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食源性耐药菌的污染是目前食品安全面临的问题之一。研究细菌尤其是耐药菌的抑菌机理,挖掘有效的抑菌靶点,对于高效抑制有害微生物的生长,防控细菌污染具有重要意义。电子传递链是细菌的固有属性,而核黄素在大肠杆菌中作为一种内源性电子穿梭体,在其生Ferrostatin-1价格长过程中具有关键作用。本文采用电化学手段表征了在不同环境下大肠杆菌核黄素代谢的变化,结合转录组学测序技术,从基因表达调控的层面探究核黄素代谢相关途径的关键调控基因,拟为探寻新型抑制靶标和机理提供思路。具体结果如下:(1)探究了氧气、渗透压、pH及温度对大肠杆菌核黄素代谢的影响,dryness and biodiversity通过计算单位密度菌体的核黄素代谢量来表征菌株的核黄素代谢活性。主要结果如下:有氧CCRG 81045细胞培养条件下核黄素代谢量较大,生长代谢较旺盛;核黄素代谢对于渗透压的胁迫可能没有响应调控机制;在pH=3、11和55℃这类极端条件下菌株无法维持正常活性,整体代谢水平低;在pH=9和45℃条件下,核黄素分泌高于正常水平,表明细菌在这些条件下可能通过增强核黄素的代谢调节电子传递活性以达到胁迫条件下的应激调控作用。(2)通过转录组筛选调控核黄素代谢的关键基因。采用转录测序技术分析了大肠杆菌在45℃和pH=9处理下的基因表达情况,对差异表达基因进行了功能注释和生物信息学分析,发现45℃下ribA、ribD、ribE、rpiA显著上调,pH=9下sdhA、sdhC、sdhD显著性上调,这些基因编码的产物关系到辅因子辅酶的结合、生物碳骨架合成、能量代谢等关键生命过程。这些基因在应对相应的环境胁迫时可能起到了重要的调控作用,具有成为抑菌靶点的潜力。(3)通过Red重组法构建了核黄素代谢缺陷型的菌株,缺陷株需要外源补充核黄素才能生长,且当培养基中核黄素的浓度小于250 μM时会影响缺陷株进入指数期的时间,核黄素浓度越低大肠杆菌进入指数期越慢。表明核黄素在大肠杆菌的生长中作为一种生长因子存在,核黄素生物合成途径中的ribA是一种具有潜力的抑菌靶点。

目的:探讨电针通过调节褪黑素-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体(NLRP3)轴介导的细胞焦亡减轻脑缺血再灌注大鼠脑缺血BMS-907351试剂损伤的机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组12只及手术组36只，手术组大鼠采用大脑中动脉栓塞法制备局灶性脑缺血-再灌注损伤模型。大鼠造模成功后进一步分为模型组、电针组和电针+Luz组，每组12只。电针组和电针+Luz组电针“百会”“神庭”,每次20 min,电针+Luz组腹腔注射褪黑素受体拮抗剂luzindole(30 mg/kg),以上干预均1次/d,干预7 d。采用Zea Longa法评估各组大鼠神经功能缺损情况，ELISA法检测各组大鼠12:00及24:00血清褪黑素含量，小动物MRI评估CNS infection各组大鼠脑梗死体积百分比，TUNEL法检测各组大鼠梗死侧大脑皮质区神经细胞凋亡水平，免疫荧光技术检测各组大鼠大脑皮质小胶质细胞活化情况，Western blot法检测各组大鼠大脑皮质细胞焦亡相关蛋白NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-1、白细胞介素(IL)-1β表达水平。结果:与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01),24:00褪黑素含量显著降低(P<0.01),脑梗死体积百分比、神经细胞凋亡率显著升高(Nirogacestat分子量P<0.01),小胶质细胞明显活化，细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达显著升高(P<0.01)。与模型组和电针+Luz组比较，电针组神经功能评分显著降低(P<0.05),24:00褪黑素含量显著升高(P<0.01,P<0.05),脑梗死体积百分比、神经细胞凋亡率显著降低(P<0.01,P<0.05),小胶质细胞活化水平降低，细胞焦亡相关蛋白NLRP3、 Caspase-1、IL-1β表达显著降低(P<0.01)。结论:电针“百会”“神庭”可减轻脑缺血再灌注模型大鼠神经功能损伤，其机制可能与调控内源性褪黑素表达、抑制细胞焦亡减轻脑缺血再灌注大鼠脑缺血损伤有关。

