Bad蛋白的表达量(P均<0.001),可显著上调Tunel阳性细胞数(P均<0.001)。SZWT小鼠前额叶皮质Bcl-2蛋白表达量较SZKO小鼠显著减少,而Bad蛋白表达量和Tunel阳性细胞数较SZKO小鼠显著增多(P均<0.01)。结论:miR-144/451缺失可能通过发挥抗氧化应激、抗凋亡和抑制小胶质细胞激活的作用抑制精神分裂症的进展,改善精神分裂症症状。
抑制髓样细胞触发受体-1(TREM-1)减轻慢性间歇性低氧诱发的模型小鼠动脉粥样硬化
目的 探究髓样细胞触发受体-1(TREM-1)在慢性间JNJ-42756493歇性低氧(CIH)诱发的动脉粥样硬化(AS)中作用。方法 将ApoE~(-/-)小鼠随机分为空白组、模型组和实验组获悉更多。模型组和实验组小鼠饲养于低氧环境，给予高脂饲料喂养；实验组小鼠高脂饲养4周后，腹腔注射TREM-1抑制剂LR12(5 mg/kg),连续干预8周。饲养12周后，检测血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、白flow mediated dilatation细胞介素10(IL-10)水平；组织学分析主动脉TREM-1表达、斑块面积及巨噬细胞水平。结果 与空白组相比，模型组小鼠主动脉TREM-1表达量显著升高(P<0.05)。相比于模型组，实验组小鼠主动脉斑块显著减少，血清血脂(TC、LDL、TG)及炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-10)水平显著降低，主动脉斑块及斑块浸润巨噬细胞、TREM-1表达显著减少(P<0.05),且斑块中TREM-1表达与巨噬细胞为共定位。结论 TREM-1参与CIH诱发的AS发生发展，抑制TREM-1能够减轻CIH诱发的AS,其机制与抑制巨噬细胞活化有关。
MrMYB1/2基因簇成员与MrGST1在调控杨梅果实花青苷积累中的作用及其机制研究
杨梅(Morella rubra)是一种果实色泽变异较大的果树,营养丰富且具有重要的经济和药用价值。色泽是评价果实品质的关键性状之一,而花青苷含量是决定杨梅果实色泽的主要因素。近年来,有关杨梅果实花青苷调控研究集中在鉴别花青苷生物合成基因和转录因子上,但品种间果实色泽差异的内在机制缺乏深入研究。本文以多个果实色泽不同的杨梅品种为研究材料,探究MrMYB1/2基因簇成员的结构和表达特性、功能差异与调控机制,以及MrGST1在杨梅花青苷转运中的功能与机制。主要结果如下:1.鉴定了一个与花青苷积累相关的MrMYB1/2基因簇,包括4个成员:MrMYB1.1、MrMYB1.2、MrMYB1.3和MrMYB2。在4个果实颜色各异的主栽品种中克隆基因簇成员,发现每个成员有2–3个等位基因。其中MrMYB1.1在不同品种中的基因型与果实颜色紧密相关,共有2个等位基因:MrMYB1.1-1(MrMYB1.1~n)和MrMYB1.1-2(MrMYB1.1~d)。前者是结构完整的R2R3型MYB基因,在果实紫黑色品种‘荸荠’中为纯合,后者因缺失一个碱基造成移码突变,转变为一个缺失R2和部分R3结构域的MYB基因,在果实白色品种‘水晶’中为纯合。MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d在果实红色品种‘东魁’和果实粉红色品种‘粉红’中为杂合。基于MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d基因型开发的CAPS标记能够准确并快速鉴别不同颜色果实的杨梅品种。MrMYB1.2、MrMYB1.3和MrMYB2的等位基因基因型与果实颜色之间没有相关性。MrMYB1.1、MrMYB1.2和MrMYB2在4个品种果实成熟过程中表达量逐渐升高且品种间差异较小。MrMYB1.3仅在果实紫黑色品种‘荸荠’中表达,且表达量与‘荸荠’果实成熟过程中的花青苷含量呈现一定的相关性。共线性分析表明,调控花青苷积累的MYB基因簇在部分双子叶植物的基因组具有高度保守性,可能在进化中具有独特的意义。2.烟草叶片瞬时表达分析发现MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以诱导花青苷积累,而MrMYB1.1~d、MrCP-456773分子式MYB1.2-1和MrMYB2-1不能诱导花青苷积累。MrMYB1.3-1在烟草中稳定转化使烟草的花和果皮花青苷含量显著升高。烟草双荧光素酶、酵母单杂交和凝胶电Alisertib核磁泳迁移试验表明,MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以直接结合并激活花青苷生物合成基因的启动子,而MrMYB1.1~d、MrMYB1.2-1和MrMYB2-1不能直接结合并激活花青苷生物合成基因的启动子。萤火虫comprehensive medication management荧光素酶互补成像和酵母双杂交试验表明,MrMYB1.1~n、MrMYB1.3-1和MrMYB2-1可以与MrbHLH1发生相互作用,而MrMYB1.1~d和MrMYB1.2-1不能与MrbHLH1发生相互作用。3.对杨梅GST基因家族进行分析,筛选到一个参与花青苷转运的候选基因MrGST1。MrGST1的表达量与‘荸荠’品种不同组织、不同发育阶段的果实和12个杨梅品种成熟果实中的花青苷含量呈显著正相关。对MrGST1进行拟南芥tt19突变体功能互补试验,发现MrGST1只负责花青苷的转运,而不负责原花青素的转运。烟草双荧光素酶和酵母单杂交试验表明,MrMYB1.1~n和MrMYB1.3-1可以直接结合并激活MrGST1启动子。顺式元件分析显示,MrGST1启动子有8个MYB结合位点。烟草双荧光素酶和酵母单杂交试验表明,MrMYB1.1~n通过识别起始密码子前第4个MYB结合位点激活MrGST1启动子。综上所述,本文系统探究了MrMYB1/2基因簇中4个成员的基因结构、表达特性、功能和调控机制差异,鉴定了调控杨梅果实花青苷积累的激活因子MrMYB1.1~n和MrMYB1.3。探明了杨梅品种间果实颜色差异是由于MrMYB1.1~n/MrMYB1.1~d基因型不同以及MrMYB1.3在特定品种表达所致。同时挖掘了参与杨梅果实花青苷转运的MrGST1并进行了功能鉴别。研究结果为花青苷生物合成和转运的调控机制提供新的理解,也为果实色泽品质的改良提供理论依据。