目的：构建CRISPR/Cas9介导下泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system,UPS）-E3泛素连接酶（atrophin 1interacting protein 4,ITCHparallel medical record）基因敲除细胞株。方法：在人ITCH基因的selleck CL13900PAS结构域内设计3个sgRNA，构建3个分别同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒。经测序序列正确的重组质粒用lipofectamine 3000转染HeLa细Roxadustat胞，24h后荧光倒置显微镜观察转染情况。结果：3个ITCHsgRNA寡核苷酸单链成功退火成为双链，经测序发现，设计的3个ITCH-sgRNA全部重组到了CRISPR/Cas9载体上。荧光检测发现在同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒转染的HeLa细胞内有绿色荧光。结论：成功构建了同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒，并将三合一重组质粒成功转入细胞中，为实现在HeLa细胞中完全敲除ITCH基因，从而为构建ITCH基因敲除稳定株奠定了基础。

目的 探讨不同剂量奥氮平对精神分裂症患者心电图及心肌酶的影响。方法 本研究选择2021年2月～2022年8月86例精神分裂症患者为观察对象，根据奥氮平服药剂量设为低剂量组（≤10mg/d）以及高剂量组（> 10mg/d），分别为48例、38Entinostat价格例，比较治疗期间窦性心动过速、ST段改变等异常心电图发生情况以及治疗前后血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）以及肌酸激酶同工酶（CK-MB）等心肌酶水平。结果 高剂量组窦性心动过速、ST段改变、窦性心律不齐、T波改变等异常心电图发生率显著高于低剂量组（P<0.05），两组窦性心动过缓、Q-T间期延长等发生率差异无CP-690550核磁统计学意义（P>0.05Aquatic microbiology）；两组治疗后血清CK、LDH、CK-MB水平均显著升高，且治疗后高剂量组显著高于低剂量组（P<0.05）。结论 奥氮平治疗精神分裂症均会造成一定的心脏副作用，但高剂量奥氮平引起的心电图的异常以及心肌酶水平升高情况更显著。

为了揭示茶树菇多糖(AAP)在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响，本试验以RAW264.7为研究对象，将其分为空白对照(CON)组、AAP低剂量(AAPL)组、AAP中剂量(AAPM)组、AAP高剂量(ALEE011分子量APH)组和脂多糖(LPS)组，采用噻唑蓝(MTT)比色法检测AAP对巨噬细胞RAW264.7的安全浓度；流式细胞仪检测巨噬细胞RAW264.7表面协同刺激分子抗原分化簇80(CD80)和86(CD86)的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的浓度。结果显示，AAP浓度低于250μg/mL,不会对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生毒性作用；与CON组相比，AAPM组和AAPH组RAW264.7细胞的表面分子CD80及所有AAP组RAW264.7细胞的表面分子CD86均极显著升高(P<0.01或P<0.001);AAPH组IL-1β及AAPM组和AAPH组IL-6、TNF-α和Nselleck HPLCO表达水平均显著增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结果表明，AAP能提高小鼠巨噬细胞RAW264.7表面分子CD80和CD86表达水平及细胞因子IL-1β、IL-6、Ttherapeutic mediationsNF-α和NO的分泌能力。

Mannich反应是一类著名的三组分反应,广泛地应用于药物化学,天然产物全合成,材料科学等领域。经典的Mannich反应是由活泼的碳亲核试剂(包括醛,酮,吲哚等富电子芳香环)、醛和胺参与的烷基胺化反应,能快速地引入结构多样性。然而,nonviral hepatitis非活化烷基参与的Mannich反应至今仍是一个巨大的挑战。在丹参酮IIA的药物发现研究中,意外发现了一类新颖的Mannich反应,首次实现非活化C(sp~3)-H参与Mannich反应。在探究并阐明该反应历程的基础上,开发了富电子3-甲基苯并呋喃类似物、醛、胺参与的双Mannich反应,构建了结构新颖的苯并呋喃并哌啶骨架。通过进一步机理研究,我们提出了可能的机理。鉴于苯并呋喃并哌啶是咔啉等药物优势骨架的电子等排体,我们将该新型Mannich反应应用于药物研发中。以HDAC抑制剂为例,我们设计合成了苯并呋喃并哌啶母核的HDAC抑制剂,其优选化合物有较好的HDAC抑制活性,且在肝癌体外和体内评价中展现了良好的药效,具有良好的药代动力学特性。此外,本论文还开发了一类酰胺(或磺酰胺)与笑气在无外加氧化剂条件下的环化反应,构建了1,2,JQ1体内3-苯并三嗪-4-酮母核杂环骨架。第一部分:新型多组分双Mannich反应研究。以富电子3-烷基苯并呋喃、甲醛和伯胺为底物,通过多轮的反应条件优化,我们发现在醋酸中反应能以高收率合成苯并呋喃并哌啶骨架,且该反应底物普适性广。通过控制实验、氘代标记实验和DFT计算,阐明了新型双Mannich反应独特、新颖的反应机理,揭示了非活化烷基的活化过程。该工作为Mannich反应的拓展及应用提供了新的方法和可能性。第二部分:新型HDAC抑制剂的设计、合成及活性评价。在第一部分的工作基础上,我们发现苯并呋喃并哌啶骨架是HDAC抑制剂Pselleck合成anobinostat和Abexinostat母核的电子等排体。并且该多组分Mannich合成方法可以在HDAC抑制剂的linker设计中引入更丰富的结构多样性,特别是能快速引入各种手性侧链,这能为药物设计带来新的结构,新的发现。以此策略,我们设计、合成了29个全新结构的含有苯并呋喃并哌啶结构的HDAC抑制剂,并开展活性评价。其中,优选化合物3-19k具有高效的HDAC1抑制活性(IC_(50)=3.1 n M),并且在人肝癌细胞系Bel7402、Hep G2和Huh-7上表现出高效的增殖抑制活性(IC_(50)=30-240n M)。机制研究中发现3-19k可以提高细胞内组蛋白H3和α-Tubulin的乙酰化水平,诱导细胞凋亡和自噬,从而发挥抗肿瘤药效。在肝癌小鼠异种移植瘤模型上,3-19k采用灌胃给药方式(20 mg/kg,QOD),体内药效优于索拉菲尼(100 mg/kg,QD)和HDAC抑制剂SAHA(100 mg/kg,QD)的抑瘤活性。该工作为肝癌药物的研发和设计体提供了新策略。第三部分:酰胺(或磺酰胺)与笑气的[4+2]环化反应研究。采用酰胺(或磺酰胺)的金属导向作用,我们发展了s-Bu Li促进的苯甲酰胺(或苯磺酰胺)与笑气的[4+2]环化反应,合成1,2,3-苯并三嗪-4-酮母核结构,该反应过程无需外加氧化剂。该工作为1,2,3-苯并三嗪-4-酮母核的合成提供了全新的方法。

褐藻胶是海洋中最丰富的植物海藻的主要组成成分之一。褐藻胶可以通过化学法、物理法和生物酶法转化为褐藻寡糖,但只有生物酶法生产的褐藻寡糖生物活性最好。因此,开发高效降解褐藻胶生产褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶具有研究意义。本研究通过序列比对与结构分析对来自于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.Alg6B)的褐藻胶裂解酶基因Alg2944进行定点突变并获得比酶活和热稳定性提高的突变体。通过分子动力学模拟对突变体和野生型进行结构与性质分析,解释比酶活和热稳定性提高提高机制。将最优突变体通过信号肽筛选成功在枯草芽孢杆菌中分泌表达。工作的主要内容如下:(1Cloning and Expression Vectors)重组菌株E.coli BL21(DE3)-p ColdⅡ-Alg2944诱导产酶条件优化。结果表明:诱导前的预培养时间5 h左右;诱导剂IPTG在培养基中最适终浓度1.0 mmol·L~(-1);最适钙化合物CaCl_2,最适CaCl_2浓度10 mmol·L~(-1);诱导时间12 h。(2)突变株筛选及酶学性质表征。利用序列比对与结构分析对褐藻胶裂解酶Alg2944定点突变并获得比酶活较高突变体N145D、A195F、A195I、A195L和F246Y,比酶活分别为8PF-6463922生产商559.2 U·mg~(-1)、12938.3 U·mg~(-1)、9753.3 U·mg~(-1)、12854.2 U·mg~(-1)和8291.7U·mg~(-1),较野生型分别提高了21.9%、84.2%、38.9%、83.0%以及18.1%;野生型和突变体N145D、A195F和F246Y最适反应温度为40℃,突变体A195L和A195I的最适反应温度为45℃,突变体A195L和A195I在35℃与40℃下热稳优于野生型;最适p H 8.0,在p H 7.0～8.0之间p H稳定性较强;Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)对酶活有明显激活作用,Ag~+、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶活有明显抑制作用,金属离子螯合剂EDTA明显抑制Alg2944活性。(3)分子动力学模拟。A195L在突变位点附近均方根波动(Root Mean Square Fluctuation,RMSF)低于野生型Alg2944,解释了A195L热稳优于野生型的原因;结合自由能计算发现A195L(-59.9 kcal·mol~(-1))高于Alg2944(-33.7 kcal·mol~(-1)),解释了在K_m方面A195L(2.137 mg·m L~(-1))低于Alg2944(4.122 mg·m L~(-1))的原因;溶剂可及表面积(Solvent Accessible Surface Area,SASA)计算发现A195L(180.34 nm~2)低于Alg2944(193.92 nm~2),说明Leu195为催化中心入口提供了疏水袋。总之,通过A195L与野生型分子动力学分析证明了位于催化口袋入口环区的刚性与疏水性对其催化活力很重要。(4)A195L在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中表达和酶解产物分析。通过信号肽筛选,该酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的最适信号肽为Npr B,在37℃下摇瓶发酵24 h发酵液上清酶活达1237.4 U·m L~(-1);酶解条件优化得出最适底物浓度10 mg·m L~(-1),在500μL的反R428小鼠应体系中最适酶添加量为240 U。薄层层析法(TLC)对酶解产物分析得产物为单糖、二糖以及三糖,其中单糖和二糖为最终产物。

淋巴管系统调节组织液内稳VP-16态、脂质代谢、免疫功能，在体内发挥着重要作用。心肌梗死后，增强淋巴管生成可加快清除浸润的免疫细胞，减少促炎细胞因子的生成，减少水肿、炎症和纤维化，促进受损心脏功能恢复。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-C及血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)-3是淋巴管生成通路的组成部分，在心脏损伤后Disease transmission infectious维持组织液平衡和心肌功能方面具有至关重要的作用。淋巴管与免疫系统之STM2457分子式间密切相关，不同的免疫细胞群对淋巴重塑产生刺激或抑制作用。巨噬细胞是广泛分布在器官和组织中的先天免疫细胞，在器官发育、宿主防御、急性和慢性炎症、组织稳态和重塑等多种生理和病理过程中发挥着重要作用。还需要确定淋巴管生成的更多机制，为临床刺激淋巴管生成治疗心脏疾病提供有效的靶点。本文综述了心肌梗死后心脏及淋巴管基本的病理变化、淋巴管生成的调控因素以及巨噬细胞对淋巴管生成的影响。

半胱天冬氨酸酶（Barometer-based biosensorscaspase）在哺乳动物中参与调控细胞凋亡过程，控制着多种疾病的发生发展。本研究利用基因敲除和寻找更多回补的方法，获得了禾谷镰孢中半胱天冬氨酸酶基因FgCas4的敲除突变体ΔFg Cas4和回补体ΔFg Cas4-C。通过观察分析发现，基因FgCas4的缺失并不影响禾谷镰孢的生长速率、菌落形态、分生孢子产量、致病和产毒。但是，敲除突变体ΔFgCas4的菌丝分支变多且具有3个隔膜的分生孢子比例较野生型和回补体增加了8.7%。对外界环境胁迫因子耐受性测定显示，ΔFgCas4对杀菌selleck合成剂和金属离子的敏感性显著增加，同时其细胞内脂滴含量增多，对渗透胁迫因子抗性变强。亚细胞定位发现，半胱天冬氨酸酶FgCas4定位于液泡中。此外，基因FgCas4的缺失导致禾谷镰孢细胞自噬过程明显提前。上述研究结果表明，禾谷镰孢中半胱天冬氨酸酶FgCas4主要在菌体无性繁殖、对不同环境胁迫的应答以及细胞自噬过程中发挥重要作用。

目的：探讨长链非编码RNA (lncRNA) GPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用，并阐明其作用机制。方法：选取对数生长期C2C12细胞，检测0、25、50、75、 100Bemcentinib体内实验剂量、 200和400 mg·L~(-1)地塞米松诱导24、48和72 h后C2C12细胞存活率，筛选肌萎缩模型诱导的最佳作用剂量和时间。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测C2C12细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平以验证细胞模型。将C2C12细胞分为正常组、模型组、lncRNA GRPC5DAS1-NC组和lncRNA GRPC5D-AS1-OE组，RT-qPCR法检测各组细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平，流式细胞术检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化酶4 (GPX4)、铁离子（Fe2+）和丙二醛（MDA）水平，透射电镜观察各组细胞线粒体超微结构表现，免疫荧光法检测各组细胞中成肌分化蛋白（MyoD）表达情况，Western blotting法检测各组细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。结果：100 mg·L~(-1)地塞米松诱导48 h时造模效果最佳。与正常C2C12细胞比较，100 mg·L~(-1)地塞米松诱导48 h后C2C12细胞中lncRNA GPRC5DAS1表达水平降低（P<0.05），证实lncRNA GPRC5D-AS1在肌萎缩模型中有调控作用。RT-qPCR法检测，与正常组比较，模型组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平降低（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平升高（P<0.05）。流式细胞术检测，与正常组比较，模型组细胞中ROS水平升高（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ROS水平降低（P<0.05）。ELISA法检测，与正常组比较，模型组细胞中Fe2+和MDA水平升高（P<0.05）,GPX4水平降低（P<0.05）；与模型Transjugular liver biopsy组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中Fe2+和MDA水平降低（P<0.05）,GPX4水平升高（P<0.05）。透射电镜观察，正常组细胞外形圆整，大小正常，膜上绒毛丰富，线粒体细胞器形态正常；模型组细胞中线粒体数量减少，胞浆颗粒化，线粒体结构模糊肿胀并出现典型铁死亡相关现象；lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中线粒体数增加，胞浆颗粒化现象减少，线粒体结构较清selleck晰。免疫荧光法检测，与正常组比较，模型组细胞中MyoD表达减少，细胞发生肌萎缩；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中MyoD表达明显增加，细胞肌萎缩现象缓解，成肌细胞再生较多。Western blotting法检测，与正常组比较，模型组细胞中长链脂酰辅酶A合成酶（ACSL） 4蛋白表达水平升高（P<0.05），溶质载体家族7成员11 (SLC7A11)和GPX4蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较，lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ACSL4蛋白表达水平降低（P<0.05）,SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论：lncRNA GPRC5DAS1地塞米松诱导的成肌细胞铁死亡起到保护作用，可促进细胞修复再生，其作用机制与调控SLC7A11/GPX4/ACSL4信号通路有关。